资料介绍
中华人民共和国认证认可行业标准
RB/T 228—2023代替 RB/T 151—2016
食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南
2024-05-20发布 2024-07-01实施
前言
本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替 RB/T 151—2016《食品 微生 物定 量检 测的 测量 不确 定度 评估 指南》, 与 RB/T 151— 2016相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :
a) 增加了与测量不确定度评估有关的术语、定义和符号 ;
b) 更改了测量不确定度的评估方案 ,使用技术不确定度、基质不确定度、分布不确定度来评估测量不确定度。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本文件起草单位 :青岛海关技术中心、湖南省产商品质量检验研究院、临沂大学、中国合格评定国家认可中心、大连海关技术中心、中国检验检疫科学研究院粤港澳大湾区研究院、北京鑫汇迈科生物科技有限公司、深圳海关食品检验检疫技术中心、达能特殊营养品(青岛)有限公司、青岛疾病预防控制中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、丹东海关综合技术服务中心、广州海关技术中心、厦门海关技术中心、庄河市检验检测认证技术服务中心、沈阳海关技术中心、中国疾病预防控制中心、中国计量科学研究院、中国检验检疫科学研究院、上海市质量监督检验技术研究院、中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本文件主要起草人 :雷质文、钟文涛、王曼霞、王云帆、王秋艳、高元娇、武维伟、姜勇、马弋、麻丽丹、何飞、丁小平、李宏、凌莉、彭小 莉、李金 霞、马维 兴、杨滔、朱金 艳、吕敬 章、刘云 国、卢行 安、王金 玲、傅博强、杨娇兰、陈欣欣。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :
— 2016年首次发布为 RB/T 151—2016;
— 本次为第一次修订。
食品微生物定量检测的
测量不确定度评估指南
1 范围
本文件描述了食品微生物定量检测的测量不确定度的评估和表示方法。
本文件适用于食品和食品原料 , 以及食品生产、加工、贮存相关环境样品中微生物定量分析方法的测量不确定度评估和表示。其他领域可参考使用。
注 : 定量分析方法包括微生物常规平板计数法、最可能数(mostprobable number, MPN)法、仪器测定方法[如阻抗测量法、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)测量法和流式细胞计数法]。
本文件不适用于评估食品微生物定量检测系统误差及其修正有关的不确定度分量。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 , 注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789. 2 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
3 术语和定义、符号
3. 1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
样本 sample
按照某种规则从总体(或大量材料)中抽取的、可以代表总体信息的单个或多个个体(或一定比例的
材料) ,在一定情况下可以作为判定该总体或其生产过程情况的依据。
实验室样品 laboratory sample
送往实验室待检测的样本(3. 1. 1)。
测试样品 testsample
依照方法标准要求 ,利用实验室样品(3. 1. 2)制备的样品。
测试部分 testportion
从测试样品(3. 1. 3) 中 ,称取或吸取一定量(质量或体积)具有代表性的部分 ,用以制备起始稀释样
品匀液。
注 : 液体样品可以选择一定量具有代表性的原液作为测试部分。
被测量 measurand
拟测量的量。
[来源 :JJF 1001—2011,4. 7]
偏差 bias
测量偏差 measurementbias
测量结果的期望值与真值或可接受的参考值之间的差异 ,系统误差的估计值。注 1: 与随机误差相反 ,偏差是指系统误差的综合 ,其可能是由一个或多个系统误差引起。
注 2: 测量结果与真值或接受参考值之差越大 ,偏差值越大。
注 3: 系统误差是指在重复测量中保持不变或按可预见方式变化的测量误差的分量。
注 4: 随机误差是指在重复测量中按不可预见方式变化的测量误差的分量。
[来源 :GB/T 3358. 1—2009,1. 33,有修改] 3. 1.7
标准偏差 standard deviation
对同一被测量(3. 1. 5)进行 n 次测量 ,表征测量结果分散性的量。
注 1: n 次测量中某单个测得值为 xi 的试验标准偏差 SD可按照贝塞尔公式计算 :
式中 :
xi — 第 i次测量的测得值 ;
n — 测量次数 ;
x —n 次测量所得一组测得值的算术平均值。
