SN/T 5876-2025 包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法 实时荧光PCR法
- 名 称：SN/T 5876-2025 包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法 实时荧光PCR法 - 下载地址2
- 类 别：检验检疫
- 下载地址：[下载地址2]
- 提 取 码：
- 浏览次数：3
发表评论 加入收藏夹 错误报告目录| 新闻评论（共有 0 条评论） |
资料介绍
ICS 07. 100. 20 CCS X 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5876—2025
包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法
实时荧光 PCR 法
Detection method of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water—
Real‑time PCR method
2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
SN/T 5876—2025
前 言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：拱北海关技术中心、珠海粤港食品安全检测有限公司、太原海关技术中心。
本文件主要起草人：冯家望、黎财慧、张敏爱、游淑珠、唐食明、姚丽锋、王小玉、张晴阳、陈敬、曾俊洁。
Ⅰ
SN/T 5876—2025
包装饮用水中铜绿假单胞菌检测方法
实时荧光 PCR 法
1 范围
本文件描述了包装饮用水中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)实时荧光 PCR 检测方法。
本 文 件 适 用 于 包 装 饮 用 水 中 铜 绿 假 单 胞 菌 的 实 时 荧 光 PCR 法 检 测 ，其 他 类 型 水 质 参 照 本 文 件使用。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 8538 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
实时荧光 PCR real time PCR
在 PCR 扩增时加入带有荧光基团的特异性探针(Taqman 探针)或荧光染料，使 PCR 产物的积累与荧光信号的积累完全同步，实现 PCR 产物的实时监测。
3.2
Ct 值 Cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)
DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)
dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)
dTTP：脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
FAM：6-羧基荧光素(6-carboxy fluorescein)
1
SN/T 5876—2025
gryB：细菌中编码促旋酶 B 亚单位的基因(the gene encoding the subunit B of gyrase)
MGBNFQ：小沟结合物无荧光淬灭基团(minor groove binder/non-fluorescent quencher)
PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxy methyl)aminomethane]
5 方法提要
按照 GB 8538 进行水样过滤和培养后，分别计数可疑菌落，并取可疑菌落提取其 DNA，以铜绿假单胞菌特异性 gyrB 基因片段为扩增靶标进行实时荧光 PCR 检测，根据 Ct 值实现对可疑菌落的快速筛选，按照 GB 8538 进行生化鉴定后，根据公式计算后报告每 250 mL 水样中的铜绿假单胞菌数。
6 主要设备及耗材
6.1 天平：感量 0.1 g。
6.2 过滤设备。
6.3 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。
6.4 紫外灯：波长应为 360 nm±20 nm 。
6.5 高速冷冻离心机：离心力≥12 000 g。
6.6 涡旋振荡仪。
6.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
6.8 Ⅱ级生物安全柜。
6.9 实时荧光 PCR 仪。
6.10 不同量程移液器：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL 。
