GB/T 21751-2025 化学品 哺乳动物精原细胞染色体畸变试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21751—2025代替 GB/T21751—2008

　　化学品 哺乳动物精原细胞染色体畸变

　　试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofmammalian spermatogonialchromosomeaberration

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21751—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代 替 GB/T 21751—2008《化 学 品 哺 乳 动 物 精 原 细 胞 染 色 体 畸 变 试 验 方 法 》, 与

　　GB/T 21751—2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 更改了适用范围的表述(见第 1 章 ,2008年版的第 1 章) ;

　　b) 增加了 “非整倍体”“着丝粒”“染色体多样性”“染色体断裂剂”“遗传毒性 ”等术语和定义(见第3 章) ;

　　c) 增加了 “实验室能力的验证 ”内容(见 4. 2) ;

　　d) 更改了 “动物选择”“动物房和饲养条件”“动物准备 ”和 “受试物准备 ”的内容(见 4. 3,2008年版的 3. 2) ;

　　e) 更改了 “溶剂和赋形剂 ”(见 4. 4. 1,2008年版的 3. 3. 1) ,增加了常用和首选的溶剂或赋形剂名称(见 4. 4. 1) ;

　　f) 更改了一水合环磷酰胺的英文名称和丙烯酰胺单体的中文名称(见表 1,2008年版的 3. 3. 2) ;

　　g) 增加了 “阴性对照 ”内容(见 4. 4. 3) ;

　　h) 更改了 “操作步骤 ”部分内容 ,对动物数量 、染毒程序 、剂量水平的选择 、染毒途径做了具体规定(见 4. 5,2008年版的 3. 4) ,更 改 了 所 需 计 数 的 中 期 分 裂 相 细 胞 数 量(见 4. 5. 7. 1, 2008年 版 的3. 4. 7) ,并增加了对实验动物的观察(见 4. 5. 5) ;

　　i) 增加了 “质量保证与质量控制 ”内容(见 5. 2) ;

　　j) 增加了 “结果的评价和解释 ”内容(见 5. 3) ;

　　k) 更改了试验报告的内容要求(见第 6章 ,2008年版的 4. 3) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、福建医科大学 、北京汇智泰康医药技术有限公司 。

　　本文件主要起草人 :张林媛 、李煌元 、陈宵 、李斌 、程秀荣 、杜克贺 、赵振超 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21751—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21751—2025

　　引 言

　　哺乳动物体内精原细胞染色体畸变试验的目的是鉴定能导致哺乳动物精原细胞染色体结构畸变的化学物质 ,而不是检测染色体数目异常 。此外 ,尽管不同物种间可能存在差异 ,但体内代谢 、药代动力学和 DNA 修复过程中的各种因素都很活跃 ,会对反应产生影响 , 因此 ,此试验还适用于评估遗传毒性 。

　　本文件检测精原生殖细胞分裂过程中的染色体结构畸变(包括染色体型和染色单体型) ,从而预测能诱导这些生殖细胞中可遗传突变的可能性 。

　　本文件通常采用啮齿类动物 。细胞遗传学研究中 ,有经典的方法可以在啮齿类动物睾丸中生成精原细胞有丝分裂和精母细胞减数分裂的中期相 。根据染色体的形态识别有丝分裂和减数分裂中期相 。该项体内细胞遗传学试验检测精原细胞有丝分裂中的染色体结构畸变 。其他靶细胞不是本文件的观察对象 。

　　为了检测精原细胞的染色单体型畸变 ,需检测染毒后细胞的第一次有丝分裂 , 以免这些畸变在随后的细胞分裂中转变为染色体型畸变 。通过对处于减数分裂终变期 — 分裂中期 Ⅰ 相和中期 Ⅱ相染色体结构畸变的分析 ,可以从染毒后的精母细胞获得更多的信息 。

　　睾丸中存在多代精原细胞 ,它们对化学品染毒后的敏感性各不相同 。 因此 ,检测的畸变代表了经化学品处理过的精原细胞群的综合反应 。睾丸中大多数有丝分裂的细胞是 B 型精原细胞 ,其细胞周期约为 26h。