注 2: n 次测量的算术平均值 x的标准偏差 S(x) 为 S(x) =S(xi)/ n。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 17,有修改]
测量重复性 measurementrepeatability
在同一实验室 , 由同一操作员使用同一设备 ,按相同的测试方法 ,在较短时间间隔内对同一对象进行测试所获得的测试结果之间的一致性。
[来源 :JJF 1001-2011,5. 13,有修改]
实验室内再现性 intralaboratory reproducibility
中间精密度 intermediateprecision
在同一实验室 , 由不同操作员使用不同设备 ,按相同的测试方法 ,对同一或类似测试样品(3. 1. 3)进
行测试所获得的测试结果之间的一致性。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 12,有修改]
测量不确定度 measurementuncertainty;MU
与测量结果相关联的参数 ,用来表征合理赋予被测量(3. 1. 5)值的分散性。注 1: 此参数可以是标准偏差或其倍数 ,也可以是给定置信概率的置信区间的半宽度。
注 2: 测量不确定度一般由多个分量组成 ,其中一些分量可以用测量结果的统计分布来进行测算 ,并且以试 验标 准
偏差表示 ;而另一些分量可以根据经验或其他信息的假定概率分布来进行测算 ,并且也以标准偏差表示。
注 3: 测量结果为被测量值的最佳估计。所有不确定度的分量都与分散性有关。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 18,有修改]
标准不确定度 standard uncertainty
以标准偏差表示的测量不确定度。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 19]
技术不确定度 technicaluncertainty
在食品微生物定量检测程序中 , 因技术操作的可变性引起的不确定度。
注 : 在制备起始稀释样品 匀液 和后 续稀 释样 品匀 液时 , 技术 不确 定度 包括 从实 验室 样品 (3. 1. 2)选取 测试 部分
(3. 1. 4)时的取样、混匀和稀释的可变性 , 以及培养过程和培养基变化等因素的影响。
基质不确定度 matrix uncertainty
测试部分(3. 1. 4)不能真实代表实验室样品(3. 1. 2)而产生的不确定度。
分布不确定度 distributionaluncertainty
微生物在实验室样品(3. 1. 2)、起始 稀释 样品 匀液 和随 后的 梯度 稀释 过程 中分 布不 均产 生的 不确定度。
注 : 基于微生物在样品匀液中的特性 ,通常采用泊松分布模型。但是 , 当部分结果需要进一步确认 ,或者使用 MPN法时 ,其分布可能不符合泊松分布。
泊松不确定度 Poisson uncertainty
对于平板计数法 ,假设微生物在接种液中随机分布符合泊松分布模型而产生的不确定度。
确证不确定度 confirmation uncertainty
对于部分平板计数法 ,需要使用确证试验对假定的目标菌总数进行修正。假设菌落为均匀分布 ,使用二项分布来计算某一特定结果而产生的不确定度。
最可能数不确定度 mostprobablenumberuncertainty
基于多次检出或未检出结果组合的最大似然估计得到最可能数(MPN)而产生的不确定度。
合成标准不确定度 combined standard uncertainty
由在一个测量模型中各输入量的标准测量不确定度获得的输出量的标准测量不确定度。注 : 3. 1. 12~ 3. 1. 17均属于标准测量不确定度。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 22]
包含因子 coverage factor
为获得扩展不确定度 ,对合成标准不确定度所乘的大于 1 的数。
注 : 包含因子通常用符号 k表示。
[来源 :JJF 1001—2011,5. 30]
扩展不确定度 expanded uncertainty
确定测量结果区间的量 ,使被测量(3. 1. 5)的结果分布的大部分包含在此区间内。
注 1: 此区间也被称为包含概率或区间的置信水平(置信概率)。
注 2: 扩展不确定度有一个明确的扩展区间 ,使一个特定的置信概率与扩展不确定度所规定的区间结合起来。对测
量结果及其合成标准不确定度所表示的概率分布进行明确或隐含假设 ,这个区间的置信概率只有在这些假设验证成立的范围内有效。
注 3: 扩展不确定度 U 是由合成标准不确定度 uc(y)和包含因子 k计算得出的 :U=k×uc(y)。 [来源 :JJF 1001—2011,5. 27,有修改]
3.2 符号
下列符号适用于本文件。
∑C:对于菌落计数方法 ,用于计算结果的所读取的菌落数量总和。
k:包含因子。
nc :对于需要部分确证的菌落计数方法 ,nc 为实际确证菌落数。
np :对于需要部分确证的菌落计数方法 ,np 为所测试的疑似菌落数。
SD:标准偏差。
SIR :实验室内再现性或中间精密度标准偏差。
SR :再现性标准偏差。
Sr :重复性标准偏差。
U:扩展不确定度。
u:标准不确定度。
udistrib :分布不确定度。
