GB/T 24828-2009 穿刺根腐线虫检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 24828—2009

　　穿刺根腐线虫检疫鉴定方法

　　Methodsforquarantineand identification ofpratylenchuspenetrans

　　2009-12-15 发布 2010-06-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 24828—2009

　　前 言

　　本标准的附录 A 、附录 B均为规范性附录 。

　　本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归 口 。

　　本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中国检验检疫科学院 。

　　本标准主要起草人：戚龙君 、葛建军 、宋绍祎 、孙红 、郑建中 。

　　Ⅰ

　　GB/T 24828—2009

　　穿刺根腐线虫检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本标准规定了对穿刺根腐线虫检疫和鉴定方法 。

　　本标准适用于花卉 、观赏植物 、蔬菜 、烟草 、果树 、豆科 、禾本科等多种植物根部和土壤及栽培介质中的穿刺根腐线虫 。

　　2 鉴定依据

　　穿刺根腐线虫英文名：Root-Lesion Nematode

　　学名：pratylenchuspenetrans (Cobb , 1917) Filipjev & Schuurmans Stekhoven , 1941

　　异名：Tylenchuspenetrans Cobb , 1917

　　Anguillulina(pratylenchus)penetrans(Cobb) Goodey , 1932

　　TylenchusgulosusKühn , 1890

　　pratylenchusgulosus (Kühn) Filipjev & Schuurmans Stekhoven , 1941

　　分类地位：线 虫 门 (Nemata) 、侧 尾 腺 纲 (Secernentea) 、垫 刃 目 (Tylenchida) 、根 腐 线 虫 科 (Praty- lenchidae) 、根腐线虫属(pratylenchus)

　　穿刺根腐线虫是一种根部迁移性内寄生线虫，被侵染的植株呈现如下特征：

　　a) 地上部分表现为生长不良，发生矮化 、褪绿，过早凋萎甚至死亡，产量减少;

　　b) 地下部分引起根部变褐色 、坏死，根茎和块茎往往也会遭受侵害;

　　c) 幼虫和成虫都可 以 侵 入 寄 主 根 部 组 织，在 病 痕 区 和 健 康 组 织 的 交 界 处 可 见 各 个 发 育 阶 段 的线虫 。

　　该线虫危害 350 多种植物，主要分布在温带地区 。它的形态学特征是该检疫鉴定方法的依据 。

　　3 仪器 、用具

　　3 . 1 生物显微镜(40 × 以上)。

　　3 . 2 生物体视显微镜(10×以上，具透射光源)。

　　3 . 3 电热恒温箱 。

　　3 . 4 载玻片和凹玻片 。

　　3 . 5 盖玻片 。

　　3 . 6 分样筛(100 目 、500 目)。

　　3 . 7 烧杯(500 mL 、1 000 mL) 。

　　3 . 8 漏斗 。

　　3 . 9 漏斗架 。

　　3 . 10 乳胶管或硅胶管 。

　　3 . 1 1 止水夹 。

　　3 . 12 小镊子 。

　　3 . 13 剪刀 。

　　3 . 14 挑针 。

　　3 . 15 浅盘 。

　　3 . 16 线虫滤纸或卫生纸 。

　　1

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　　3 . 17 酒精灯 。

　　3 . 18 钟面皿或培养皿 。

　　3 . 19 加热板 。

　　3 . 20 干燥器 。

　　3 . 2 1 试管 。

　　4 药品

　　4 . 1 中性树胶 。

　　4 . 2 4%甲醛 。

　　4 . 3 指甲油 。

　　4 . 4 乳酚油(苯酚 20 mL、乳酸 20 mL、甘油 40 mL 和蒸馏水 20 mL混合而成)。

　　4 . 5 石蜡 。

　　5 现场检疫

　　5 . 1 抽样

　　5 . 1 . 1 抽样方法

　　棋盘式 、五点式或随机抽样 。

　　5 . 1 . 2 抽样数量

　　按总件数的 5% ~ 20%抽样，最低抽检 10 件且不少于 500 株(个)。采集样品数量见表 1 。

　　表 1 采集样品数量表

　　总株(个)数，N

　　采集样品株(个)数

　　N≤50

　　5

　　51≤N≤200

　　10

　　201≤N≤1 000

　　15

　　1 001≤N≤5 000

　　20

　　5 001≤N≤10 000

　　25

　　N>10 000

　　在 30 的基础上，每增加 5 000 株(个)增取 5 株(个)