　　如果有证据表明受试物或其代谢产物不能到达睾丸 ,则不宜使用本文件 。

　　Ⅱ

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　　化学品 哺乳动物精原细胞染色体畸变

　　试验方法

　　1 范围

　　本文件确立了化学品哺乳动物精原细胞染色体畸变试验的试验基本原则 ,规定了规定程序 、数据与报告的内容要求 ,描述了试验方法 。

　　本文件适用于测试化学品对哺乳动物精原细胞的遗传毒性 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14925 实验动物 环境及设施

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　染色单体型畸变 chromatid-typeaberration

　　单个染色单体断裂或染色单体间断裂和重接的染色体结构损伤 。

　　3.2

　　染色体型畸变 chromosome-typeaberration

　　两个染色单体在相同位点断裂或断裂重接的染色体结构损伤 。

　　3.3

　　裂隙 gap

　　小于染色单体宽度并伴有染色单体极小错位的不着色的损伤 。

　　3.4

　　数目畸变 numericalaberration

　　染色体数目出现不同于所用细胞的正常染色体数目的改变 。

　　3.5

　　结构畸变 structuralaberration

　　发生在细胞分化中期的染色体结构出现的改变 。

　　注 : 如染色体结构缺失 、碎片 、内交换或互换等 。结构畸变通过显微镜进行观察 。

　　3.6

　　非整倍体 aneuploidy

　　一条或多条染色体与正常的二倍体(或单倍体)染色体数目的偏差 。

　　1

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　　注 : 不包括整套染色体(多倍体) 。

　　3.7

　　着丝粒 centromere

　　在细胞分裂时与纺锤体纤维相连 ,使姊妹染色体能有序地运动到子细胞的两极的染色体上的一个区域 。

　　3. 8

　　染色体多样性 chromosomediversity

　　染色体形状和大小的变异 。

　　注 : 如具有中央着丝粒的染色体和近端着丝粒染色体等染色体的形状变异 。

　　3.9

　　染色体断裂剂 clastogen

　　在细胞群或生物体中引起染色体结构畸变的任何物质 。

　　3. 10

　　遗传毒性 genetoxicity

　　包括所有类型的 DNA或染色体损伤的总称 。

　　注 : 包括断裂 、缺失 、加合 、核苷酸修饰和连接 、重排 、突变 、染色体畸变和非整倍体 。并不是所有类型的遗传毒性效应都会导致突变或稳定的染色体损伤 。

　　3. 11

　　有丝分裂指数 mitotic index;MI

　　在细胞群中观察到的有丝分裂中期相细胞数除以总细胞数的比值 。

　　注 : 有丝分裂指数是细胞群体增殖程度的标志 。

　　3. 12

　　有丝分裂 mitosis

　　细胞核的分裂 。

　　注 : 通常分为前期 、前中期 、中期 、后期和末期 。

　　3. 13

　　致突变 mutagenicity

　　基因中 DNA碱基对序列或染色体结构(染色体畸变)发生可遗传的变化 。

　　3. 14

　　最大耐受剂量 maximum tolerated dose;MTD

　　在研究的持续期间 ,能引起轻微毒性反应的剂量 。

　　注 1: 轻微毒性反应包括异常行为或反应 、轻微体重下降或造血系统细胞毒性等 。

　　注 2: 最大耐受剂量不会导致动物死亡或使动物遭受痛苦而不得不实施安乐死 。

　　3. 15

　　最高剂量 thehighestdose

　　能够使动物产生明显毒性但不引起死亡或严重痛苦的中毒反应的剂量 。

　　注 : 或规定为引起精原细胞毒性的剂量 。例如在最高剂量下 ,会引起精原细胞有丝分裂至第一次和第二次减数分裂中期相的比例不超过 50%的降低 。

　　4 试验方法

　　4. 1 试验基本原则

　　动物通过适当的暴露途径接触受试物 ,并在染毒后的适当时间实施安乐死 。在安乐死之前 ,用细胞

　　2

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　　分裂中期相阻断剂(如秋水仙素和秋水酰胺)处理动物 ,然后制备精原细胞染色体标本并染色 ,分析中期分裂相细胞的染色体畸变 。

