SN/T 5940-2025 云杉帚锈病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65. 020. 01 CCS B 16

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　SN/T 5940—2025

　　云杉帚锈病菌检疫鉴定方法

　　Detection and identification of Chrysomyxa arctostaphyli

　　2025‑12 ‑ 11 发布 2026‑07‑01 实施

　　中华人民共和国海关总署 发 布

　　SN/T 5940—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、中国科学院微生物研究所、北京林电伟业电子技术有限公司、大连海关技术中心、长春海关技术中心、南宁海关技术中心、海口海关技术中心、拱北海关技术中心、西藏农牧学院、宁波海关、南京海关技术中心、武汉海关技术中心、中国质量检验检测科学研究院、福州海关技术中心、阿拉山口海关技术中心、成都海关技术中心、青岛海关技术中心、中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

　　本文件主要起草人：王艺凯、蔡磊、赵鹏、任荔荔、李鑫、王有福、魏春艳、王准、杜智欣、蔡波、张卫东、巩文峰、刘芳、段维军、吴翠萍、王振华、李明福、于文涛、李兰、邵宝林、高宏伟、郑春生、李宝聚、柴阿丽、祝天宇。

　　Ⅰ

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　　云杉帚锈病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了云杉帚锈病菌的检疫鉴定方法。

　　本文件适用于云杉帚锈病菌的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　SN/T 2589 植物病原真菌检测规范

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3. 1

　　性孢子器 spermogonium

　　由担孢子萌发形成的单核菌丝体在侵染寄主时形成的锈菌性器官。

　　3. 2

　　性孢子 spermatium

　　性孢子器中产生的单核孢子。

　　3. 3

　　锈孢子器 aecium

　　由性孢子与受精丝结合或与单核菌丝结合产生的双核次生菌丝组织。

　　3. 4

　　锈孢子 aeciospore

　　锈孢子器中产生的串生、单胞、双核、黄色、球形或卵形的孢子。

　　3. 5

　　冬孢子 teliospore

　　由双核菌丝产生的厚壁有性孢子在生长后期形成的单胞或多胞的休眠孢子。

　　3. 6

　　冬孢子堆 telium

　　冬孢子聚集在一起形成的组织。

　　3. 7

　　担子 basidium

　　寄主体上的冬孢子萌发形成的组织。

　　3. 8

　　担孢子 basidiospore

　　担子横裂四胞，每胞生一小柄，其上着生单胞、无色或稍带黄色的孢子。

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　　4 基本信息

　　中文名：云杉帚锈病菌。

　　学名：Chrysomyxa arctostaphyli Dietel。

　　异名：Melampsoropsis arctostaphyli。

　　无性型名称：Peridermium coloradense。

　　分类地位：真菌界 Fungi，担子菌门 Basidimycota，柄锈菌纲 Pucciniomycetes，柄锈菌目 Pucciniales，金锈菌科 Chrysomyxaceae，金锈菌属 Chrysomyxa。

　　云杉帚锈病菌的其他信息见附录 A 。

　　5 方法原理

　　本文件以该病菌在寄主上的危害症状特征、病原菌形态及基因特征等为云杉帚锈病菌的鉴定依据。

　　6 仪器设备和主要试剂

　　6. 1 仪器和器具

　　PCR 仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、水平凝胶电泳仪、电子天平(感量 1/10 000 g)、解剖镜、显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、低温冰箱等。

　　6. 2 主要试剂

　　无 菌 双 蒸 水 、CTAB 提 取 液(2% CTAB，1. 4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris · HCl pH 8. 0)、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNase、TE 缓冲液(pH 8 . 0)、PCR 试剂(包括 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、PCR 缓冲液)、100 bp Marker、琼脂糖、GelRed 核酸凝胶染料、1×TBE电泳缓冲液。

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

　　7 样品的检查和制备

　　7. 1 症状检查

　　在云杉属植物上，观察植株枝条叶片和叶柄上是否出现锈孢子器，是否有明显、紧凑的扫帚状且外观黄色的丛枝病病症，树枝和树干上是否有腐烂、纺锤形肿胀和橘黄色的次生帚状物，云杉属植物叶片上是否呈现淡黄色病斑，斑点上是否集生针尖状小突起，具体症状见附录 A 。

