GB/T 31270.16-2014 化学农药环境安全评价试验准则 第16部分：土壤微生物毒性试验

　　ICS 65. 100 B 13

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 31270. 16—2014

　　化学农药环境安全评价试验准则

　　第 16部分 :土壤微生物毒性试验

　　Testguidelineson environmentalsafety assessmentforchemicalpesticides—

　　Part16:Soilmicroorganism toxicitytest

　　2014-10-10发布 2015-03-11 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　发

　　布

　　GB/T 31270. 16—2014

　　前 言

　　GB/T 31270《化学农药环境安全评价试验准则》分为 21个部分 :

　　— 第 1部分 :土壤降解试验 ;

　　— 第 2部分 :水解试验 ;

　　— 第 3部分 :光解试验 ;

　　— 第 4部分 :土壤吸附/解吸试验 ;

　　— 第 5部分 :土壤淋溶试验 ;

　　— 第 6部分 :挥发性试验 ;

　　— 第 7部分 :生物富集试验 ;

　　— 第 8部分 :水-沉积物系统降解试验 ;

　　— 第 9部分 :鸟类急性毒性试验 ;

　　— 第 10部分:蜜蜂急性毒性试验 ;

　　— 第 11部分 :家蚕急性毒性试验 ;

　　— 第 12部分 :鱼类急性毒性试验 ;

　　— 第 13部分 :溞类急性活动抑制试验 ;

　　— 第 14部分 :藻类生长抑制试验 ;

　　— 第 15部分 :蚯蚓急性毒性试验 ;

　　— 第 16部分 :土壤微生物毒性试验 ;

　　— 第 17部分 :天敌赤眼蜂急性毒性试验 ;

　　— 第 18部分 :天敌两栖类急性毒性试验 ;

　　— 第 19部分 :非靶标植物影响试验 ;

　　— 第 20部分 :家畜短期饲喂毒性试验 ;

　　— 第 21部分 :大型甲壳类生物毒性试验 。

　　本部分是 GB/T 31270的第 16部分 。

　　本部分按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本部分由中华人民共和国农业部提出并归 口 。

　　本部分负责起草单位 :农业部农药检定所 、环保部南京环境科学研究所 。

　　本部分主要起草人 :程燕 、范继巧 、王娜 、韩志华 、赵玉艳 、王彦华 、李少男 、蔡道基 。

　　化学农药环境安全评价试验准则

　　第 16部分 :土壤微生物毒性试验

　　1 范围

　　GB/T 31270的本部分规定了 CO2 吸收法和氮转化法测定化学农药对土壤微生物毒性的材料 、条件 、操作 、质量控制 、数据处理 、试验报告等的基本要求 。

　　本部分适用于为化学农药登记而进行的土壤微生物毒性试验 ,其他类型的农药可参照使用 。

　　本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药 。

　　2 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　2. 1

　　化学农药 chemicalpesticide

　　利用化学物质人工合成的农药 。其中有些以天然产品中的活性物质为母体 ,进行仿制 、结构改造 ,创新而成 ,为仿生合成农药 。

　　同义词 :有机合成农药 synthetic organic pesticide。

　　[NY/T 1667. 1—2008,定义 2. 2. 1] 2.2

　　原药 technicalmaterial

　　在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物 ,必要时可加入少量的稳定剂 。

　　[NY/T 1667. 2—2008,定义 2. 5. 1] 2.3

　　制剂 formulation product

　　由农药原药(或母药)和助剂组成 、使用状态稳定的产品 。

　　[NY/T 1667. 2—2008,定义 2. 4] 2.4

　　有效成分 active ingredient;a.i.

　　农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分 。

　　[NY/T 1667. 2—2008,定义 2. 1] 2.5

　　供试物 testsubstance

　　试验中需要测试的物质 。

　　2.6

　　影响率 effectratio

　　供试物对土壤微生物呼吸强度的影响程度 ,包括抑制率和促进率 。供试物处理土壤呼吸强度低于对照土壤时 ,表现为抑制 ,供试物处理土壤呼吸强度高于对照土壤时 ,表现为促进 。

　　GB/T 31270. 16—2014

　　2.7

　　氮转化 nitrogen transformation

　　微生物通过氨化和硝化作用 ,将含氮有机物最终降解为无机终产物硝酸盐的过程 。

　　3 试验概述

　　3. 1 方法概述

　　土壤微生物毒性试验包括 CO2 吸收法和氮转化法 ,根据农药登记管理法规及其他规定选择相关方法进行试验 。

　　3.2 CO2 吸收法

　　在标本瓶内放置两只小烧杯 ,其中一只盛放土壤 ,另一只盛放碱液(如 NaOH 溶液) ,用于吸收土壤微生物呼吸所释放的 CO2 。 以模拟农药常用量 、10倍常用量 、100倍常用量时土壤表层 10 cm 土壤中的农药含量设 3种不同处理浓度 ,将标本瓶密闭并置于 25 ℃±1 ℃ 、黑暗条件下培养 ,并保持土壤含水量为最大田间持水量的 40% ~ 60% ,于试验开始后的第 1 天 、第 2 天 、第 4 天 、第 7 天 、第 11天 、第 15天更换出密闭瓶中的碱液 ,测定吸收的 CO2量 。评价供试物对土壤微生物活性的影响 。