　　4.2 实验室能力的验证

　　本试验的能力验证应通过阳性对照物质(包括弱反应)处理的精原细胞重现染色体结构畸变频率的预期结果 ,并获得与已经发表的文献中对照数据可接受范围一致的阴性对照频率 ,或者与实验室历史对照一致的数据来建立 。

　　4.3 实验动物和饲养环境

　　4.3. 1 动物选择

　　应采用实验室常用品系的健康初成年动物 。首选雄性小鼠 。但在科学合理的情况下 ,可使用其他合适的雄性哺乳动物 ,并允许该试验与其他试验一起进行 。应在报告中提供使用啮齿动物以外物种的科学的理由 。

　　4.3.2 动物房和饲养条件

　　对于啮齿动物 ,合适的动物房温度应为 20℃ ~ 26℃ ,相对湿度为 30% ~ 70% ,人工照明 12h亮 12 h 暗 。 喂饲常规的实验室饲料 , 自 由饮水 。 如果采用喂饲染毒法 ,应根据需要选择饲料 , 以确保受试物能均匀地在其中混合 。动物可单独饲养 ,也可同性别同笼饲养(每笼不超过 5 只) ,宜在有坚固地面的笼内饲养并有适当的环境丰容 。

　　4.3.3 动物准备

　　应使用健康初成年雄性动物(染毒开始时 8周龄 ~ 12周龄) ,并随机分配到对照组和染毒组 。 每只动物都采用一种人道的 、微创的方法进行识别(如戴耳环 、打标签 、微芯片或生物特征识别 ,但不能剪耳朵或脚趾) 。在试验开始前 ,动物应提前适应实验室环境至少 5 d。尽量减少笼子摆放方式可能产生的影响 。避免阳性 对 照 与 受 试 物 交 叉 污 染 。 在 试 验 开 始 时 , 动 物 个 体 之 间 体 重 差 异 应 不 超 过 平 均 体重 ±20% 。

　　4.3.4 受试物准备

　　在给动物染毒之前 , 固体受试物应溶解或悬浮在适当的溶剂或赋形剂中 , 或混合在饲料或饮用水中 。液体受试物可以直接染毒或稀释后染毒 。对于吸入暴露 ,可根据受试物的物理化学性质 , 以气体 、蒸气或固体/液体气溶胶的形式进行染毒 。 除非稳定性数据证明储存条件可接受 ,并说明适当的储存条件 ,否则受试物应现用现配 。

　　4.4 试验条件

　　4.4. 1 溶剂和赋形剂

　　在采用的剂量水平下 , 溶 剂/赋 形 剂 不 应 产 生 毒 性 作 用 , 且 不 与 受 试 物 发 生 化 学 反 应 。 常 用 的 溶剂/赋形剂包括水 、生理盐水 、甲基纤维素溶液 、羧甲基纤维素钠盐溶液 、橄榄油和玉米油 。首选水做溶剂/赋形剂 。如果使用的不是熟知的溶剂/赋形剂 ,则应提供参考数据说明其适用性 。如果没有历史数据或已发表的参照数据表明所选择的非典型溶剂/赋形剂不会导致染色体结构畸变和其他有害影响 ,应进行初步研究 , 以确定这种溶剂/赋形剂对照的可接受性 。

　　3

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　　4.4.2 阳性对照

　　4.4.2. 1 应始终同时设置阳性对照动物 ,除非实验室已证明能够熟练进行试验 ,并在最近(例如在最近5 年内)经常进行该试验 。

　　4.4.2.2 当没有同时设置的阳性对照组时 ,每次实验应包括评分对照组(固定的和未染色的玻片) ,这些可以通过在评分中纳入适当的参考样本来获得 。参考样本可以是定期(例如 ,每 6 个月 ~ 18个月)在实验室进行的单独阳性对照实验中获得和储存的 。例如 ,在实验室能力测试期间和此后定期的试验基础上获得 。