　　5 . 2 外观症状的检查

　　5 . 2 . 1 对花卉 、观赏植物 、烟草 、果树 、蔬菜 、豆科 、禾本科等根茎部分进行检查，注意检查有否变褐和坏死等症状 。

　　5 . 2 . 2 收集上述可疑根部材料及所夹带的土壤或包装介质材料等和采集的样品一并送实验室进行穿刺根腐线虫的检验 。

　　6 实验室检验

　　6 . 1 样品分离

　　对于抽取的样品，仔细检查根部，尽量选取有变褐和坏死等症状的根及根围介质作为分离样品 。

　　6 . 2 线虫分离

　　用浅盘分离法或漏斗法分离线虫，详见附录 A 。

　　6 . 3 体视显微镜检查

　　分离获得的水样在生物体视显微镜下检查 。

　　6 . 4 显微镜检查

　　挑取线虫若干条制成临时玻片在生物显微镜下镜检，观察线虫的形态结构 。

　　2

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　　7 形态鉴定特征

　　7 . 1 根腐线虫属形态鉴定特征

　　7 . 1 . 1 雌雄虫共同特征

　　a) 雌雄同型，蠕虫状;体环明显，虫体粗短(体长 300 μm ~ 900 μm) ;

　　b) 头部低平(高度通常小于头基环直径的二分之一)，有 2 个 ~ 4 个唇环，头部连续到略缢缩，头架骨化显著;

　　c) 口针粗短，长 11 μm ~ 22 μm,基部球发达;

　　d) 背食道腺开口位于口针基部球后约 2 μm ~ 4 μm 。食道腺叶短，从腹面和侧面覆盖肠前端;

　　e) 侧区有 4 条 ~ 8 条侧线，通常有 4 条 。

　　7 . 1 . 2 雌虫

　　单生殖腺 、前伸，后阴子宫囊通常短于 2 个阴门处体宽 。尾长是肛门处体宽的 2 倍 ~ 3 倍，尾圆锥形，末端钝圆(很少尖)。

　　7 . 1 . 3 雄虫

　　交合刺骨化 、稍弯，引带不伸出泄殖腔，交合伞延伸到尾端 。

　　7 . 2 根腐线虫形态鉴定特征

　　7 . 2 . 1 测计值

　　穿刺根腐线虫的测量数据见表 2 。

　　表 2 穿刺根腐线虫测计值

　　项 目

　　L/μm

　　a

　　b

　　c

　　V/%

　　T/%

　　S/μm

　　雌虫

　　343 ~ 811

　　19 ~ 32

　　5 . 3 ~ 7 . 9

　　15 ~ 24

　　75 ~ 84

　　—

　　15 ~ 17

　　雄虫

　　305 ~ 574

　　23 ~ 34

　　5 . 4 ~ 7 . 3

　　16 ~ 22

　　—

　　36 ~ 58

　　13 ~ 16

　　注：L=体长;a=体长/最大体宽;b=体长/自头顶至食道与肠连接处的长度;S = 口针长;

　　c=体长/尾长;V=头顶至阴门处长度/体长 ×100;T=精巢长度/体长 × 100 。

　　7 . 2 . 2 形态描述

　　7 . 2 . 2 . 1 雌虫

　　a) 热杀死时虫体近直线形，虫体中等大小，体表环纹较细，侧线四条，中食道球近圆形，宽度为该处体宽的一半 。食道腺从腹面覆盖肠的前端，覆盖长度为 30 μm ~ 40 μm 。排泄孔约在食道-肠交界的相对位置上，离虫体前端 74 μm ~ 101 μm 处，见图 1 中的 I ;

　　b) 头 架 发 达，唇 区 稍 高，稍 缢 缩，唇 环 三 个，口 针 基 部 球 宽 圆 形，背 食 道 腺 开 口 在 口 针 基 部 球

　　2 . 5 μm,见图 1 中的 B ;