　　3.3 氮转化法

　　过筛的土壤与适量有机底物混合后用供试物处理 , 同时设置一组不加供试物的对照 。试验至少需设置 2个测试浓度 ,可参考供试物田间最大施用量设置 。将土壤置于黑暗 、20 ℃ ±2 ℃的条件下培养 ,并保持土壤含水量为最大田间持水量的 40% ~ 60% ,在培养 0 d、7 d、14 d 和 28 d后 ,从处理组和对照组中取出一定量的土壤样品,用合适的溶剂浸提并测定提取液中硝酸盐的含量 。 比较处理组与对照组的硝酸盐形成率 ,计算处理组相对于对照组的百分比差异 。试验至少持续 28 d,如果第 28天处理组与对照组的差异不小于 25% ,则试验需延长 ,最长至 100 d。

　　4 试验方法

　　4. 1 材料和条件

　　4. 1. 1 供试物

　　农药制剂 、原药或纯品 。

　　4. 1.2 试验土壤

　　4. 1.2. 1 CO2 吸收法

　　选用 3种具有代表性的 、理化性质各异的土壤 ,试验前先去除土壤中的粗大物块(如石块 、植物残体等) ,然后过 0. 85 mm 筛 。

　　4. 1.2.2 氮转化法

　　试验只需一种土壤 ,对土壤的要求参见附录 A,土壤在用于试验前要先进行处理 ,先去除土壤中的粗大物块(如石块 、植物残体等) ,然后过筛 ,使土壤颗粒不大于 2 mm。

　　两种方法采用的土壤最好都为新鲜土壤 ,如果需要在实验室储存 ,则应置于 4 ℃ ±2 ℃黑暗处保存 ,最长保存 3个月(土 壤 的 采 集 、贮 存 方 法 参 见 附 录 B) 。 经 过 储 存 的 土 壤 , 在 试 验 前 需 进 行 预 培 养

　　2 d~28d。预培养期间土壤的培养条件应与试验条件一致 。此外 ,氮转化法所用的土壤在试验前还需补充适当的有机底物 ,例如 ,苜蓿-青草-青贮谷粉(主要组成部分 :紫花苜蓿 Medicago sativa) ,C/N 比在 12/1~ 16/1之间 。建议苜蓿粉与土壤的比率为每千克土壤(干重)用苜蓿粉 5 g。

　　4. 1.3 主要仪器设备

　　主要仪器设备如下 :

　　— 搅拌器 ;

　　— 培养箱 ;

　　— 振荡器 ;

　　— 离心机 ;

　　— 滴定仪 ;

　　— 硝酸盐测定仪 ;

　　— 标本瓶及其他玻璃器皿等 。

　　4. 1.4 试验条件

　　4. 1.4. 1 CO2 吸收法

　　土壤样品的培养条件为 25 ℃ ±1 ℃ ,黑暗 。试验过程中 ,保持土壤样品含水量在田间最大持水量的 40% ~ 60%之间 ,变化范围为 ±5% 。如有需要 ,可添加蒸馏水和去离子水进行调节 。

　　4. 1.4.2 氮转化法

　　土壤样品的培养条件为 20 ℃ ±2 ℃ ,黑暗 。试验过程中 ,保持土壤样品含水量在田间最大持水量的 40% ~ 60%之间 ,变化范围为 ±5% 。如有需要 ,可添加蒸馏水和去离子水进行调节 。

　　4.2 试验操作

　　4.2. 1 CO2 吸收法

　　4.2. 1. 1 处理与对照的设置

　　每种土壤设 3种不同浓度处理 , 以模拟农药常用量(推荐的最大用量) 、10倍量 、100倍量时土壤表层 10 cm 土壤中的农药含量(计算时假设土壤容重为 1. 5 g · cm3 ) , 同时设置一组空白对照 ,每组至少设置 3个重复 。