　　4.4.2.3 阳性对照物质应确保使细胞染色体结构畸变频率可被检测 ,并高于自发水平 。 阳性对照的剂量应合理设置 ,既能产生明显效应 ,但又不会使阅片者立即判断其为阳性对照片 。典型的阳性对照物见表 1。

　　表 1 典型的阳性对照物

　　英文名

　　中文名

　　CAS号

　　Cyclophosphamide

　　环磷酰胺

　　50-18-0

　　Monohydrate cyclophosphamide

　　一水合环磷酰胺

　　6055-19-2

　　Cyclohexylamine

　　环己胺

　　108-91-8

　　MitomycinC

　　丝裂霉素 C

　　50-07-7

　　Monomericacrylamide

　　丙烯酰胺单体

　　79-06-1

　　Triethylenemelamine

　　三亚乙基嘧胺

　　51-18-3

　　4.4.3 阴性对照

　　每次试验应该设置阴性对照组 ,除了使用溶剂或赋形剂处理外 ,其他处理方式与染毒组相同 。在没有历史数据或已发表 的 对 照 数 据 表 明 所 选 溶 剂/赋 形 剂 不 会 导 致 染 色 体 畸 变 或 其 他 有 害 影 响 的 情 况下 ,为了确定赋形剂对照的可接受性 ,在每个采样时间也应纳入未处理的对照组动物 。

　　4.5 操作步骤

　　4.5. 1 动物数量

　　试验开始时每组应包括至少 5 只雄性动物 。每组动物的数量应满足统计学需要(即在显著性水平为 0. 05的情况下 , 当阴性对照水平为 1. 0%或更高时 ,通常有 80%概率能够检测到至少加倍的染色体畸变频率) 。如果一个研究包括两个采样时间 ,三个染毒剂量组和一个阴性对照组 ,一个阳性对照组(每组包括 5 只动物) ,将需要 45只动物 。

　　4.5.2 染毒程序

　　4.5.2. 1 受试物一次染毒(即单次处理) 。如果有科学依据 ,可采用其他染毒方案 。

　　4.5.2.2 最高剂量组染毒后应分两次采样 。 由于受试物摄取和代谢所需的时间 , 以及其对细胞周期动力学的效应 ,会影响染色体畸变检测的最佳时间 , 因此应在染毒后约 24 h 和 48 h 分别进行一次早采样和一次晚采样 。 除最高剂量组外的其他剂量组 ,应在染毒后 24 h(小于或等于 B 型精原细胞的细胞周期时间 ,从而优化第一次染毒后的中期分裂相评分概率)进行 ,除非另一个采样时间恰当合理 。

　　4.5.2.3 可采用其他采样时间 ,例如 ,对于具有 S期独立效应的受试物 ,更早的采样时间(即小于 24 h)

　　4

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　　是恰当的 。

　　4.5.2.4 可采用重复剂量染毒方案 ,例如与使用 28 d染毒期的另一个观察终点的试验联合进行(见参考文献[2]) ;但需要额外的动物组来满足不同的采样时间 。 因此 ,这种方案是否恰当需要在个案基础上科学地加以证明 。

　　4.5.2.5 在动物安乐死之前 ,应腹腔注射适当剂量的细胞分裂相阻断剂(如秋水仙素或秋水酰胺) 。此后在合适的时间间隔采样 。对于大鼠和小鼠 ,时间间隔为 3 h~ 5 h。