　　在熊果属植物上，观察叶片是否产生棕褐色的叶斑，是否有冬孢子堆，如果有棕褐色的叶斑，需要徒手或者切片机切片镜检。

　　7. 2 样品制备

　　用灭菌的移植钩挑取疑似样品病斑部位的病征，转移至载玻片的中央水滴中，在显微镜下观察，并拍照记录。

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　　8 鉴定依据

　　8. 1 病菌形态特征

　　锈孢子阶段：锈孢子堆着生于云杉针叶，淡黄色长条状，包被膜随成熟破裂后露出锈孢子。包被细胞不规则形，锈孢子淡黄色至无色，卵形、椭圆形，大小(16 μm~25 μm)×(23 μm~35 μm)。

　　冬孢子阶段：冬孢子堆着生于叶背，散生或聚生，黄棕色，蜡质。冬孢子无色，圆柱状或棱柱状，短圆，两端圆形，壁光滑，无色，表面无纹饰，厚度均匀，链状排列，大小(13 μm~18 μm)×(23 μm~64 μm)。

　　担孢子：担孢子圆形、椭圆形或长椭圆形，孢子大小(7 . 5 μm~8 μm)×(8 . 5 μm~9 . 5 μm)。

　　具体症状见附录 B 。

　　8. 2 核糖体 DNA 序列分析

　　将 带 症 状 部 位 处 锈 孢 子 堆 或 者 冬 孢 子 堆 切 下 后 进 行 DNA 提 取 ，采 用 引 物 对 ITS4-BRf/LR5 和 ITS5/ITS4BR 进行 PCR 扩增，用于获得核糖体内转录间隔区(ITS)和 28S 核糖体大亚基(LSU)序列。具体操作按照附录 C。基因序列见附录 D 和附录 E 。

　　9 结果判定

　　若样品上症状符合 7. 1 典型的症状特征，锈孢子或冬孢子或担孢子的形态特征符合 8. 1 的孢子特征，判定检出云杉帚锈病菌。

　　样品上不具有典型的症状特征，或未见典型的孢子形态特征，但扩增得到的 LSU 和 ITS 序列为云杉帚锈病菌序列时，则判定检出云杉帚锈病菌。

　　10 结果记录与样品保存

　　10. 1 样品保存与处理

　　检出云杉帚锈病菌的样品应妥善保存。保存期满后应经过高压灭菌后方可丢弃。

　　10. 2 结果记录与资料保存

　　妥善保存实验记录及相关结果图片资料。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　云杉帚锈病菌的其他信息

　　A. 1 寄主植物与分布

　　寄主植物与分布见表 A . 1。

　　表 A. 1 寄主植物与分布表

　　植物属名

　　寄主植物名称

　　地理分布

　　生活史阶段

　　熊果属(Arctostaphylos)

　　内华达熊果(A.nevadensis)

　　美国

　　冬孢子阶段

　　内华达熊果科罗拉多变种

　　(A.nevadensis var.coloradensis)

　　美国

　　冬孢子阶段

　　展枝熊果(A.patula)

　　美国

　　冬孢子阶段

　　熊果(A.uva‑ursi)

　　加拿大美国

　　冬孢子阶段

　　云杉属(Picea)

　　欧洲云杉(P.abies)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　欧洲云杉(P.abies)

　　美国

　　锈孢子阶段

　　恩格曼云杉(P.engelmannii)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　恩格曼云杉(P.engelmannii)

　　美国

　　锈孢子阶段

　　白云杉(P.glauca)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　白云杉(P.glauca)

　　美国

　　锈孢子阶段

　　黑云杉(P.mariana)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　垂枝蓝云杉(P.pungens)

　　美国

　　锈孢子阶段

　　红云杉(P.rubens)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　巨云杉(P.sitchensis)

　　加拿大

　　锈孢子阶段

　　巨云杉(P.sitchensis)