utech :技术不确定度。
uconf:确证不确定度。
umatrix :基质不确定度。
uMPN :最可能数不确定度。
uPoisson :泊松不确定度。
uc (y) :合成标准不确定度。
4 总则
4. 1 不确定度分量
测量不确定度通常包含多个分量。本文件考虑以下三种不同类型的不确定度分量 :
a) 技术不确定度 utech (第 5 章) ;
b) 基质不确定度 umatrix (第 6章) ;
c) 分布不确定度 udistrib (第 7章)。
注 1: 食品微生物定量检测通过关键技术因素的优化和控制得到最佳估计值。 因标准值或参考量值一般不适用 ,故不考虑系统误差的评估和修正。
注 2: 对每一类型的分布不确定度均可基于数学方法进行计算。
注 3: 以上三个不确定度分量中 ,技术不确定度通常是最大的。
4.2 合成标准不确定度
本文件提供了两种方法来评估检测结果的合成标准不确定度 :
a) 分别计算报告值的技术不确定度分量(第 5 章)、基质不确定度分量(第 6 章)和分布不确定度分量(第 7章) ,然后将三种分量合成(第 8章)。
b) 根据实验室规定以及客户要求 ,可仅使用技术不确定度代替合成标准不确定度报告结果。
5 技术不确定度
5. 1 不确定度主要来源的识别
5. 1. 1 关键技术因素
与平板计数法或最可能数(MPN)法技术不确定度相关的关键操作环节包括 :
a) 从实验室(或测试)样品中称取或吸取测试部分 ;
b) 制备起始稀释样品匀液 ;
c) 连续梯度稀释 ;
d) 接种 ;
e) 培养 ;
f) 菌落计数过程和/或生长状况(如 MPN 法) ;
g) 确证(适用时)。
图 1列出了食品微生物学定量检测的测量不确定度的主要来源。可能影响不确定度且宜加以控制的关键技术因素 ,具体包括培养基和/或试剂的来源和类型、样品稀释、接种和培养过程、计数方法(人工计数或自动计数)以及不同操作人员(操作团队)的变化等。
图 1 食品微生物学定量检测的测量不确定度的主要来源
5. 1.2 抽样不确定度
抽样不确定度 , 即从一批待抽检样品中抽取实验室样品(3. 1. 2)产生的误差 , 可能会对总体误差产生显著影响 ,但它不是测量不确定度本身的一部分 ,本文件不予以考虑。
5.2 技术不确定度的评估
5.2. 1 概述
技术不确定度仅仅由操作的可变性引起 ,是某一检测方法(如 ISO 4833-1、GB 4789. 2、GB 4789. 10等)的固有变异特征 ,一种检测方法的技术不确定度计算结果不适用于另一种检测方法。
注 : 在实验室关键环节受控且不发生变化的情况下 , 同一检测方法的技术不确定度可认为是固有不变的 , 与食品基质类型无关。宜选择易于均质的食品基质类型 ,并且污染水平满足 5. 2. 2. 3. 1 的实验室样品 ,如奶粉、果汁等。
使用最终测量结果的再现性标准偏差(SR)计算技术不确定度 , 即在再现性条件下 ,通过计算至少10组同一类食品基质样品的最终检测结果(详见表 1、表 2 或表 A. 1)以评估技术不确定度(5. 2. 2. 3) ,而不需要对测量过程中每个独立步骤产生的不确定度进行逐一计算。持续进行测量不确定度评估十分重要 ,表明测试结果在受控范围内。 当任何可能会显著影响结果的关键技术因素(5. 1. 1)发生变更时 ,需重新评估技术不确定度。
再现性标准偏差的计算均基于对同类样品的重复检测 ,一般有三种方案 ,优先顺序为 :
a) 第一方案 :实验室内再现性 , 即某一实验室内评估的再现性 ;
b) 第二方案 :实验室间方法确认结果的再现性 ;
c) 第三方案 :实验室间能力验证结果的再现性。
本文件仅对第一方案进行了规定(5. 2. 2)。 实验室可参考 GB/T 22553,评估第二方案和第三方案的技术不确定度。
5.2.2 实验室内的再现性标准偏差(SIR)
5.2.2. 1 概述
使用实验室内再现性标准偏差评估技术不确定度。本条款中描述的实验方案充分考虑 5. 1. 1 所列举的关键技术因素。
5.2.2.2 实验方案
5.2.2.2. 1 概述
图 2 为从每份实验室样品中称取或吸取 2 个测试部分进行分析的实验方案 , 相应的 计算 方法 见
5. 2. 2. 3。对实验室样品取多于两个测试部分的实验方案和计算方法详见附录 A。
任意一种检测方法 ,至少需要对 10个实验室样品进行检测 ,每个实验室样品至少得到 2 个可接受的结果 ,5. 2. 2. 3. 1规定了结果的可接受条件 ,具体操作流程详见图 2。所收集数据可以来自实验室的特定实验方案 ,也可以通过实验室日常质量控制累积 ;如为后者 ,参照本条款实验方案执行。
注 : 如果实验室难以按照图 2 中方案(1)进行测试样品前处理 ,可用图 2 中方案(2)替代。
图 2 每份实验室样品取 2 个测试部分的技术不确定度评估实验方案
5.2.2.2.2 实验室样品的选择
设计室内再现性试验时 ,建议根据 SN/T 3266—2012中附录 A所规定的相同或同类食品基质样品进行试验 ,避免或降低基质间差异过大造成的影响。
实验室样品宜优先选用自然污染食品样品 , 以便得出真实的测量不确定度 ,更好地表征自然污染样品的测量结果。如果需要人工 染菌 , 污染 水平 宜贴 近自 然水 平 , 微生 物含 量满 足 5. 2. 2. 3. 1 可接 受的结果。
5.2.2.2.3 实验室样品的制备