6.11 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL 。
6.12 PCR 管。
6.13 无菌亲水性微孔滤膜：直径 47 mm，孔径 0.45 μm 。
7 培养基与试剂
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。
7.1 CN 琼脂：成分和配制方法见 GB 8538。
7.2 营养琼脂：成分和配制方法见 GB 8538。
7.3 无菌生理盐水：成分和配制方法见 GB 8538。
7.4 无菌磷酸盐缓冲液：成分和配制方法见 GB 8538。
7.5 DNA 提取液：称取 0.1 g chelex 100 粉末，加入 100 mL 灭菌蒸馏水中，摇匀即可。也可使用等效的商业化 DNA 提取试剂盒。
7.6 HS Taq DNA 聚合酶。
7.7 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP 。
7.8 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。
7.9 阳性质控菌株：铜绿假单胞菌标准菌株[CMCC(B)10282 或等效标准菌株]。
7.10 阴性质控菌株：恶臭假单胞菌标准菌株[CMCC(B)10283 或等效标准菌株]。
7.11 试验用引物探针见表 1，扩增片段序列参见附录 A(GenBank：NC _002516.2)。
2
SN/T 5876—2025
表 1 引物探针序列
名称
引物探针序列(5 ’→ 3’)
目的基因
gyrB-F
GGCGTGGGTGTGGAAGTC
gyrB
gyrB-R
TGGTGAAGCAGAGCAGGTTCT
gyrB-P
FAM-TGCAGTGGAACGACA-MGBNFQ
上述实时荧光 PCR 扩增的引物和探针加超纯水配制成 100 μmol/L 储备液，工作液需用储备液稀释至 10 μmol/L 。
8 检验程序
包装饮用水中铜绿假单胞菌的检验程序见图 1。
水样
取250 mL水样或稀释后水样膜过滤
将滤膜移放在CN琼脂培养基上
36℃±1℃ 20 h~48 h
无可疑菌落 分别计数可疑菌落,并接种营养琼脂纯化
36℃±1℃ 20 h~24 h
取可疑菌落提取DNA进行实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR扩增阴性
实时荧光PCR扩增阳性菌,应按GB 8538进行确证
结果计算和报告
图 1 包装饮用水中铜绿假单胞菌的检验程序
9 检测步骤
9.1 水样过滤和培养
按 GB 8538 用过滤设备将 250 mL 水样或稀释后的水样(用无菌生理盐水或无菌磷酸盐缓冲液稀释)通过孔径 0.45 μm 的无菌滤膜过滤。将过滤后的滤膜贴在 CN 琼脂平板上，滤膜截留细菌面向上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。将平板倒置，36 ℃±1 ℃培养 24 h~48 h，并防止干燥。
3
SN/T 5876—2025
9.2 结果观察与计数
在 培 养 20 h~24 h 和 40 h~48 h 后 观 察 滤 膜 上 菌 落 的 生 长 情 况 并 计 数 可 疑 菌 落 。若 培 养 40 h~ 48 h 导致菌落过分生长而出现菌落融合，造成无法计数时，参考培养 20 h~24 h 时的菌落计数结果。
铜绿假单胞菌典型菌落在 CN 琼脂上具有以下特征之一：
a) 蓝色或绿色菌落;
b) 紫外灯照射下发荧光、非蓝色且非绿色菌落;
c) 紫外灯照射下不发荧光、红褐色菌落。
注：避免滤膜上菌落长时间在紫外灯下照射，否则可能将菌杀灭，导致无法进行确证性试验。
9.3 营养琼脂纯化
根据不同形态可疑菌落数量，按比例挑取 10 个可疑菌落(不足 10 个则全挑)，划线接种于营养琼脂培养基上，36 ℃±1 ℃培养 20 h~24 h，按下述步骤进行可疑菌落鉴定。
9.4 细菌模板 DNA 的提取
使用接种环刮取营养琼脂平板上的菌落 2 个~10 个，悬浮于 200 μL 无菌生理盐水，旋涡混匀，8 000 g离心 5 min，吸弃上清液，加入 50 μL DNA 提取液(使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取)，混匀后沸水浴 5 min，12 000 g 离心 5 min，取上清保存于-20 ℃备用。
也可使用等效的商业化 DNA 提取试剂盒并按说明制备模板 DNA 。
9.5 DNA 浓度和纯度的测定
样品 DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，按照式(1)计算 DNA 的浓度。
ρ =A260 ×50 ……………………………( 1 )
式中：
ρ ——DNA 浓度，单位为纳克每微升(ng/µL);
