GB/T 21674-2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

　　ICS 1 1 . 220 B 4 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21674—2008

　　猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

　　Detecting porcinecircoviruswith polymerasechain reaction

　　2008-04-09 发布 2008-06-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21674—2008

　　前 言

　　本标准附录 A 为规范性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位：农业部兽医诊断中心 。

　　本标准主要起草人： 田克恭 、王宏伟 、孙明 、王传彬 、陈西钊 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21674—2008

　　引 言

　　猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒 Ⅰ 型(porcine circovirus typel , PCV-1)和有致病性的猪圆环病毒 Ⅱ 型(porcine circovirus type2 , PCV-2) 。PCV-2 是引发仔猪断奶后多系统衰弱综合征(post-weaning multisystem wasting syndrome, PMWS)的主要病原 。该病主要以患畜生长迟缓 、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定的经济损失 。

　　Ⅱ

　　GB/T 21674—2008

　　猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法

　　1 范围

　　本标准规定了猪圆环病毒(PCV)聚合酶链反应(PCR) 检测方法的技术要求 。

　　本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测，以及其 Ⅰ 型(PCV-1)和 Ⅱ 型(PCV-2)的鉴别 。

　　2 实验室生物安全要求

　　试验操作应在生物安全 Ⅱ 级(BSL-2 级)以上的实验室进行 。

　　3 实验材料 、仪器设备和试剂

　　3 . 1 实验材料

　　眼科剪 、眼科镊 、称量纸 、10 mL一次性注射器 、1 . 5 mL灭菌离心管 、0 . 2 mL 薄壁 PCR 管 、琼脂糖 、 500 mL量筒 、500 mL锥形瓶 、吸头(10 μL、200 μL、1 000 μL) 、灭菌双蒸水 。

　　3 . 2 仪器设备

　　分析天平 、高速离心机 、真 空 干 燥 器 、PCR 扩 增 仪 、电 泳 仪 、电 泳 槽 、紫 外 凝 胶 成 像 仪(或 紫 外 分 析仪)、液氮罐或 -70℃冰箱 、微波炉 、组织研磨器、-20℃冰箱 、水浴锅 、可调移液器(最大量程为 2 μL 、 20 μL、200 μL、1 000 μL) 。

　　3 . 3 试剂

　　本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯 。

　　3 . 3 . 1 消化液(见第 A. 1 章)。

　　3 . 3 . 2 2%蛋白酶 K 溶液(见第 A. 2 章)。

　　3 . 3 . 3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液(见第 A. 3 章)。

　　3 . 3 . 4 2 . 5 mmol/L dNTP(见第 A. 4 章)。

　　3 . 3 . 5 10 pmol/μL PCV 引物(见第 A. 5 章)。

　　3 . 3 . 6 0 . 5 U/μL Taq DNA 聚合酶(见第 A. 6 章)。

　　3 . 3 . 7 10 倍 PCR缓冲液(见第 A. 7 章)。

　　3 . 3 . 8 溴化乙锭(EB)溶液(见第 A. 8 章)。

　　3 . 3 . 9 电泳缓冲液(50 倍)(见第 A. 9 章)。

　　3 . 3 . 10 1%琼脂糖凝胶(见第 A. 10 章)。

　　3 . 3 . 1 1 上样缓冲液(见第 A. 11 章)。

　　3 . 3 . 12 异丙醇 。

　　3 . 3 . 13 75%乙醇(见第 A. 12 章)。

　　3 . 3 . 14 15 mmoL/L氯化镁(见第 A. 13 章)。

　　3 . 3 . 15 灭菌双蒸水(见第 A. 14 章)。

　　3 . 3 . 16 电泳缓冲液(1 倍)(见第 A. 15 章)。

　　4 操作程序

　　4 . 1 样品的采集与处理

　　4 . 1 . 1 样品的采集：濒死猪 、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结;幼龄猪取心脏;待检活猪，用注射器取血 2 mL ~ 4 mL,立即送往实验室 。

　　1

　　GB/T 21674—2008

　　4 . 1 . 2 样品的处理：每份样品分别处理

　　4 . 1 . 2 . 1 组织样品处理：取待检病料约 0 . 2 g 置研磨器中剪碎并研磨，加入 2 mL 消化液(3 . 3 . 1) 继续研磨 。取已研磨好的待检病料上清 100 μL,置 1 . 5 mL灭菌离心管中，再加入 500 μL 消化液(3 . 3 . 1)和10 μL2%蛋白酶 K 溶液(3 . 3 . 2) ,混匀后，置 55℃水浴中 4 h ~ 16 h 。