　　美国

　　锈孢子阶段

　　A. 2 为害症状

　　在云杉属上，最初的症状是夏天针叶变白。休眠芽的萌动产生显著而紧密的丛枝(四季皆可发生)，丛枝着生黄绿色针叶，在表皮下产生气味难闻的性孢子。接着产生锈孢子，使丛枝呈橘黄色。针叶随即死亡，并在秋天脱落，剩下的丛枝在冬季死亡。有时在主干和侧枝上形成溃疡、纺锤形肿胀和次生丛枝。树失去活力，并普遍发生枯梢、死枝及死树。极少数情况下，在云杉林中有 25% 以上的树被侵染;产生丛枝的树少于 1%。非锈菌引起的针叶树丛枝病的叶全年都保持正常的暗绿色;只有少数针叶脱落。

　　在熊果上，春末，锈病最引人注目，能产生棕褐色的叶斑，在叶背面的病斑上，产生成群的橘黄褐色、蜡质的冬孢子堆。春末，在云杉的当年生针叶上产生大量的性孢子。病原菌侵染主干和枝干的树皮和外层木质部。锈孢子产生在夏天，并侵染熊果 Arctostaphylos uva-ursii。产生在熊果上的冬孢子在入夏后可侵染云杉。见图 A . 1、图 A . 2。

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　　a) 云杉帚绣菌侵染云杉后形成的从枝

　　

　　b) 枝干和叶片呈棕黄色或橘黄色

　　c) 云杉叶片上的云杉帚锈病菌的锈孢子堆特征图 A. 1 云杉帚锈病菌症状

　　图 A. 2 长有云杉帚锈病菌冬孢子堆的熊果叶片

　　A. 3 传播途径

　　该病菌锈孢子随气流传播，随木材的运输进行远距离传播。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　云杉帚锈病菌孢子形态

　　云杉帚锈病菌孢子形态见图 B . 1。

　　a) 黑云衫叶上的锈孢子(比例尺=100 μm ) b) 锈孢子(比例尺=20 μm )

　　c) 冬孢子(比例尺=20 μm )

　　图 B. 1 云杉帚锈病菌形态特征

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　核糖体 DNA 序列分析

　　C. 1 总 DNA 提取

　　取约 0. 1 g 植物组织，加入研钵，在液氮中研磨至粉末，转移至1. 5 mL 离心管中。在离心管中加入300 μL~500 μL CTAB 缓冲液(其中含 0. 1 g 蛋白酶 K)混匀，65 ℃水浴 1 h;13 000 g 离心5 min~10 min，保留上清液 ;加 500 μL 三氯甲烷∶异戊醇(体积比为 24∶1)混匀，13 000 g 离心 5 min~10 min，保留上清液;再加 500 μL 三氯甲烷∶异戊醇(体积比为 24∶1)混匀，13 000 g 离心 5 min~10 min，保留上清液;加入1 mL 异丙醇混匀，-70 ℃ 下放置 1 h，或-20 ℃ 过夜;13 000 g 离心 30 min，可见 DNA 沉淀;70%(体积分数)乙醇洗 DNA 沉淀，室温干燥;用 30 μL~50 μL Tris-EDTA 缓冲液溶解 DNA，待用。

　　也可采用其他合适的核酸提取方法或核酸提取试剂盒。

　　C. 2 引物序列

　　引物序列见表 C . 1。

　　表 C. 1 引物序列

　　序号

　　引物名称

　　引物序列(5 ’– 3’)

　　扩增片段

　　片段大小

　　1

　　ITS4-BRf

　　GGACCATGTACAAGTCTGTTGA

　　LSU

　　750 bp 左右

　　LR5

　　TCCTGAGGGAAACTTCG

　　2

　　ITS5

　　GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

　　ITS

　　710 bp 左右

　　ITS4BR

　　TCAACAGACTTGTACATGGTCC

　　注： 两组引物退火温度均为 55 ℃ 。

　　C. 3 PCR 反应体系及参数

　　C. 3. 1 PCR 反应体系

　　反应体系见表 C . 2。

　　表 C. 2 PCR 反应体系

　　试剂名称

　　加样量/μL

　　10×PCR 缓冲液

　　2.5

　　2.5 mmol/L dNTP

　　2.0

　　10 μmol/L 上游引物

　　1.0

　　10 μmol/L 下游引物

　　1.0

　　5 U/μL Taq DNA 聚合酶

　　0.2

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　　表 C. 2 PCR反应体系(续)

