GB/T 31270.18-2014 化学农药环境安全评价试验准则 第18部分：天敌两栖类急性毒性试验

　　ICS 65. 100 B 13

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31270. 18—2014

　　化学农药环境安全评价试验准则

　　第 18部分 :天敌两栖类急性毒性试验

　　Testguidelineson environmentalsafety assessmentforchemicalpesticides—

　　Part18:Amphibian acutetoxicitytest

　　2014-10-10发布 2015-03-11 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31270. 18—2014

　　前 言

　　GB/T 31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为 21个部分 :

　　— 第 1部分 :土壤降解试验 ;

　　— 第 2部分 :水解试验 ;

　　— 第 3部分 :光解试验 ;

　　— 第 4部分 :土壤吸附/解吸试验 ;

　　— 第 5部分 :土壤淋溶试验 ;

　　— 第 6部分 :挥发性试验 ;

　　— 第 7部分 :生物富集试验 ;

　　— 第 8部分 :水-沉积物系统降解试验 ;

　　— 第 9部分 :鸟类急性毒性试验 ;

　　— 第 10部分:蜜蜂急性毒性试验 ;

　　— 第 11部分 :家蚕急性毒性试验 ;

　　— 第 12部分 :鱼类急性毒性试验 ;

　　— 第 13部分 :溞类急性活动抑制试验 ;

　　— 第 14部分 :藻类生长抑制试验 ;

　　— 第 15部分 :蚯蚓急性毒性试验 ;

　　— 第 16部分 :土壤微生物毒性试验 ;

　　— 第 17部分 :天敌赤眼蜂急性毒性试验 ;

　　— 第 18部分 :天敌两栖类急性毒性试验 ;

　　— 第 19部分 :非靶标植物影响试验 ;

　　— 第 20部分 :家畜短期饲喂毒性试验 ;

　　— 第 21部分 :大型甲壳类生物毒性试验 。

　　本部分是 GB/T 31270的第 18部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出并归 口 。

　　本部分负责起草单位 :农业部农药检定所 、环保部南京环境科学研究所 。

　　本部分主要起草人 :周军英 、曲甍甍 、单正军 、田丰 、俞瑞鲜 、郝身伟 、陈朗 。

　　化学农药环境安全评价试验准则

　　第 18部分 :天敌两栖类急性毒性试验

　　1 范围

　　GB/T 31270的本部分规定了天敌两栖类急性毒性试验的材料 、条件 、操作 、质量控制 、数据处理 、试验报告等的基本要求 。

　　本部分适用于为化学农药登记而进行的天敌两栖类急性毒性试验 ,其他类型的农药可参照使用 。本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药 。

　　2 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　2. 1

　　半致死浓度 median lethalconcentration

　　在急性毒性试验中 ,引起 50%的供试生物死亡时的供试物浓度 ,用 LC50表示 。

　　注 : 单位为 mg a.i./L。

　　2.2

　　供试物 testsubstance

　　试验中需要测试的物质 。

　　2.3

　　化学农药 chemicalpesticide

　　利用化学物质人工合成的农药 。其中有些以天然产品中的活性物质为母体 ,进行仿制 、结构改造 ,创新而成 ,为仿生合成农药 。

　　同义词 :有机合成农药 synthetic organic pesticide。

　　[NY/T 1667. 1—2008,定义 2. 3. 1] 2.4

　　原药 technicalmaterial

　　在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物 ,必要时可加入少量的稳定剂 。

　　[NY/T 1667. 2—2008,定义 2. 5. 1] 2.5

　　制剂 formulation product

　　由农药原药(或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品 。

　　[NY/T 1667. 2—2008,定义 2. 4] 2.6

　　半静态试验法 semi-static test

　　试验期间每隔一定时间(如 24h)更换一次药液 , 以保持试验药液的浓度不低于初始浓度的 80% 。

　　GB/T 31270. 18—2014

　　2.7

　　静态试验法 static test

　　试验期间不更换试验药液 。

　　2. 8

　　流水式试验法 flow-through test

　　试验期间药液连续更新 。

　　3 试验概述

　　天敌两栖类急性毒性测定方法有静态法 、半静态法与流水式试验法三种 。应根据供试物的性质采用适宜的方法 。分别配制不同浓度的供试物药液 ,于 96h 的试验期间每天观察并记录蝌蚪的中毒症状和死亡数 ,并求出 24h、48h、72 h 和 96h 的 LC50值及 95%置信限 。