　　4.5.3 剂量水平

　　4.5.3. 1 如果没有合适的实验数据可以帮助剂量选择 ,应在同一实验室使用相同的种属 、品系以及相同的处理方式进行初步的剂量范围研究 。

　　4.5.3.2 本文件旨在确定最大耐受剂量(MTD) 。

　　4.5.3.3 为获得剂量-反应关系 ,一项完整的研究应包括一个阴性对照组和至少三个剂量组 ,通常以2倍但不超过 4倍间隔 。如果在剂量组距研究中或根据现有数据 ,该受试物不产生毒性 ,单次染毒的最高剂量应为 2 000 mg/(kg · d) 。但是 ,如果受试物确实导致毒性 ,则给予的最高剂量应是 MTD,所使用的剂量水平最好涵盖从最高剂量到产生很低或无毒性的剂量范围 。 当靶组织(即睾丸)在所有剂量水平下观察到毒性时 ,建议在无毒性剂量下进一步研究 ,那些旨在更全面地描述剂量-反应关系的研究可能需要额外的剂量组 。对于有特定要求的某些类型的受试物(如人用药品) ,这些限制不同 。如果受试物确实产生 毒 性 , 则 应 选 择 限 度 剂 量 加 上 两 个 较 低 剂 量 。 染 毒 14 d 及 以 上 的 限 度 剂 量 为 1 000 mg/ (kg · d) ,染毒 14 d 以下的限度剂量为 2 000 mg/(kg · d) 。

　　4.5.3.4 在较低的无毒性剂量下对具有特定生物活性的化学品(如激素和促细胞分裂剂) , 以及毒物动力学特性呈现饱和状态的物质 ,可不采用上述剂量标准 ,而根据具体情况进行评估 。

　　4.5.4 染毒途径和容量

　　在设计试验时考虑预期的人类暴露途径 。饮食 、饮用水 、局部皮下注射 、静脉注射 、口服(灌胃) 、吸入或植入等染毒途径是合理的选择 。在任何情况下 ,应选择适当的途径以确保靶组织充分暴露 。 除非有科学证明 ,通常不推荐腹腔注射 , 因为它不是一个常见的人类暴露途径 。如果受试物混在饲料或饮水中 ,尤其是单次染毒时 ,应该注意食物和水消耗之间的延迟 ,采样应足以保证检测到毒性效应 。一次灌胃或注射的最大 液 体 体 积 取 决 于 实 验 动 物 的 大 小 。 通 常 100 g 体 重 的 动 物 给 药 体 积 不 应 该 超 过 1 mL,如果是水溶液 ,100g体重的动物给药最大体积不超过 2 mL。如果动物福利允许 ,给药体积超过这个限度应该论证 。应通过调整浓度来尽量减少受试物体积的变化 , 以确保在所有剂量水平下与体重相关的染毒体积保持恒定 。

　　4.5.5 观察

　　应对实验动物进行一般临床观察 ,宜每天同一时间至少记录一次临床体征 ,并考虑染毒后预期效果出现的高峰期 。应每天至少两次观察所有动物的发病率和死亡率 。所有动物都应该在试验开始时称体重 ,在重复剂量试验期间至少每周一次 ,并在安乐死时称体重 。在至少持续一周的试验中 ,应至少每周测量食物消耗量 。如果受试物是通过饮用水染毒的 ,则应在每次换水时和至少每周测量饮水量 。表现出过量毒性的非致死指征的动物应在试验结束前实施安乐死 。

　　4.5.6 染色体制备

　　在动物安乐死之后 ,立即取单侧或两侧睾丸制备细胞悬液 ,经低渗溶液处理和固定后 ,平铺细胞于载玻片上进行染色 。所有玻片应该编码以便进行盲评 。具体方案见附录 A。

　　5

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　　4.5.7 分析

　　4.5.7. 1 对每只动物至少分析 200个中期分裂相细胞 。如果历史阴性对照频率<1% ,应对每只动物超过 200个细胞进行评分 , 以增加统计效能 。应使用能够识别着丝粒的染色方法 。