　　c) 受精囊近圆形，内充满精子，宽为该处体宽的三分之二 。 阴道直且短，长约为阴门处体宽的四分之一 。后阴子宫囊短，长约为阴门处体宽的 1 倍 ~ 1 . 5 倍 。肛门与阴门的距离约为尾长的2 . 5 倍，见图 1 中的 C ;

　　d) 尾近圆筒形，末端 光 滑(偶 尔 有 一 个 至 两 个 线 纹)，尾 腹 面 有 15 条 ~ 27 条 体 环，见 图 1 中 的D 、E 。

　　7 . 2 . 2 . 2 雄虫

　　a) 与雌虫体形相似，普遍发生，见图 1 中的 A 、H ;

　　b) 侧线四条，排泄孔约在离虫体前端 66 μm ~ 79 μm 处，见图 1 中的 H ;

　　c) 交合刺骨化略成弓形，长为 14 μm ~ 17 μm;引带长为 3 . 9 μm ~ 4 . 2 μm;交合伞包到尾端，见图 1 中的 F 、G 。

　　3

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　　A— 雌虫头部;

　　B— 雄虫头部;

　　C— 雌虫阴门区和尾; D , E— 雌虫尾端;

　　F— 雄虫尾部腹面;

　　G— 雄虫尾部侧面; H — 雄虫整体;

　　I— 雌虫整体 。

　　图 1 穿刺根腐线虫形态特征(仿 corbett，1973)

　　4

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　　8 结果判定

　　符合第 7 章形态特征的可鉴定为穿刺根腐线虫 。鉴定过程应注意该线虫与咖啡根腐线虫 、伤残根腐线虫和卢斯根腐线虫的形态区别，四者的主要区别见表 3 。

　　表 3 四种主要根腐线虫的主要形态区别对照表

　　根腐线虫种

　　唇环数

　　口针长度/ μm

　　侧线数

　　受精囊形状

　　尾形

　　后阴子宫囊

　　长度/μm

　　穿刺根腐线虫

　　3

　　15 ~ 17

　　4

　　近圆形

　　锥形，末端钝园 、无纹

　　1 倍 ~ 1 . 5 倍阴门处体宽

　　咖啡根腐线虫

　　2

　　15 ~ 18

　　4(个别 5 条 ~ 6 条)

　　长卵圆形

　　亚园柱形 、末端无纹

　　17 ~ 50

　　伤残根腐线虫

　　3 ~ 4

　　13 ~ 19

　　4

　　长椭圆形

　　锥形，尾尖细园

　　21 ~ 64

　　卢斯根腐线虫

　　2

　　14 ~ 18

　　4(个别 5 条 ~ 6 条)

　　长卵形

　　锥形，尾端无纹 、钝尖

　　18 ~ 26

　　9 样品保存

　　9 . 1 若鉴定为穿刺根腐线虫，则将剩余的线虫杀死 、固定制成永久玻片保存，制作方法详见附录 B;也可以固定后放入含 4%甲醛液的指形管内长期保存 。

　　9 . 2 对已鉴定出带有穿刺根腐线虫的植物材料，经登记后，要保存在 5 ℃ ~ 10 ℃及干燥 、防鼠防虫处，并标明样品编号 、截获日期 、截获人 、寄主名称 、运输工具名称 、输出国名等，样品需至少保存 6 个月，以备复验 、谈判和仲裁 。

　　5

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　穿刺根腐线虫的分离法

　　A.1 漏斗法

　　首先将 10 cm ~ 15 cm 直径的漏斗固定在支架上(见图 A. 1) ,柄端接一段乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧 。将分离的样品先剪成小块，用纱布包好，放入漏斗，加水淹没 。分离土壤中的线虫，在漏斗内加一只不锈钢或塑料的网，将纱布铺在筛网上，再放入样品 。在线虫 自身的趋水性和重量作用下，线虫不断脱离植物组织和土壤等，穿过纱布迁游到水中，最后沉降到漏斗末端的乳胶管下端水中 。24 h 后，小心地打开乳胶管末的止水夹，用小器皿接取约 5 mL 的含有线虫的水样，放在生物体视显微镜下进行观察 。用此法分离线虫时，室内温度最好要保持在 21 ℃ ~ 24 ℃ ,温度太高或太低均会影响穿刺根腐线虫的分离效果 。