为尽可能降低基质不确定度的影响 ,实验室样品需通过合适的方法进行均质。在称取或吸取测试部分之前 ,实验室需充分混匀各类测试样品(6. 1)。
5.2.2.2.4 测试部分
从每份实验室样品(或测试样品)中至少称取或吸取 2个测试部分进行再现性平行测试。
5.2.2.2.5 样品起始稀释匀液、人工染菌(需要时)和分析条件
需要人工染 菌时 , 宜在 起始 稀释 样品 匀液 中进 行。 人工 染菌 样品 制备 的具 体操 作步 骤参 考RB/T 037。
按相关检测方法的常规检验流程 ,对每个测试部分进行分析(例如制备 10倍梯度系列稀释液 ,每个稀释倍数接种 1个或 2个平板)。为了最大化体现再现性平行测试间的差异 ,并体现实验室实际测试的真实情况 ,对 2个测试部分进行测试的条件 A 和条件 B尽可能不同 ,并尽可能涵盖实验室常见的所有技术不确定度来源(5. 1. 1) ,这些来源包括但不限于 :
a) 不同批次的培养基、试剂和滤膜 ;
注 : 例如测试部分 1 由实验人员 A用批号为 B 的培养基完成检验 ,那么测试部分 2 由实验人员 B使用批号为 A 的培养基完成检验。
b) 不同人员 ;
c) 不同设备(例如涡旋混匀器、均质器、pH计、培养箱等) ;
d) 不同分析时间等。
如果食品中微生物污染水平不稳定 ,宜在同一天内快速完成再现性平行测试 ;如果食品中微生物污染水平相对稳定(如自然污染干燥样品或人工污染样品) ,再现性平行测试可以超过 1 天。
5.2.2.3 计算
5.2.2.3. 1 可接受的结果
对于平板计数法(如 GB 4789. 2) ,需保证有足够多的菌落数用于计算 ,至少有 1 个稀释度的菌落数在 30 CFU/平板 ~ 300 CFU/平板之间。
注 : 其他检测方法明确规定了可接受的菌落计数范围时 ,按规定执行。
对于包含部分确证的方法(如 GB 4789. 10、GB 4789. 41) , 至少二分之一的疑似菌被确证为目标菌的结果为可接受结果 , 即 nc≥np/2(符号见 3. 2)时为可接受结果 ,而 nc
对基于 MPN 的方法 ,3个稀释度 15管法时每个独立样品的结果 ,用于计算结果的阳性管数合计大于 5个阳性结果时为可接受结果 ;3个稀释度 9管法时每个独立样品的结果 ,用于计算结果的阳性管数合计大于 3个阳性结果时为可接受结果。
注 1: 3个稀释度 15管法后文简称“15管法 ”,3个稀释度 9 管法后文简称“9 管法 ”。
注 2: 3 管或 5 管阳性检测结果的限值与单次检测结果中所有被测稀释液的阳性结果之和有关 , 与阴性结果数或总测试结果数无关。
5.2.2.3.2 实验室内再现性标准偏差
满足实验方案(5. 2. 2. 2)时 ,n(n≥10)个实验室样品 ,每个实验室样品得到 2 个可接受的试验数据xiA 和 xiB。在计算之前 ,对 xiA 和 xiB进行常用对数转换后得到 yiA 和 yiB ,然后用公式(1)计算实验室内再现性标准偏差 SIR。如果每个实验室样品得到 2个以上可接受的试验数据 ,参照附录 A 的计算方法。
为确保精确 ,计算过程中不宜进行数值修约。
SIR — 实验室内再现性标准偏差 ;
n — 实验室样品的数量 ;
i — 样品序号 ,i= 1~n(n≥10) ;
yiB — 在条件 B下得出的数值 ,单位为 log10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)。
表 1 为按照某检测方法(如 ISO 4833-1和 ISO 7218) ,每个测试部分进行梯度稀释 ,选择 2 个适宜稀释度 ,每个稀释度接种 1个琼脂平板 ,计算实验室内再现性标准偏差的示例。
表 1 实验室内再现性标准偏差计算
表 1 实验室内再现性标准偏差计算 (续)
表 2 为按照 GB 4789. 2,对 10个市售散装奶粉样品均质后称取 2 个测试部 分 , 在条 件 A 和条 件B下每个测试部分进行 10倍梯度系列稀释 ,选择两个适宜稀释度 , 每个稀释度接种 2 个平板计数琼脂培养基 ,培养后读取菌落数 ,并分别计算条件 A 和条件 B下的菌落总数的平均数 ,最后用公式(1)计算实验室内再现性标准偏差 SIR 的示例(见表 2)。
表 2 市售散装奶粉样品中菌落总数的实验室内再现性标准偏差计算
6 基质不确定度
6. 1 概述
基质不确定度表示给定食品基质中微生物分布的影响 , 即从同一实验室样品中称取或吸取不同测试部分的检验结果之间的差异 ,反映了单个测试部分不能代表整个实验室样品的微生物污染程度。依据实验室样品物理性状 ,将基质分为以下四类 :
a) 非黏流动性液体和粉末(例如果汁、牛奶、可可奶、奶粉等) ;
b) 充分混合的固体(例如肉糜、香肠肉、碎肉、打过泡的奶油、牛奶冰淇淋、大豆乳脂等) ;
c) 小颗粒固体(例如芹菜、蘑菇、胡萝卜、虾、谷物、碎榛子仁等) ;
d) 其他固体(例如没有绞碎的肉块、鱼肉、奶酪、面点、酸奶等)。
实验室样品难以混合均匀 ,从而导致测试部分之间微生物水平存在再现性差异。对于 a)类食品基质 ,其本身均匀性好 ,基质不确定度较小 ;对于 b)、c)和 d)类食品基质 ,其基质不确定度较大。
在实验室资源受控的情况下 ,基质不确定度不受检测方法的影响 , 同一种基质的不确定度评估适用于该基质的所有定量检测。关于基质的影响和基质不确定度更多详细内容见附录 B。