　　4 . 1 . 2 . 2 血清样品处理：待血液凝固后，取上清放于离心管中，4℃ 8 000 g 离心 5 min,取上清 100 μL ,置 1 . 5 mL灭菌离心管中，加 入 500 μL 消 化 液 (3 . 3 . 1) 和 10 μL2%蛋 白 酶 K 溶 液 (3 . 3 . 2) ,混 匀，置55℃水浴中 4 h ~ 16 h 。

　　4 . 1 . 2 . 3 阳性对照处理：分别取 PCV-1 和 PCV-2 细胞培养液各 100 μL,置 1 . 5 mL 灭菌离心管中，每管加入 500 μL 消化液(3 . 3 . 1)和 10 μL2%蛋白酶 K 溶液(3 . 3 . 2) ,混匀，置 55℃水浴中 4 h ~ 16 h 。

　　4 . 1 . 2 . 4 阴性对照处理：取灭菌双蒸水 100 μL,置 1 . 5 mL灭菌离心管中，加入 500 μL 消化液(3 . 3 . 1)

　　10 μL2%蛋白酶 K 溶液(3 . 3 . 2) ,混匀，置 55℃水浴中 4 h ~ 16 h 。

　　4 . 2 DNA模板的提取

　　4 . 2 . 1 取出已处理的待 检 样 品 及 阴 性 、阳 性 对 照 样 品，每 管 加 入 600 μL 酚-三 氯 甲 烷-异 戊 醇 混 合 液(3 . 3 . 3) ,用力颠倒 10 次混匀，13 000 g 离心 10 min 。

　　4 . 2 . 2 取上清 500 μL 置 1 . 5 mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇(3 . 3 . 12) ,混匀，置液氮中 3 min或

　　-70℃冰箱中 30 min 。取出离心管，室温融化，4℃ 20 000 g 离心 15 min 。

　　4 . 2 . 3 弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 1 mL -20℃预冷的 75%乙醇(3 . 3 . 13) 溶液，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min,真空抽干 15 min 。

　　4 . 2 . 4 取出离心管，用 50 μL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用 。

　　4 . 3 PCR扩增

　　每管取灭菌双蒸水 8 μL , 2 . 5 mmol/L dNTP(3 . 3 . 4) 、10 pmol/μL PCV 引物(3 . 3 . 5) 、15 mmol/L氯化镁(3 . 3 . 14) 、10 倍 PCR缓冲液(3 . 3 . 7) 、0 . 5 U/μL Taq DNA 聚合酶(3 . 3 . 6) 各 2 μL , DNA 模板2 μL,混匀，作好标记，加入矿物油约 20 μL,覆盖(有热盖的 自动 DNA 热循环仪不用加矿物油)。扩增条件为 94℃ 30 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s , 35 个循环后，72℃延伸 10 min 。

　　4 . 4 电泳

　　将 PCR 扩增产物 15 μL 与 3 μL上样缓冲液(3 . 3 . 11)混合，点样于 1%琼脂糖凝胶(3 . 3 . 10) 孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入 100 bp Ladder Marker(分子质量标准物)，以 5 V/cm 电压电泳40 min ,紫外凝胶成像仪下观察结果 。

　　5 结果判定

　　当 PCV-1 阳性对照出现 652 bp 扩增带，PCV-2 阳性对照出现 1 154 bp 扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立 。被检样品出现 652 bp 扩增带为 PCV-1 阳性，出现 1 154 bp 扩增带为 PCV-2阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性 。

　　2

　　GB/T 21674—2008

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　试剂的配制

　　A.1 消化液

　　A.1 . 1 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷 盐酸(TrisHCL)(PH8 . 0)

　　三羟基甲基氨基甲烷

　　12 . 11 g

　　灭菌双蒸水

　　80 mL

　　浓盐酸

　　调 pH 至

　　8 . 0

　　灭菌双蒸水

　　加至 100

　　mL

　　A.1 . 2 0 . 5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(PH8 . 0)

　　二水乙二铵四乙酸二钠

　　18 . 61 g

　　灭菌双蒸水

　　80 mL

　　氢氧化钠

　　调 pH 至

　　8 . 0

　　灭菌双蒸水

　　加至 100

　　mL

　　A.1 . 3 20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(PH7 . 2)

　　十二烷基硫酸钠

　　20 g

　　灭菌双蒸水

　　80 mL

　　浓盐酸

　　调 pH 至

　　7 . 2

　　灭菌双蒸水

　　加至 100

　　mL

　　A.1 . 4 消化液

　　1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)(pH8 . 0)

