SN/T 5727.3-2025 出口林下三七检验规程 第3部分：三七成分鉴别方法 实时荧光PCR方法

　　ICS 67.050 CCS X 04

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5727.3—2025

　　出口林下三七检验规程

　　第3部分：三七成分鉴别方法 实时荧光

　　PCR方法

　　Rules for the inspection of panax notoginseng cultivated in forest for export —

　　Part 3: Identification of ingredient of panax notoginseng cultivated in forest

　　for export — Real-time PCR method

　　2025-12-11发布 2026-07-01实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件是SN/T 5727—2025《出口林下三七检验规程》的第3部分。SN/T 5727—2025 已经发布了以下部分：

　　——第 1部分：总则;

　　——第2部分：林下三七鉴别 近红外光谱法;

　　——第3部分：三七成分鉴别方法 实时荧光PCR方法;

　　——第4部分：稳定氮同位素比值(15N/14N)测定 同位素比质谱法;

　　——第5部分：5种皂苷的测定 高效液相色谱法;

　　——第6部分：三七素的测定 高效液相色谱法;

　　——第7部分：D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸的测定 液相色谱法;

　　——第8部分：多元素的测定 电感耦合等离子体质谱法;

　　——第9部分：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类农药多残留的测定 气相色谱-质谱/质谱法。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：天津海关动植物与食品检测中心、天津师范大学、云南农业大学、厦门海关技术中心、合肥海关技术中心、昆明海关技术中心、大连民族大学、西南林业大学、通标标准技术服务有限公司。

　　本文件主要起草人：赵良娟、王飞、韩芳、郑文杰、徐敦明、季超、朱书生、何霞红、陈宏仙、曹际娟、邓维萍、施蕊、张芹、段胜男、朱有勇。

　　I

　　引 言

　　SN/T 5727—2025《出口林下三七检验规程》旨在建立适用于林下三七成分特征和质量安全检测方法，拟由9个部分构成(各部分之间关系如图 1所示)。

　　——第 1部分：总则;目的在于确定适用于出口林下三七的贮藏要求、抽样、检验、结果判定、不合格货物处置和存查样品的要求。

　　——第2部分：林下三七鉴别 近红外光谱法;目的在于确定适用于林下三七与农田三七的快速鉴别方法。

　　——第3部分：三七成分鉴别方法 实时荧光PCR方法;目的在于确定适用于药食同源植物林下三七中三七成分的定性检测方法。

　　——第4部分：稳定氮同位素比值( 15N/14N)测定 同位素比质谱法;目的在于确定适用于三七中的稳定氮同位素比值(15N/14N)的测定方法。

　　——第5部分：5种皂苷的测定 高效液相色谱法;目的在于确定适用于林下三七中的5种皂苷Rb1、Rb3、Re、Rg1 和 R1 的测定方法。

　　——第6部分：三七素的测定 高效液相色谱法;目的在于确定适用于林下三七中的三七素的测定方法。

　　——第7部分：D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸的测定 液相色谱法;目的在于确定适用于林下三七中多糖组分 D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸的测定方法。

　　——第8部分：多元素的测定 电感耦合等离子体质谱法;目的在于确定适用于林下三七中硼(B)、钠(Na)、镁(Mg)、铍(Be)、铝(Al)、钾(K)、钙(Ca)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、铯(Cs)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、砷(As)、硒(Se)、锶(Sr)、钼(Mo)、镉(Cd)、锡(Sn)、锑(Sb)、钍(Th)、钡(Ba)、汞(Hg)、铊(TI)、铀(U)、铅(Pb)的测定方法。

　　——第9部分：有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类农药多残留的测定 气相色谱 -质谱/质谱法;目的在于确定适用于三七中 115种有机磷、有机氯及拟除虫菊酯农药及相关化学品的定性鉴别及定量测定方法。

　　II

　　林下三七鉴别 近红外光谱法

　　鉴别试验

　　三七成分鉴别方法 实时荧光PCR方法

　　稳定氮同位素比值

　　(15N/14N)测定 同位素比质谱法

　　5种皂苷的测定 高效液相色谱法

　　总则

　　成分测定

　　三七素的测定 高效液相色谱法

　　D-无水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、 D-半乳糖醛酸的测定 液相色谱法

　　多元素的测定 电感耦合等离子体质谱法

　　安全检测

　　有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类农药多残留的测定 气相色谱-质谱/质谱法

　　图 1 SN/T 5727—2025各部分之间关系

　　III

　　出口林下三七检验规程

　　第3部分：三七成分鉴别方法 实时荧光PCR方法

　　1 范围

　　本文件规定了林下三七中三七成分的实时荧光PCR鉴别方法。

　　本文件适用于药食同源植物林下三七中三七成分的定性检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　SN/T 5727.1 出口林下三七检验规程 第 1部分：总则

　　3 术语和定义

　　SN/T 5727.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1 实时荧光 PCR real-time fluorescence PCR

　　在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

　　3.2 Ct值 cycle threshold

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

　　4 原理

　　提取样品DNA，分别采用内参 18S rRNA基因和三七的特异性检测引物和探针对样品DNA进行TaqMan实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断该样品中是否存在三七成分。

　　5 试剂和材料

　　5.1 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上，水为GB/T 6682规定的一级水。

　　5.2 检测用引物(对)序列和探针：见表 1。

　　5.3 DNA提取试剂盒：多糖多酚类植物通用基因组DNA提取试剂盒。

　　5.4 实时荧光PCR预混液(2× Taq Pro HS Universal Probe Master Mix)。

　　1

　　表 1 三七 PsbA-trnH基因(GenBank：HQ112882.1)序列引物探针

　　名称

　　序列(5’-3’)