基质不确定度宜对每种基质分别进行计算。6. 2 至 6. 4 中规定了三种评估基质不确定度的方式 :
a) 对于均匀性良好的实验室样品 ,其基质不确定度较小 ,可以使用经验值(6. 2) ;
b) 从实验室样品中称取或吸取多个测试部分 ,计算样品的重复性标准偏差(Sr) ,从而确定样品内基质的不确定度(6. 3) ;
c) 已知基质和方法的相关特征 ,根据先前经验进行计算(6. 4)。
6.2 均匀性良好的实验室样品的基质不确定度评估
非黏流动性液体和粉末样品 ,其均匀性良好 ,具有相对低的基质不确定度 ,在称取或吸取测试部分时经过充分均质 ,基质不确定度可以使用定值 , 即 :
m:a实trix.102(g(、2C)g(时M, 利)。用基 质不 确定 度 umatrix = 0. 1 log10 (CFU/g、
CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)。
6.3 从实验室样品中称取或吸取多个测试部分时的基质不确定度评估
基质不确定度可以通过实验室内样品的重复性标准偏差来计算 , 即在重复性条件下对单个实验室样品中多个测试部分进行分析。实验方案见图 3。
图 3 每份实验室样品至少取两个测试部分的基质不确定度评估实验方案
基质不确定度不受被测目标菌和检测方法的影响。人工染菌无法反映真实的基质不确定度 ,所以宜优先选择自然的污染样品 , 以容易被检测到微生物为目标菌(例如嗜温需氧菌、肠杆菌科或嗜热芽孢杆菌等)。
建议保证从每个实验室样品中称取或吸取测试部分总数比实验室样品总数至少多 10个。所有的测试部分均来自同一个实验室样品时 ,从 1个实验室样品中至少称取或吸取 11个测试部分 ;测试部分来自多个同类实验室样品时 ,例如从 10个实验室样品中的每个样品至少称取或吸取 2个测试部分。
根据 5. 2. 2. 3. 1 界定可接受的结果 ,选择合适的检测方法评估基质不确定度 ,可按照附录 A计算重复性标准偏差。对于单个实验室样品 ,umatrix为常用对数转换后菌落数的标准偏差 SD;对于多个实验室样品 ,umatrix为常用对数转换后菌落数的单因素方差分析(ANOVA)。
6.4 基质特征已知时的基质不确定度评估
实验室可以根据以往的经验来评估样品的基质不确定度 , 即根据之前对某种基质的多个测试部分分析得到的基质 不确 定度 , 可以 作为 相似 基质 的基 质不 确定 度。 评价 基质 之间 是否 相似 , 可参 考SN/T 3266—2012的附录 A。
实验室可以使用来源于其他权威实验室估算的基质不确定度 , 同样某个实验室获得的基质不确定度值可以作为其他实验室样品基质不确定度的近似值。
注 : B. 2 给出了欧盟参考实验室研究食品样品的基质不确定度结果 ,实验室可参考利用。
7 分布不确定度
7. 1 概述
食品中微生物个体的随机分布产生分布不确定度udistrib , 即使是均匀性好的样品 ,也会存在分布不确定度。分布不确定度类型取决于所使用的检测方法 :
a) 对于平板计数法 ,为泊松不确定度(7. 2)和/或确证不确定度(7. 3) ;
b) 对于最可能数法 ,为 MPN不确定度(7. 4)。
合成标准不确定度时 ,根据微生物检测方法的特点 ,使用某方法(7. 2~ 7. 4)单次检测试验样品的结果的数值计算分布不确定度。
7.2 平板计数法— 泊松不确定度(uPoisson)
基于菌落计数的方法 ,分布不确定度取决于计算结果时所使用的菌落总数∑C。
注 : 例如使用某方法检测实验室样品 ,制备 10倍梯 度系 列稀 释液 ,选择 1 个 ~ 3 个适 宜的 连续 稀释 度的 样品 匀液(液体样品可以选择原液) ,每个稀释度接种 1个或 2个平板 ,然后按方法规定进行培养。
每个稀释度接种 1个平板时(如 ISO 4833-1) , ∑C 为计算结果时每个稀释度平板菌落数的和 ; 每个稀释度接种2个平板时(如 GB 4789. 2) , ∑C 为计算结果时每个稀释度平板菌落数之和。
表 3列出了菌 落总 数 ( ∑ C) 为 1 到 40 时的 uPoisson , 单位 为 log10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或MPN/mL)。如果无菌落生长( ∑C=0) ,则uPoisson=0. 434,此时需要予以注明。
表 3 菌落总数值对应的uPoisson
如果∑C 是表 3 以外的其他菌落总数∑C,则可用公式(2)计算对应的uPoisson :
uPoisson … … … … … … … … … … ( 2 )
假设∑C= 100时 ,则uPoisson
如果∑C 值很大 ,且其他不确定度分量也很大时 ,uPoisson分量可以忽略不计。
7.3 平板计数法— 确证不确定度(uconf)
部分平板计数法(如 GB 4789. 3、GB 4789. 10、GB 4789. 41等)需要对疑似菌落进行确证 ,根据确证结果对目标菌落总数进行修正 ,此时宜使用二项分布来计算某一特定结果的分布不确定度。
假设对 np个疑似菌落进行了确证试验 ,nc个菌落被确证为目标菌。表 4 列出了疑似菌落数 np、确证菌落数 nc , 以及与 np和 nc相对应的uconf值。
表 4 被测试疑似菌落数(np)和确证菌落数(nc)值及对应的uconf的常用对数值(log10)