　　试剂名称

　　加样量/μL

　　模板 DNA

　　2.0

　　双蒸水

　　16.3

　　总体积

　　25.0

　　注： 可根据采用的试剂或实验需要调整反应体系。

　　C. 3. 2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置合理设置阴性对照、阳性对照和空白对照。

　　C. 3. 3 PCR 的反应条件

　　94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35 个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。可根据仪器或试剂要求适当调整反应参数。

　　C. 4 琼脂糖凝胶电泳

　　将产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。

　　C. 5 结果判定

　　阳性对照出现预期大小条带，阴性对照和空白对照未出现预期大小条带，待测样品出现和阳性样品一致的条带(750 bp 或 710 bp)，则 PCR 结果为阳性。

　　阳性对照出现预期大小条带，阴性对照、空白对照和待测样品无预期大小条带，则 PCR 结果为阴性。

　　C. 6 序列分析

　　对 PCR 产物进行测序，然后进行 BLAST 等分析，以确定是否为云杉帚锈病菌序列。

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　云杉帚锈病菌凭证标本清单

　　物种名称

　　标本号

　　寄主

　　采集地

　　ITS 的 GenBank登录号/

　　BOLD 号

　　LSU 的 GenBank登录号/BOLD 号

　　Chrysomyxa

　　arctostaphyli

　　HMAS44308

　　Picea mariana

　　加拿大

　　OR035555

　　OR039474

　　C.arctostaphyli

　　Solh.M.Sax.E.0501

　　Arctostaphylos

　　uva‑ursi

　　美国

　　OR035558

　　—

　　C.arctostaphyli

　　1299CHA PCE WY/DAOM

　　114950

　　P.engelmanii

　　美国

　　CHITS050-08

　　CHITS050-08

　　C.arctostaphyli

　　1300CHA PCM YU/DAOM

　　179147

　　P.mariana

　　加拿大

　　GU049493

　　—

　　C.arctostaphyli

　　1301CHA ARU KE/DAOM

　　183586

　　Arc.uva‑ursi

　　加拿大

　　GU049494

　　—

　　C.arctostaphyli

　　501CHA PCM YU8/DAOM

　　229628

　　P.mariana

　　加拿大

　　CHITS040-08

　　CHITS040-08

　　C.arctostaphyli

　　503CHA PCG NO1

　　P.glauca

　　加拿大

　　CHITS041-08

　　CHITS041-08

　　C.arctostaphyli

　　AFTOL ID 442

　　Arc.sp.

　　加拿大

　　DQ200930

　　AY700192

　　C.arctostaphyli

　　CharPe 1

　　P.engelmannii

　　-

　　L76488

　　—

　　C.arctostaphyli

　　PBM 2708

　　P.sp.

　　美国

　　EF561640

　　EF561640

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　云杉帚锈病菌条形码标准序列

　　E. 1 rDNA 28S 序列信息及图像化条形码(illustrative barcode;GenBank 登录号：GU049543 . 1)：

　　CCGTATATGATATGGACTACCAGGGCAATGTGATACAGTCTCTAAGAGTCGAGTTG TTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATAGGTGAGA GACCGATAGCAAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGAACTTTGGAAAGAGAGTTA ACAGTACGTGAAATTGTTAAAAGGGAAACATTTGAAGTTAGACTTGTTATTGTTGGTTC AGCTCTTTTTATAAGGGTGTATTCCGATGGTTAACAGACCAGCATCAATTTTTGAGTGT TAGATAAGGGTCTTGAGAATGTAGCAACCTTGGTTGTGTTATAGATCTTGACTTGATAT AATGCTTAGGATTGAGGAATGCAGTGAGCTTCTCTTTTGAAGTGGATGTTTTTAATGTC TTCTCACTACGGATGTTGGTGTAATAGCTTTAAATGACCCGTCTTGAAACACGGACCAA GGAGTCTAACATGCTTGCGAGTATTTGGGTGTTGAAACCCTTATGCGTAATGAAAGTGA ATGTAAATGAGATCCTTAACGGGTGCATCATTGACCAGTCCTGATTATTTATATGAAGG TACTGAGTAAGAGCAAGTATGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGG TGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAAGCTCGTAGCGGTTCTGACGTGCA