　　4.5.7.2 应分别记录染色体和染色单体型畸变 ,并按亚型(断裂 、交换)分类 。在检测一个化学品是否会显著增加细胞染色体畸变的发生率时 ,应记录但不考虑裂隙 。应确保由训练有素的评分员进行染色体畸变分析 。考虑到玻片制备过程通常会导致一定比例的中期相断裂 ,从而导致染色体丢失 , 因此 ,评分的细胞应该包含不少于 2n±2的着丝粒 ,其中 n 是该种属的染色体单倍体数 。

　　4.5.7.3 虽然试验目的是检测染色体结构畸变 ,但如果有 ,也应记录多倍体细胞和染色体重复复制的细胞频率 。

　　5 数据和结果

　　5. 1 结果处理

　　5. 1. 1 应以表格形式提供每只实验动物的数据 。对于每只动物 ,应评估具有染色体结构畸变的细胞数和每个细胞的染色体畸变数 。实验组和对照组应分别列出按亚型(断裂 、交换) 分类的染色体型和染色单体型畸变的数量和频率 。裂隙及其频率应单独记录和报告 ,但一般不包括在总的畸变频率中 。如果观察到多倍体和染色体重复复制的细胞 ,应记录其比例 。

　　5. 1.2 应报告毒性和临床表现数据 。

　　5. 1.3 应采用恰当的统计分析方法对试验数据进行统计分析 。

　　5.2 质量保证与质量控制

　　试验的有效性要求 :

　　a) 同期阴性对照的结果与已发布的历史阴性对照数据一致 ,细胞畸变率通常在 0% ~ 1. 5%之间 ;

　　b) 同期阳性对照引起的反应与已发布的历史阳性对照数据或实验室的历史阳性对照数据库(如果有)一致 ,并与阴性对照相比有统计学上的显著增加 ;

　　c) 分析足够的细胞数和剂量组 ;

　　d) 最高剂量的选择标准与上述描述一致 。

　　注 : 如果同时观察到有丝分裂和减数分裂 ,检测精原细胞有丝分裂与第一个和第二个减数分裂中期相的比率 ,作为衡量所有染毒组和阴性对照组的每 个 动 物 各 100个 分 裂 细 胞 的 细 胞 毒 性 的 一 个 指 标 。 如 果 只 观 察 到 有 丝 分裂 ,则每只动物至少要检测 1 000个细胞的有丝分裂指数 。

　　5.3 结果的评价和解释

　　5.3. 1 应至少分析三个染毒剂量组 , 以便为剂量-反应关系分析提供足够的数据 。

　　5.3.2 在满足所有 可 接 受 标 准 的 情 况 下 , 如 果 又 同 时 满 足 以 下 三 种 情 况 , 受 试 物 则 被 认 为 是 明 显 阳性的 :

　　a) 与同期阴性对照相比 ,至少一种试验剂量组细胞染色体畸变率显示出有统计学意义的增加 ;

　　b) 至少在一个采样时间内具有与剂量相关的增加 ;

　　c) 如有任何超 出 阴 性 对 照 组 数 据 的 可 接 受 范 围 , 或 实 验 室 历 史 阴 性 对 照 数 据 的 分 布(如 泊 松95%对照限度)的结果 。

　　满足本条款规定的内容 ,可认为受试物能够诱导实验动物精原细胞的染色体畸变 。

　　5.3.3 如果满足了所有的可接受标准 ,又同时满足以下三种情况 ,受试物则被认为是明显阴性的 :

　　a) 与同期阴性对照相比 ,所有试验剂量细胞染色体畸变率均无统计学意义的增加 ;

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　　b) 在任何实验条件下 ,没有剂量相关的增加 ;

　　c) 如有 ,所有结果均在阴性对照数据或实验室历史阴性对照数据(如泊松 95%对照限度)的可范围内 。

　　满足本条款规定的内容 ,可认为受试物不能诱导实验动物精原细胞的染色体畸变 。 阴性结果并不排除这种化学物在未研究的发育后期诱发染色体畸变或基因突变的可能性 。

　　5.3.4 对明确的阳性或阴性结果没有必要进行验证 。如果不是明确的阳性或阴性结果 ,为了帮助建立一个生物学相关性结果 (例如微弱或边缘性的增加) ,应该通过专家判断和/或使用现有的实验数据进行进一步的调查来评估数据 ,例如考虑阳性结果是否超出阴性对照数据或实验室的历史阴性对照数据的可接受范围 。在极少数情况下 , 即使经过进一步的调查 ,从数据集也无法做出阳性或阴性结果的结论 , 因此得到 “无证据支持受试物可诱导实验动物精原细胞的染色体畸变 ”的结论 。