可以用公式(3)计算表 4 以外的其他uconf值。
如果确证菌落数 nc=0,计算 uconf时则取 nc=1,但需要注明。
7.4 基于最可能数不确定度(uMPN)
最可能数不确定度uMPN 以 log10MPN 的标准偏差表示 , 即uMPN = SD log10MPN/g或 MPN/mL,其
数值仅与总管数和阳性管数相关 ,与所选择的样品稀释梯度无关。对于 9 管法和 15管法 ,不同接种量
的阳性管数所对应的uMPN值 ,可从附录 C检索。
注 : uMPN 值与所选择的样品稀释梯度无关。在附录 D 的 D. 4示例中 ,将所选择 3个连续稀释度更改为 10-1、10-2 和10-3 时 ,培养后 每个 稀释 度分 别出 现阳 性结 果的 管数 为 3、2 和 1, 查表 得 MPN= 150/mL, log10 MPN= log10 150= 2. 18log10MPN/mL,但uMPN 值不变 ,仍为 0. 27log10MPN/mL。
对于需要对疑似阳性结果进行确证的 MPN法 ,在计算 MPN值及不确定度时宜基于已确证的阳性结果数 , 即 MPN值和uMPN取决于确证后的阳性结果数。
8 合成标准不确定度和扩展不确定度
8. 1 合成标准不确定度
8. 1. 1 基于技术不确定度、基质不确定度和分布不确定度的合成标准不确定度
计算合成标准不确定度时 ,先计算技术不确定度的平方、基质不确定度的平方以及相关的分布不确定度的平方 ,将这些平方相加后开平方得到对应的合成标准不确定度。某个分量的不确定度小于最大不确定度分量五分之一时 ,该分量的影响忽略不计 ,不列入合成标准不确定度的计算。
不是所有检测方法都包含上述所有不确定度分量 ,不同检测方法的不确定度分量不同。
a) 仪器分析法(如阻抗测量法、三磷酸腺苷法和流式细胞计数法) , 不需 要菌 落计 数时 , 按公 式
(4)计算合成标准不确定度。
uc … … … … … … … … … … ( 4 )
c) 平板计数法(如 GB 4789. 10第二法、GB 4789. 41第一法) ,需要对可疑菌进行确证时 , 按公式
(6)计算合成标准不确定度。
uc (y) = uech + uatrix + uoisson + uonf … … … … … … … … … … ( 6 )
d) MPN 法 (如 GB 4789. 3 第一法、GB 4789. 39) , 按公式(7)计算合成标准不确定度。
uc (y) = uech + uatrix + uPN … … … … … … … … … … ( 7 )
uc(y) = SIR … … … … … … … … … … ( 8 )
8.2 扩展不确定度
通过合成标准不确定度(8. 1)和选定的包含因子(k)来计算扩展不确定度。本文件中 ,k 值等于 2 (相当于 95 %的置信水平) ,扩展不确定度 U 的计算见公式(9) :
U = 2 ×uc(y) … … … … … … … … … … ( 9 )
8.3 合成标准不确定度和扩展不确定度相关示例
合成标准不确定度和扩展不确定示例详见附录 D。
9 检测报告中测量不确定度的表示方法
根据 8. 1. 1 的规定 ,按以下两种方式报告 MU :
a) 技术不确定度、基质不确定度以及相关的分布不确定度进行综合评估 ;
当检测报告中需要体现 MU 时 ,报告中需明确地表述 MU 是扩展不确定度 , 同时还需包括置信水
平以及 MU按本文件进行评估的声明 ,例如 :“报告的扩展测量不确定度依据 RB/T 228进行评估 ,基于
合成=,,进。”行明确声明 ,例如 : “报告的扩展测量不确定度
性,。准”不确定度乘以包含因子 k= 2,置信水平 95%。合成标准不确
MU 的单位宜与检测结果的单位一致 ,且报告中的测量结果值修约成与扩展不确定度相同位数的有效数字。修约在最后进行 , 以避免修约误差累计造成的影响。
在报告中 ,扩展不确定度与检测结果一起体现 , 以 log10对数值或自然值表示如下 :
a) log10结果 ±U:y±Ulog10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL) ;例如 :5. 00±0. 31log10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL) ;
b) log10结果加限值 :y log10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)[y-U;y+U] ;例如 :5. 0 log10 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)[4. 7;5. 3] ;
c) 自然值加限值 :x(CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)[10 y -U ;10y +U ] ;例如 :1. 0×105 (CFU/g、CFU/mL、MPN/g或 MPN/mL)[4. 9×104 ;2. 0×105 ]。
附录 A
(资料性)
用两个或两个以上测试部分计算实验室内再现性标准偏差和基质不确定度标准偏差
5. 2. 2. 2规定了每个实验室样品取 2 个测试部分得到实验室内再现性标准偏差的实验方案。 每个实验室样品取 2个以上的测试部分和(或)对不同样品取不同数量的测试部分的实验方案见图 A. 1。