　　4 试验方法

　　4. 1 材料和条件

　　4. 1. 1 供试生物

　　推荐使用泽蛙(Rana Limnocharis)或非洲爪蟾(Xenopuslaevis) 蝌蚪 。具体龄期和适宜水温见附录 A。如果选用其他两栖类作为试验材料 ,应该采用能够满足其生理要求的相应驯养和试验条件 ,并加以说明 。

　　试验用蝌蚪应选用健康无病 、龄期一致的蝌蚪 。试验前在室内预养 3 d,试验前一天停止喂食 ,试验中亦不喂食 。

　　4. 1.2 供试物

　　农药制剂 、原药或纯品 。对难溶于水的农药 ,可用少量对蝌蚪低毒的有机溶剂助溶 ,用量不得超过0. 1 mL(g)/L。

　　4. 1.3 主要仪器设备

　　主要仪器设备如下 :

　　— 溶解氧测定仪 ;

　　— 温度计 ;

　　— 酸度计 ;

　　— 玻璃缸 ;

　　— 量筒等 。

　　4. 1.4 试验用水

　　试验用水为经活性炭处理 、存放并曝气处理 24h 以上的自来水或能注明配方的稀释水 。水质硬度在 10 mg/L~ 250 mg/L之间(以 CaCO3 计) , pH 在 6. 0~ 8. 5 之间 ,溶解氧含量 不 应 低 于 空 气 饱 和 值(ASV)的 60% 。

　　4. 1.5 承载量

　　静态和半静态试验系统最大承载量为 1. 0 g(受试生物)/L,流水式试验系统承载量可高一些 。

　　4. 1.6 试验条件

　　光暗比 16h ∶ 8 h,或者自然光照 。

　　4.2 试验操作

　　4.2. 1 方法的选择

　　应根据供试物的特性选择静态试验法 、半静态试验法或流水式试验法 。如使用静态或半静态试验法 ,应确保试验期间试验药液中供试物浓度不低于初始浓度的 80% 。如果在试验期间试验药液中供试物浓度发生超过 20%的偏离 ,则应检测试验药液中供试物的实际浓度并以此计算结果 ,或使用流动试验法进行试验 , 以稳定试验药液中供试物浓度 。

　　4.2.2 预试验

　　按正式试验的条件 , 以较大的间距设置 4 个 ~ 5 个浓度组 。通过预试验求出蝌蚪最高全存活浓度和最低全致死浓度 。

　　4.2.3 正式试验

　　在预试验确定的浓度范围内以一定几何级差(不超过 2. 2)设置 5个 ~ 7个浓度组 ,并设一个空白对照组 ,使用有机溶剂助溶的增设溶剂对照组 , 每个浓度设三个重复 。 每缸放入 10只蝌蚪 ,试验开始后6 h 内随时观察并记录试验用蝌蚪的中毒症状及死亡率 ,其后于 24 h、48 h、72 h 和 96 h 观察并记录蝌蚪的中毒症状及死亡率 ,及时清除死蝌蚪 。每天测定并记录试液温度、pH及溶解氧 。

　　4.2.4 限度试验

　　设置上限浓度 100 mg a.i./L, 即供试物达 100 mg a.i./L时供试生物死亡率未超过空白对照组 ,则无需继续进行试验 。若供试物溶解度小于 100 mg a.i./L,则采用其溶解度上限作为试验浓度 。

　　4.3 数据处理

　　4.3. 1 统计分析方法的选择

　　可采用寇氏法 、直线内插法或概率单位图解法计算每一观察时间(24 h、48 h、72 h 和 96 h) 的天敌两栖类急性毒性的半致死浓度 LC50,也可采用数据统计软件进行分析和计算 。