　　5.3.5 多倍体细胞数量的增加可能表明受试物具有抑制有丝分裂过程和诱导染色体数目畸变的潜力 。染色体重复复制的细胞数量的增加可能表明受试物有抑制细胞周期进程的潜力 。诱导染色体数量变化的机制与抑制有丝分裂过程的机制是不同的 。 因此 ,应分别记录多倍体细胞和有重复复制染色体的细胞的发生率 。

　　6 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 摘要 。

　　b) 受试物 :

　　1) 来源 、批号 、使用期限(如有) ;

　　2) 稳定性(如已知) ;

　　3) 受试物在溶剂中的溶解度和稳定性(如已知) ;

　　4) 在适当情况下 ,添加了受试物的培养基中的 pH值 、渗透压以及沉淀物 ;

　　5) 受试物为单组分物质时 ,应提供其物理外观 、水中溶解度和其他相关的理化性质 , 以及化学标识信 息 , 如 国 际 提 纯 与 应 用 化 学 联 合 会 (IUPAC) 或 化 学 品 文 摘 号 (CAS) 名 称 、 CAS编号 、简化分子线性输入规范(SMILES)或国际化合物标识(InChI)代码 、结构式 、纯度 、杂质等(如有) ;

　　6) 受试物为多组分物质 、可变成分的复杂物质(UVCBs) 和混合物时 ,尽可能对各组分的化学标识信息[见 b)5)] 、含量和相关的理化性质进行表征 。

　　c) 受试物的制备 :

　　1) 选择赋形剂的依据 ;

　　2) 受试物在溶剂/赋形剂中的溶解度和稳定性 ;

　　3) 饲料 、饮用水或吸入配方的制备 ;

　　4) 对配方进行分析测定(如稳定性 、均匀性 、标称浓度) 。

　　d) 试验动物 :

　　1) 使用的物种/品系及使用依据 ;

　　2) 动物的数量和年龄 ;

　　3) 动物来源 、饲养条件 、饮食等 ;

　　4) 动物的唯一识别方法 ;

　　5) 对于短期试验 :每只动物试验开始和结束时的体重 ;对于超过一周的试验 : 每只动物试验期间的体重和食物消耗量 。应包括每组动物的体重范围 、平均值和标准差 。

　　e) 试验条件 :

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　　1) 阳性对照和阴性对照(溶剂/赋形剂) ;

　　2) 进行剂量组距试验所得的数据(如有) ;

　　3) 剂量水平选择的依据 ;

　　4) 染毒途径的依据 ;

　　5) 受试物制备的详细描述 ;

　　6) 受试物染毒的详细描述 ;

　　7) 处死时间的依据 ;

　　8) 检测动物毒性的方法(如有) ,应包括组织病理学或血液学分析 , 以及动物观察和体重测量的频率 ;

　　9) 用于验证受试物是否达到靶组织或全身循环的方法(如果得到阴性结果) ;

　　10) 实际染毒剂量[mg/(kg · d)] ,根据饮食/饮用水中受试物浓度和消耗量计算(如适用) ;

　　11) 食物及饮水质量的详细资料 ;

　　12) 详细说明染毒和采样时间表 , 以及作出该选择的理由 ;

　　13) 安乐死的方法 ;

　　14) 镇痛法的描述(如果使用) ;

　　15) 组织分离程序 ;

　　16) 细胞分裂中期相阻断剂的名称 、浓度和处理时间 ;

　　17) 涂片制备方法 ;

　　18) 染色体畸变评价标准 ;