注 : 如果实验室难以按照图 A. 1方案(1)进行测试样品前处理 ,可用图 A. 1方案(2)替代。
图 A. 1 每个实验室样品取两个或两个以上测试部分的实验方案
该实验方案与样品取多个测试部分评估重复性标准偏差Sr (见 6. 3)类似 ,并且计算方法完全一样。
标准偏差计算 方法 如下 : 在不 同情 况下 , 假设 有 n 个实 验室 样品 , 从实 验室 样品 i 取 pi (i= 1, 2,
表示。计算标准偏差 SIR或Sr ,如公式(A. 1)和公式(A. 2)所示 :
(yij - yi) 2
SIR 或Sr =
∑ (pi - 1) i= 1
… … … … … … … … … …
( A. 1 )
( A. 2 )
SIR — 实验室内再现性或中间精密度标准偏差 ;
Sr — 重复性标准偏差 ;
i — 实验室样品编号(i= 1,2, … … ,n) ;
表 A. 1 为多个实验室样品多个测试部分菌落计数结果的标准偏差计算的示例。
表 A. 1 多个实验室样品多个测试部分菌落计数结果的标准偏差计算
当所需要的标准偏差是组内均方差的平方根时 , 可选用便于运行单因素方差分析(ANOVA) 的工具快捷计算出标准偏差。例如 :通过电子表格对表 A. 1 中yij进行单因素方差分析 ,运算后得到样品内的均方差是 0. 061 59,此时 :SIR = 0. 061 59=0. 248 17,见表 A. 2。
表 A.2 使用单因素方差分析法计算多个样品的实验室内再现性标准偏差
附录 B
基质的影响和基质不确定度
B. 1 概述
在液体基质(例如牛奶、水)中的微生物一般会随机(泊松)分布(见图 B. 1,情况 A) ,单个微生物和微生物簇可以在琼脂平板上形成菌落。在固体食品中 ,微生物分布在食品微粒之间 ,但是它们不是随机分布的 ,而是一种不均匀分布 ,如在肉或蔬菜中 ,微生物是随机污染其表面 , 而不是食品深层 ,菌落总体来说也是在其表面呈聚集性分布(见图 B. 1,情况 B)。
a) 情况 A: 随机分布 b) 情况 B:聚集性分布表现为簇状和小菌落
图 B. 1 表面微生物分布的假想图
如果一种成分复杂的食品是由一种原料(例如肉)与另一种原料(例如蔬菜和酱料)混合制成 ,那么所有固体原料表面的微生物将分布到整个多组分产品中 ,但在终产品中微生物的分布也不是随机的。
食品基质中的微生物数量反应了该食品中每种原料的相对污染水平 , 以及食品加工过程对微生物破坏的影响程度。从实验室食品样品中选取几个测试部分 , 检测后发现微生物的污染水平并不一致。特定微生物污染水平可以反应原料的数量和质量 , 以及食品加工过程对其分布的影响程度。如果奶粉和其他粉状产品仅是一个生产批次中小部分被特定微生物污染 ,也会出现类似情况(见图 B. 2)。
即使实验室样品在检测之前已经充分混匀 ,微生物污染水平也会因不同的测试部分而发生变化 ,尤其是在固体食品基质中。这种变化在本文件中称为 “基质不确定度 ”。
注 : 黑色方块表示有特定目标微生物检出的样品。
图 B.2 100个粉末状样品或复杂食品中低水平的特定目标微生物分布假想图
B.2 示例
欧盟参考实验室根据 ISO 19036:2019的规定 ,研究并计算了一些食品样品的基质不确定度umatrix (log10 CFU/g或 CFU/mL)结果(表 B. 1) ,实验室可以利用其作为相同或相似基质的基质不确定度。
表 B. 1 欧盟参考实验室研究食品样品的基质不确定度结果
表 B. 1 欧盟参考实验室研究食品样品的基质不确定度结果 (续)
附录 C
最可能数(MPN)不确定度检索表
C. 1 9 管法的最可能数(MPN)不确定度检索
使用 3个接种量 1 mL或 g, 3个接种量 0. 1 mL或 g 和 3个接种量 0. 01mL或 g, 阳性管数对应的最可能数(MPN)不确定度检索见表 C. 1。
表 C. 1 9 管法的最可能数(MPN)不确定度检索表
C.2 15管法的最可能数(MPN)不确定度检索
使用 5个接种量 1 mL或 g, 5个接种量 0. 1 mL或 g 和 5个接种量 0. 01mL或 g, 阳性管数对应的最可能数(MPN)不确定度检索见表 C. 2。
表 C.2 15管法的最可能数(MPN)不确定度检索表
表 C.2 15管法的最可能数(MPN)不确定度检索表 (续)
附录 D
合成标准不确定度和扩展不确定度计算示例
D. 1 示例 1— 包含技术、基质和泊松不确定度分量的不确定度
质不性一可 ,,按at行rix总l1计0,。稀,e每ch平.1l1种0C,;0.2-3,
释度 102CFU ,10-4稀释度 8 CFU ,菌落总数之和∑C= 102+8= 110CFU ,此时用公式(2)计算菌落总
0. 2,o分issonois(s).0。414log10CFU/mL,此时比值uPoisson/utech=0. 0414/0. 15=0. 276,大于
此时 ,合成标准不确定度uc
位有效数字)。
本示例中 ,菌落计数 的平 均数 为 CFU/mL, 换算 成以 10 为底 的对 数是5. 0log10CFU/mL,此时测试结果可表示为 5. 0±0. 37log10CFU/mL。
D.2 示例 2— 可以忽略不计的泊松不确定度分量
o例issonte技chteh.5o,10isUso,(。8. 1. 1)。