　　4.3.2 寇氏法

　　用寇氏法可求出天敌两栖类在 24h、48h、72 h、和 96h 的 LC50值及 95%置信限 。

　　LC50 的计算见式(1) :

　　logLC50 = Xm -i( ∑ P -0. 5) …………………………( 1 )

　　式中 :

　　Xm — 最高浓度的对数 ;

　　i — 相邻浓度比值的对数 ;

　　∑ P — 各组死亡率的总和(以小数表示) 。

　　95%置信限的计算见式(2) :

　　95% 置信限 = logLC50 ± 1. 96SlogLC50 …………………………( 2 )

　　标准误的计算见式(3) :

　　SlogLC50 =i …………………………( 3 )

　　式中 :

　　p — 1个组的死亡率 ;

　　q — 1-p;

　　n — 各浓度组两栖类的数量 。

　　4.3.3 直线内插法

　　采用线性刻度坐标 ,绘制试验物质浓度对死亡百分率的曲线 ,求出 50%死亡时的 LC50值 。

　　4.3.4 概率单位图解法

　　用半对数纸 , 以浓度对数为横坐标 、死亡百分率对应的概率单位为纵坐标绘图 。将各实测值在图上用目测法画一条相关直线 ,从直线中读出致死 50%的浓度对数 ,估算出 LC50值 。

　　4.4 质量控制

　　质量控制条件 :

　　— 驯养期间死亡率不得超过 5% ;

　　— 试验期间对照组死亡率不超过 10% ,且无异常行为出现 ;

　　— 试验期间 ,试验溶液的溶解氧含量不应低于空气饱和值(ASV)的 60% 。

　　5 试验报告

　　试验报告至少应包括下列内容 :

　　— 供试物的信息 , 包括供试农药的通用名 、化学名称 、结构式 、CAS号 、纯度 、基 本 理 化 性 质 、来源等 ;

　　— 供试生物名称 、来源 、大小及驯养情况 ;

　　— 试验条件 ,包括试验温度 、光照等 ,所采用稀释水的温度 、溶解氧浓度及 pH 等 ;

　　— 试验药液的浓度及 24h、48 h、72 h 和 96 h 的 LC50 值 和 95%置 信 限 , 并 给 出 所 采 用 的 计 算方法 ;

　　— 对照组蝌蚪是否出现死亡及异常反应 ;

　　— 观察到的毒性效应 ,如受试蝌蚪的任何不正常的行为 、中毒症状等 ;

　　— 对天敌两栖类的毒性等级划分参见附录 B。

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　供试生物龄期及培养水温要求

　　试验用蝌蚪的龄期和水温条件参考表 A. 1。

　　表 A. 1 试验用蝌蚪的龄期和适宜水温

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　农药对蝌蚪的急性毒性等级划分

　　按农药对蝌蚪半致死浓度 LC50 (96h) ,将农药对蝌蚪的急性毒性等级分为四级 ,见表 B. 1。

　　表 B. 1 农药对两栖类的毒性等级划分

　　参 考 文 献

　　[1] NY/T 1667. 1—2008 农药登记管理术语 第 1 部分 :基本术语

　　[2] NY/T 1667. 2—2008 农药登记管理术语 第 2 部分 :产品化学

　　[3] OECD(2009) . Guideline 231: the Amphibian Metamorphosis Assay, OECD Guidelines for the Testing ofChemicals.

　　[4] USEPA(1996). Tadpole/SedimentSubchronic Toxicity Test(OPPTS 850. 1800). Ecological effects testguidelines.

　　[5] ASTM (2007) . Standard GuideforConductingAcuteToxicityTestson TestMaterialswith Fishes, Macr. oinvertebrates, and Amphibians. American Society for Testing and Materials, ASTM E729-96.

　　[6] OECD(1992) . Guideline203:Fish,Acute Toxicity Test.OECD Guidelines for the Testing of Chemicals.

　　[7] 蔡道基 . 农药环境毒理学研究 . 北京 : 中国环境科学出版社 ,1999.