　　19) 每只动物分析的细胞数 ;

　　20) 阳性 、阴性或可疑结果的判断标准 。

　　f) 结果 :

　　1) 试验前和整个试验期间的动物状况 ,包括毒性表征 ;

　　2) 处死时的体重和器官重量(如果采用多种染毒方案 ,在染毒过程中测量的体重) ;

　　3) 毒性表现 ;

　　4) 细胞有丝分裂指数 ;

　　5) 精原细胞处于第一次和第二次减数分裂中期相的比例 ,或暴露于靶组织的其他证据 ;

　　6) 分别给出每只动物的畸变类型和数量 ;

　　7) 每组畸变总数 、平均值和标准差 ;

　　8) 每组有畸变的细胞数 ,包括平均值和标准偏差 ;

　　9) 剂量-反应关系(如可能) ;

　　10) 所采用的统计分析和方法 ;

　　11) 同期阴性对照数据 ;

　　12) 历史阴性对照数据的范围 、平均值 、标准差 、95%可信区间 , 或者已经公开的历史阴性对照数据用于检测结果的可接受性 ;

　　13) 同期阳性对照数据 ;

　　14) 染色体倍性的变化 , (如有)包括多倍体和/或核内复制的细胞频率 。

　　g) 结果的讨论 。

　　h) 结论 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　染色体的制备

　　A. 1 取材

　　以小鼠为例 。用颈椎脱臼法处死小鼠 ,打开腹腔 ,取出两侧睾丸 ,去净脂肪 ,于低渗液中洗去毛和血污 ,放入盛有适量 1%质量分数的柠檬酸三钠或 0. 4%质量分数的氯化钾溶液的小平皿中 。

　　A.2 低渗

　　以眼科镊撕开睾丸被膜 ,轻轻地分离曲细精管 ,加入 1%质量分数的柠檬酸三钠溶液 10 mL,用滴管吹打曲细精管 ,静止 2 min,使曲细精管下沉 ,将含有许多精子的上清液仔细吸去 。 留下的曲细精管重新用 10 mL 1%质量分数的柠檬酸三钠处理 10 min。

　　A.3 固定

　　仔细吸尽上清液 ,加固定液 10 mL 固定 。第一次不超过 15 min,倒掉固定液后 ,再加入新的固定液固定 20 min以上 。如在冰箱(0 ℃ ~4 ℃)过夜固定更好 。

　　A.4 离心

　　吸尽固定液 ,加 60%质量分数的冰乙酸 1 mL~ 2 mL,待大部分曲细精管软化完后 ,立即加入倍量的固定液 ,打匀 、移入离心管 , 以 1 000 r/min离心 10 min。

　　A.5 滴片

　　弃去大部分上清液 , 留下约 0. 5 mL~ 1. 0 mL,充分打匀制成细胞混悬液 ,将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上 。每个样本制片 2 张 ~ 3 张 。空气干燥或微热烘干 。

　　A.6 染色

　　用 1 ∶ 10Giemsa应用液染色 10 min(根据室温染色时间不同) ,用蒸馏水冲洗 、晾干 。

　　A.7 阅片

　　A.7. 1 编号

　　所有玻片 ,包括阳性对照和阴性对照 ,在镜检前均要分别编号 。

　　A.7.2 镜检

　　在低倍镜下按顺序寻找 背 景 清 晰 、分 散 良 好 、染 色 体 收 缩 适 中 的 中 期 分 裂 相 , 然 后 在 油 镜 下 进 行分析 。

　　注 : 染色体的制备见 GB 15193. 8—2014。

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　　GB/T 21751—2025

　　参 考 文 献

　　[1] GB 15193. 8—2014 食品安全国家标准 小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验

　　[2] OECD Guidelines for The Testing ofChemicals No. 483. Mammalian SpermatogonialChro- mosomalAberration Test(2016)

　　[3] OECD Guidelines for The Testing of Chemicals No. 488. Transgenic Rodent Somatic and Germ CellGene Mutation Assays (2011)

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