)U。/mL,uc(y)乘以包含因子 k(k = 2) ,得出扩展不确定度 U= 0. 54log10CFU/mL(保留 2 位有效数本示例中 ,菌落 计数 的平 均数 为CFU/mL, 换算 成以 10 为底 的对 数是
5. 0 log10CFU/mL,此时测试结果可表示为 5. 0±0. 54log10CFU/mL。
D.3 示例 3— 包含泊松、基质和确证不确定度分量的不确定度
按照示例 1,需要挑取选择性培养基上的典型和可疑菌落进行目标菌确证 ,例如选取的 5 个典型和可疑菌落进行确证后 ,有 4个为目标菌 ,对结果进行修正 ,见表 D. 1。
表 D. 1 包含泊松、基质和确证不确定度分量的不确定度的计算示例
根据 7. 3, 当 np= 5,nc=4, 检索 表 4 得出uconf= 0. 088 8,uconf/utech = 0. 088 8/0. 15= 0. 592, 大于
比值uPoisson/utech=0. 0414/0. 15=0. 276,大于 0. 2,则uPoisson不能忽略不计(8. 1. 1)。
此时 ,计算合成标准不确定度uc =
0. 042 1=0. 205log10 CFU/mL;uc (y)乘以 包含 因子 k(k = 2)后 , 得出 扩展 不确 定度 U= 0. 41log10
本示例中 ,确认试验修正后的菌落数换算成以 10为底的对数是 4. 903log10 CFU/mL,此时测试结果可表示为 4. 9±0. 41 log10CFU/mL。
D.4 示例 4— 包含技术、基质和最可能数不确定度分量的不确定度
某实验室用 GB 4789. 3 第一法(MPN法 ,3个稀释度 , 每个稀释度 3 管)来计数液态牛奶中大肠菌
R。=lo10性tech,u,atr对ix=2. l品10 )现。m下atrixtec,tec
0. 492取,2,m三atri(原(8.. 1、1)0。- 1 和 10- 2 ) ,每个稀释度接种 3 管液体培养基 ,每
管接种 1mL,共接种 9管培养基 ,培养后每个稀释度出现阳性管数分别为 3、2 和 1。 检索表 C. 1 得出
uMPN = 0. 27log10MPN。 比值uMPN/utech=0. 27/0. 49=0. 55,大于 0. 2,则uMPN不能忽略不计(8. 1. 1)。
此时 ,计算合 成标 准不 确定 度 uc
本示例中 ,MPN法检测液态牛奶中大肠菌群结果可表示为 1. 2±1. 1log10MPN/mL。
参考 文献
[1] GB/T 3358. 1—2009 统计学词汇及符号第 1部分 :一般统计术语与用于概率的术语
[2] GB 4789. 3 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数
[3] GB 4789. 10 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验
[4] GB 4789. 15 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
[5] GB 4789. 30 食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验
[6] GB 4789. 38 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数
[7] GB 4789. 39 食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数
[8] GB 4789. 41 食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验
[9] GB/T 22553 利用重复性、再现性和正确度的估计值评定测量不确定度的指南
[10] JJF 1001—2011 通用计量术语及定义
[11] RB/T 037 食品微生物检测标准方法等效性评估指南
[12] SN/T 3266—2012 食品微生物检验方法确认技术规范
[13] ISO 4833-1 Microbiology of the food chain— Horizontal method for the enumeration of microorganisms—Part1:Colony countat30 °C by the pour plate technique
[14] ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs—General requirements and guidance for microbiological examinations
[15] ISO 19036:2019 Microbiologyofthe food chain—Estimation ofmeasurementuncertainty for quantitative determinations
[16] 欧盟 参考 实验 室研 究食 品样 品的 基质 不确 定度 结果, https://sitesv2. anses. fr/en/minisite/ listeria-monocytogenes/matrix-uncertainty-mau-values