　　扩增片段长度

　　靶基因

　　内参5’端引物

　　内参3’端引物内参探针

　　CCTGAGAAACGGCTACCAT

　　CGTGTCAGGATTGGGTAAT

　　VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT- BHQ1

　　65bp

　　18S rRNA

　　三七5’端引物

　　三七3’端引物三七探针

　　ACCTAGTTTTTTTAAATAAATTAAATAA

　　AGTCCAACATTTTTTCTTTTA

　　FAM-AAAACACTTCCCAAAAGATAA -MGB

　　179bp

　　PsbA-trnH

　　6 仪器和设备

　　6.1 实时荧光PCR仪。

　　6.2 离心机：离心力≥ 12 000g。

　　6.3 恒温水浴锅。

　　6.4 高压灭菌锅。

　　6.5 核酸蛋白分析仪。

　　6.6 分析天平：感量0.001 g。

　　6.7 涡旋震荡仪。

　　6.8 不同量程移液器：0.5 μL ～ 10 μL、10 μL ～ 100 μL、20 μL ～200 μL、100 μL ～ 1 000 μL。

　　7 检测步骤

　　7.1 DNA提取

　　称取30 mg样品粉末，加入700 μL CTAB缓冲溶液。65 ℃水浴50 min，每隔 10 min上下颠倒， 12 000 g 离心 10 min，将上清液600 μL转移到一个新离心管中。加入等体积(600 μL)Tris 饱和酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡 10 min，使两者混合均匀，4 ℃ 9 000 g 离心 15 min，将上清液450 μL转移到一个新离心管中。加入等体积(450 μL)的三氯甲烷-异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀，4 ℃ 10 000 g 离心5 min，取约400 μL上清液到一个新离心管中。加入约2.5倍体积(1 mL)预冷的无水乙醇，轻轻混匀，可见白色絮状沉淀， -20 ℃沉淀20 min。4 ℃ 12 000 g 离心5 min，弃上清液。用400 μL 75% 乙醇洗涤 1次，4 ℃ 12 000 g 离心5 min，弃上清液，重复 1次。在空气中干燥10 min。加入30 μL无菌水溶解DNA，涡旋振荡几秒， -20 ℃保存。

　　注：能使用商业化的DNA提取试剂盒。

　　7.2 DNA浓度和纯度的测定

　　取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸收值。DNA 的浓度按照公式(1)计算。

　　C=A260 ×N×50 ……………………………(1)

　　式中：

　　C ——DNA浓度，单位为 μg/mL; A260 ——260 nm处的吸光值;

　　N ——核酸稀释倍数。

　　当浓度为5 μg/mL～ 100 μg/mL，A260/A280 比值在 1.7～ 1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。

　　2

　　7.3 实时荧光 PCR检测

　　7.3.1 实时荧光 PCR反应体系

　　实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品进行检测时应设置2个平行实验。

　　表2 实时荧光 PCR反应体系

　　试剂

　　终浓度

　　体积/μL

　　2 × Taq Pro HS Universal Probe Master Mix

　　1×

　　10.0

　　PsbA-trnH F(10 μmol/L)

　　0.1 μmol/L

　　0.2

　　PsbA-trnH R(10 μmol/L)

　　0.1 nmol/L

　　0.2

　　PsbA-trnH P(10 μmol/L)

　　0.05 nmol/L

　　0.1

　　18S F(10 μmol/L)

　　0.2 μmol/L

　　0.4

　　18S R(10 μmol/L)

　　0.2 nmol/L

　　0.4

　　18S P(10 μmol/L)

　　0.1 nmol/L

　　0.2

　　DNA模板(5 μg/mL~50 μg/mL)

　　—

　　2.0

　　水

　　—

　　补齐至20.0

　　总体系

　　20.0

　　7.3.2 实时荧光 PCR反应程序

　　95 ℃ 30 s，1个循环;95 ℃ 10 s，57 ℃ 10s，72 ℃ 30 s，45个循环。

　　7.3.3 实验对照

　　检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以三七提取的 DNA为阳性对照，以已知不含有三七成分的样品提取的DNA为阴性对照，以等体积的超纯水代替模板DNA做空白对照。每个待检样品应有2个平行实验。

　　8 质量控制

　　以下条件有一条不满足时，试验视为无效：

　　a) 空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥ 40.0;

　　b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥ 40.0;

　　c) 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤ 30.0;

　　d) 内参照：荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值< 30.0。

　　9 结果判定及表述

　　9.1 结果判定

　　在符合第8章的情况下，被检样品进行以下检测。

　　a) 如Ct值≤ 30.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列见附录A。

　　3

　　b) 如Ct值≥ 40.0，则判定为被检样品阴性。

　　c) 如30.0

　　9.2 结果表述

　　样品阳性，表述为“检出三七成分”。

　　样品阴性，表述为“未检出三七成分”。

　　10 检测过程中防止交叉污染的措施

　　检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403—2008 中附录D 的规定执行。

　　11 检出限

　　本方法所规定的最低检出限(LOD)为0.01%(质量分数)。

　　4

　　附 录 A

　　(资料性)

　　三七成分的基因扩增靶标参考序列

　　三七成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank：HQ112882.1)如下。

　　ACCTAGTTTTTTTAAATAAATTAAATAAATTTAAAGAAACGTCGTTTTATTTTTATCGGTTGGTTC ATGAGTGAGTATCATGCTTTCGTTCTGTATTAATCATTAATCTAGAATTTAGCTACTTCTTCCCAATCT TTATCTTTTGGGAAGTGTTTT TT TAAAAGAAAAAATGTTGGACT

　　注：阴影部分为上下游引物序列，方框部分为探针序列。

　　5