　　1 — 漏斗;

　　2 — 用纱布包裹的样品;

　　3 — 乳胶管;

　　4 — 止水夹 。

　　图 A.1 Baermann漏斗装置

　　A.2 浅盘分离法

　　浅盘分离法装置(见图 A. 2)由两只不锈钢浅盘 、线虫滤纸或卫生纸组成，两只浅盘可套放，上盘底面为大于 10 目 的粗筛网，下盘为正常浅盘 。

　　分离线虫时，将线虫滤纸平放在上盘的筛网上，用水淋湿，将供分离的已剪成小块的样品撒铺在其上，套进下盘内;从两只浅盘的夹缝中注水，以淹没供分离的样品为宜;在 21 ℃ ~ 24 ℃下放置 24 h 后，线虫渐渐集中到下盘的水中;用烧杯收集浅盘中水，并将烧杯中的水连续通过 100 目和 500 目 的筛网，将 500 目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到培养皿中镜检 。

　　1 — 上盘;

　　2 — 下盘 。

　　图 A.2 浅盘分离装置

　　6

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　穿刺根腐线虫玻片标本制作方法

　　B.1 线虫杀死

　　在生物体视显微镜下，用线虫挑针挑取少量线虫放至凹玻片上的水滴中，使线虫位于水滴中央 。手持凹玻片在酒精灯火焰上来回 5 s ~ 6 s,使线虫恰好被杀死为止 。杀死大量的线虫，可将线虫悬浮液放在试管中加等量的沸水杀死线虫 。

　　B.2 线虫固定

　　少量线虫被杀死后，可用线虫挑针将线虫移至 4%甲醛液中固定 。 大量的线虫被杀死后，在线虫悬浮液中加等量浓度双倍的固定液即可 。

　　B.3 临时玻片标本的制作

　　以 4%甲醛液作为浮载剂，滴适量于载玻片上 。用挑针将固定好的线虫移数条于浮载剂中，并使其完全沉下 。浮载剂边缘均匀放置 3 mm ~ 5 mm长 、直径与线虫体宽相近的玻璃纤维丝 3 根，加盖玻片 。用滤纸吸去溢出的浮载剂，用指甲油封片 。待指甲油干后再加封一次，可保存几天至数周 。

　　B.4 永久玻片标本的制作

　　B.4 . 1 脱水

　　采用乳酚油快速脱水法(Franklin & Goodey,1949),把滴有乳酚油的凹玻片放在加热板上，加热至65 ℃ ~ 70 ℃ 。将已固定 1 d 以上的线虫挑入热的乳酚油中，继续加热 2 min ~ 3 min后，在生物体视显微镜下观察标本是否清晰 。若不够清晰，继续在 65 ℃ ~ 70 ℃的加热板上加热片刻至清晰(注意避免加热过度而损坏标本)。然后放在干燥器中 12 h ~ 24 h ,进一步去除水分后即可制片 。

　　B.4 . 2 制片

　　将直径 1 . 5 cm 的打孔器在酒精灯火焰上加热后，插到蜡盘中蘸取少量石蜡，并迅速轻按于载玻片中央 。待冷却后即形成一个蜡圈 。在蜡圈内滴一小滴乳酚油(用量以盖上盖玻片后不外溢为宜)作为浮载剂，将已脱水的线虫数条挑入其中，排列整齐，并使其完全沉下 。将与线虫体宽相近的 3 根 3 mm ~ 5 mm 的玻璃纤维丝均匀置于浮载剂边缘，加盖玻片后，将载玻片移至 65 ℃ ~ 70 ℃的加热板上熔蜡，待蜡熔化后移至实验台上冷却 。用指甲油封片，待指甲油干后再封一次 。最后贴上标签，左边的标签写明样品号 、寄主 、截获口岸 、产地 、制作日期;右边的标签写线虫种名 、线虫虫态及其数量 。