　　0 694

　　E. 2 rDNA ITS 序列信息及图像化条形码(illustrative barcode;GenBank 登录号：GU049496 . 1)：

　　TTTTAAGAGTGCACTTCATTGTGGCTCTAACCTTTTACAATGTACTTTTCACCCTTT TTTTTAAACCCAAAACTGTTATGTGTACCTTTTTTTGGTATAGCATCTCAGTAGTACGC ATCATGTGAATTTTTAATTCACAAGTTGCATTACCCCCTTTTTTGAAATTAACACTATA AAAAGTTCTAAGAATGTAAACCCCCTTTAAATTATATAACTTTTAACAATGGATCTCTT GGCTCTCACATCGATGAAGAACACAGTGAAATGTGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACCTTGCACCTTTTGGATATTCCGAAAGGTACA

　　CCTGTTTGAGTGTCATGAAACCCTCTCATTTCAATTTTATATATATAATATTGAGAAGT TGAAATGGATGTTGGGTGTTGCTGTTATTGGCTCACCTTAAATATATAAGTACTTTTAT TGCAAAAATAAATGGATATACTTGGTGTAATATTTATTATTCATTGAGGAGTGTGGTGC CTGAAAAATACTACAGCCATTTGACTTTTGATAGATAGCTTCCGAACCCCAATGTATAT TATATTTTTAGACCTCAAATCAGGTGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG CGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGAAAAGCC

　　0 705

　　注： 云杉帚锈病菌条形码序列及图像化条形码参考章桂明等(2023)。

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　　参 考 文 献

　　[1] 中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，中华人民共和国农业部公告第 862 号，2007

　　[2] 章 桂 明 ，高 瑞 芳 ，赵 鹏 ，等 . 检 疫 性 真 菌 DNA 条 形 码 鉴 定 技 术[M]. 北 京 ：中 国 农 业 出 版 社 ， 2023.

　　[3] Aime MC，Toward resolving family-level relationships in rust fungi(Uredinales)，Mycoscience， 2006，47：112-122.

　　[4] Cummins GB，Hiratsuka Y，Illustrated genera of rust fungi，3rd edn，American Phytopathological Society，St. Paul，Minnesota，2003.

　　[5] Feau N，Vialle A，Allaire M ，Maier W ，Hamelin RC . DNA barcoding in the rust genus Chryso- myxa and its implications for the phylogeny of the genus . Mycologia，2011，103：1 250-1 266 .

　　[6] OEPP/EPPO Data sheets on quarantine organisms No . 8，Chrysomyxa arctostaphyli. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin . 1979，9(2).

　　[7] Savile，DBO . North American species of Chrysomyxa . Canadian Journal of Research，1950. 28， 318-330.

　　[8] Sydow P，Sydow H . Monographia Uredinearum . Ⅲ：Melampsoraceae，Zaghouaniaceae，Coleospo- riaceae. Borntraeger，Leipzig，Germany，1915.

　　[9] Zhao P，Qi XH，Crous PW ，Duan WJ，Cai L，Gymnosporangium species on Malus：species delin- eation，diversity and host alternation，Persoonia，2020，45：68-100 .

　　[10] Zhao P，Zhang ZF，Hu DM ，Tsui KM ，Qi XH，Phurbu D，Gafforov Y，Cai L . Contribution to rust flora in China I，tremendous diversity from natural reserves and parks，Fungal Diversity，2021，110，1-58.

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