　　2 mL

　　0 . 5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8 . 0)

　　0 . 4 mL

　　20%十二烷基硫酸钠溶液(pH7 . 2)

　　5 mL

　　5 mol/L氯化钠

　　4 mL

　　灭菌双蒸水

　　加至 200

　　mL

　　A.2 2%蛋白酶 K 溶液

　　蛋白酶 K(分析纯)

　　5 g

　　灭菌双蒸水

　　加至 250

　　mL

　　A.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液

　　碱性酚

　　25 mL

　　三氯甲烷

　　24 mL

　　异戊醇

　　1 mL

　　A.4 2 . 5 mmol/L dNTP

　　dATP(100 mmol/L)

　　20 μL

　　dTTP(100 mmol/L)

　　20 μL

　　dGTP(100 mmol/L)

　　20 μL

　　dCTP(100 mmol/L)

　　20 μL

　　灭菌双蒸水

　　加至 800

　　μL

　　3

　　GB/T 21674—2008

　　A.5 10 Pmol/μLPCV引物

　　引物序列：

　　P1 :5 ’-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3 ’

　　P2 :5 ’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3 ’

　　P3 :5 ’-ACCCCCGCCACCGCTACC-3 ’

　　上游引物 P1 (2 OD260 )加入 375 . 4 μL灭菌双蒸水溶解，下游引物 P2 (2 OD260 ) 加入 326 . 6 μL 灭菌双蒸水溶解，下游引物 P3 (2 OD260 )加入 401 . 9 μL灭菌双蒸水溶解，分别取 P1 、P2 、P3 溶液各300 μL,混匀即为 10 pmol/μL PCV 引物 。

　　A.6 0 . 5 U/μL Taq DNA聚合酶

　　5 U Taq DNA 聚合酶 1 μL

　　灭菌双蒸水 加至 10 μL

　　现用现配 。

　　A.7 10 倍 PCR缓冲液

　　A.7 . 1 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)(PH9 . 0)

　　羟基甲基氨基甲烷(分析纯) 15 . 8 g

　　灭菌双蒸水 80 mL

　　浓盐酸(分析纯) 调 pH 至 9 . 0

　　灭菌双蒸水 加至 100 mL

　　A.7 . 2 10 倍 PCR缓冲液

　　1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)(pH9 . 0) 1 mL

　　氯化钾(分析纯) 0 . 373 g

　　曲拉通 X-100(分析纯) 0 . 1 mL

　　灭菌双蒸水 加至 100 mL

　　A.8 溴化乙锭(EB)溶液

　　溴化乙锭 0 . 2 g

　　双菌双蒸水 加至 20 mL

　　A.9 电泳缓冲液(50 倍)

　　A.9 . 1 0 . 5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(PH8 . 0)

　　二水乙二铵四乙酸二钠(分析纯) 18 . 61 g

　　灭菌双蒸水 80 mL

　　氢氧化钠 调 pH 至 8 . 0

　　灭菌双蒸水 加至 100 mL

　　A.9 . 2 TAE(三羟甲基氨基甲烷-乙酸)电泳缓冲液(50 倍)

　　羟基甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯) 242 g

　　冰乙酸 57 . 1 mL

　　0 . 5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8 . 0) 100 mL

　　灭菌双蒸水 加至 1 000 mL

　　用时用灭菌双蒸水稀释使用 。

　　4

　　GB/T 21674—2008

　　A.10 1%琼脂糖凝胶

　　琼脂糖(电泳级)

　　2 g

　　TAE 电泳缓冲液(50 倍)

　　4 mL

　　灭菌双蒸水

　　196 mL

　　微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB)溶液 20 μL 。

　　A.1 1 上样缓冲液

　　溴酚蓝 0 . 2 g,加双蒸水 10 mL过夜溶解 。50 g 蔗糖加入 50 mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至 100 mL 。

　　A.12 75%乙醇

　　无水乙醇(100%)(分析纯) 750 mL

　　灭菌双蒸水 250 mL

　　A.13 15 mmol/L氯化镁

　　氯化镁(分析纯) 0 . 143 g

　　灭菌双蒸水 100 mL

　　A.14 灭菌双蒸水

　　1 000 mL双蒸水(电阻 ≥18 . 2 Ω) ,放于高压锅中，121℃高压 20 min后取出备用 。

　　A.15 电泳缓冲液( 1 倍)

　　电泳缓冲液(50 倍)

　　10 mL

　　灭菌双蒸水

　　490 mL

　　5