A260 ——260 nm 处的吸光值。
当 DNA 浓度在 2 ng/µL~50 ng/µL，A260 /A280 在 1.7~1.9 之间时，适宜于实时荧光 PCR 检测。
9.6 实时荧光 PCR 检测
9.6.1 反应体系
按照表 2 配制实时荧光 PCR 的最终反应体系。
表 2 实时荧光 PCR 试验反应体系
试剂
终浓度
体积/μL
模板 DNA
—
5.0
10×Buffer
1×
2.5
10 µmol/L 上游引物
0.4 µmol/L
1.0
10 µmol/L 下游引物
0.4 µmol/L
1.0
10 µmol/L 探针
0.4 µmol/L
1.0
dNTP(10 mmol/L)
0.4 mmol/L
1.0
4
SN/T 5876—2025
表 2 实时荧光 PCR 试验反应体系(续)
试剂
终浓度
体积/μL
HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)
0.1 U/μL
0.5
无菌超纯水
—
13.0
注 1 : 能选用含有 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 和 HS Taq DNA 聚合酶等成分的基于 Taqman 探针的实时荧光 PCR 预混液进行实时荧光 PCR 扩增。
注 2: 反应体系中各试剂的量能根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。
9.6.2 反应参数
95 ℃预变性 10 min;95 ℃变性 30 s，60 ℃退火延伸 30 s，同时收集荧光，进行 40 个循环。
注：以上参数能根据不同型号实时荧光 PCR 仪和所选 PCR 扩增试剂体系不同进行适当的调整。设置 PCR 反应管荧光信号收集条件，需与探针标记的报告基团一致。具体设置方法参照仪器使用说明书。
9.7 对照和平行
检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以 7.9 中的阳性质控菌株 DNA 或含目的片段的 DNA 作阳性对照，以 7.10 中的阴性质控菌株 DNA 作阴性对照，用等体积的超纯水代替 DNA 模板作为空白对照。每个待检样品进行 2 个平行试验。
10 结果分析与表述
10.1 质量控制
阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值<30.0;
阴性对照、空白对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0;
以上有一条不满足时，试验均视为无效。
10.2 结果判定
Ct 值≥40.0，可判定实时荧光 PCR 扩增结果为阴性。
Ct 值≤35.0，可判定实时荧光 PCR 扩增结果为阳性。
35.0
对于实时荧光 PCR 扩增阳性结果，应按照 GB 8538 的方法做进一步的生化鉴定。
10.3 结果报告
铜绿假单胞菌数按式(2)进行计算，报告每 250 mL 水样中的铜绿假单胞菌数，以 CFU/250 mL 表示;当 N 值为 0 时，可报告 250 mL 水样未检出铜绿假单胞菌：
N ……………………………( 2 )
式中：
N ——每 250 mL 水样中铜绿假单胞菌的菌落数;
P ——蓝色和绿色的菌落数;
5
SN/T 5876—2025
cp ——实时荧光 PCR 扩增结果阳性且按照 GB 8538 对蓝色和绿色菌落进行生化鉴定为阳性的菌落数;
np ——进行实时荧光 PCR 扩增的蓝色和绿色菌落数;
d ——稀释因子;
F ——发荧光、非蓝色且非绿色菌落数;
cF ——实时荧光 PCR 扩增结果阳性且按照 GB 8538 对发荧光、非蓝色且非绿色菌落进行生化鉴定为阳性的菌落数;
nF ——进行实时荧光 PCR 扩增的发荧光、非蓝色且非绿色的菌落数;
R ——不发荧光、红褐色的菌落数;
cR ——实时荧光 PCR 扩增结果阳性且按照 GB 8538 对不发荧光、红褐色菌落进行生化鉴定为阳性的菌落数;
nR ——进行实时荧光 PCR 扩增的不发荧光、红褐色菌落数。
11 防止交叉污染措施和生物安全措施
11.1 防止交叉污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403—2008 中附录 D 的规定执行。
11.2 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物参照 GB 19489的有关规定执行。
6
SN/T 5876—2025
附 录 A (资料性)
扩增片段序列
铜绿假单胞菌扩增片段序列(GenBank：NC _002516.2)如下。
GGCGTGGGTGTGGAAGTCGCCCTGCAGTGGAATGACAGCTTCAACGAGAACCTGCTG TGCTTCACCA
7