　　4.2. 1.2 受试物质的制备

　　水溶性供试物一般用水溶解制备 ,避免使用水以外的其他液体 ,如丙酮 、三氯甲烷等有机溶剂 , 以防止破坏微生物菌群 。对于难溶物质 ,可先用合适的溶剂溶解或悬浮 ,然后包埋石英砂(粒径 :0. 1 mm~ 0. 5 mm)等惰性固体 ,最后等溶剂完全挥发后再将石英砂与土壤混合 。 为使供试物在土壤中达到一个最佳的分布状态 ,建议每千克干重土壤中加入砂的比例为 10 g/kg。对照组的土壤样品用等量的水或砂进行处理 。混合时 ,应确保处理组中的供试物在土壤样品中均匀分布 , 同时要避免土壤压紧或结块 。

　　4.2. 1.3 土壤样品的培养

　　将混合后的土壤装于小烧杯中 , 与另一个装有标准碱液的小烧杯一起置于密闭瓶中 , 于 25 ℃ ± 1 ℃ 、黑暗条件下培养 。试验过程中 ,保持土壤样品含水量在田间最大持水量的 40% ~ 60%之间 ,变化范围为 ±5% 。如有需要 ,可添加蒸馏水和去离子水进行调节 。

　　4.2. 1.4 样品的采集与分析

　　试验开始后的第 1 天 、第 2 天 、第 4 天 、第 7 天 、第 11天 、第 15天时更换出密闭瓶中的碱液 ,用滴定法间接测定吸收的 CO2量 。

　　4.2.2 氮转化法

　　4.2.2. 1 处理与对照的设置

　　试验至少需设置 2个测试浓度 ,低浓度应至少能反映实际条件下能到达土壤的最大量(计算时假定供试物与 5 cm 的土壤均匀混合 ,且土壤容重为 1. 5 g · cm3 ) ,而高浓度应是低浓度的倍数 。对于直接施用至土壤的农药 ,应将试验浓度设置为最大预测环境浓度以及 5 倍的该浓度 。对于在 1 个季节中多次施入土壤的农药 ,其较低试验浓度应为最大施用次数与最大预测环境浓度的乘积 。但是 ,试验浓度的上限不应超过最大单次施用量的 10倍 。试验同时还需设置一组空白对照 ,每组至少设置 3个重复 。

　　4.2.2.2 受试物质的制备

　　水溶性供试物一般用水溶解制备 ,避免使用水以外的其他液体 ,如丙酮 、三氯甲烷等有机溶剂 , 以防止破坏微生物菌群 。对于难溶物质 ,可先用合适的溶剂溶解或悬浮 ,然后包埋石英砂(粒径 :0. 1 mm~ 0. 5 mm)等惰性固体 ,最后等溶剂完全挥发后再将石英砂与土壤混合 。 为使供试物在土壤中达到一个最佳的分布状态 ,建议每千克干重土壤中加入砂的比例为 10 g/kg。对照组的土壤样品用等量的水或砂进行处理 。混合时 ,应确保处理组中的供试物在土壤样品中均匀分布 , 同时要避免土壤压紧或结块 。

　　4.2.2.3 土壤样品的培养

　　可以采用两种方式培养土壤样品 :

　　— 每一个处理组及对照组的土壤各作为一个整体样品 ;

　　— 将每一个处理组及对照组的土壤分装成一系列单独且等份的子样品 。

　　当土壤以整体形式进行培养时 ,每个处理组及对照组均需准备大量的土壤样品,试验过程中根据需要取样分析 。每个处理组和对照组最初制备的土壤量取决于取样量 、样品分析的重复次数及最大取样次数 。整体培养的土壤在再次取样前应充分混合 。 当土壤以系列分装独立的子样品形式进行培养时 ,每个处理组和对照组的土壤根据需要来分装和使用 。所有测试中使用的容器应具有足够的上部空间 ,以避免产生厌氧状态 。

　　将样品置于 20 ℃ ±2 ℃ 、黑暗条件下培养 。试验过程中 ,保持土壤样品含水量在田间最大持水量的 40% ~ 60%之间 ,变化范围为 ±5% 。如有需要 ,可添加蒸馏水和去离子水进行调节 。

　　4.2.2.4 样品的采集与分析

　　试验至少持续 28d,如果第 28天时处理组与对照组的差异不小于 25% ,则试验需延长 ,直至该差异等于或小于 25% ,但最长不超过 100d。在试验 0 d、7 d、14d和 28d取样分析 。如需延长试验 ,则应在 28d后每隔 14d测定一次 。每次取样时 ,均需测定每个处理组和对照组样品的硝酸盐含量 。用合适的提取剂(如 0. 1 mol/L的氯化钾溶液)与土壤样品混合振荡 ,提取硝酸盐 ,建议每千克干重土壤中加入氯化钾溶液的比例是 5 mL/g。为优化提取效果 ,容器中所装的土壤和提取剂不应超过容器体积的 一半 。混合物在 15. 7 rad/s 的转速下振荡 60 min。将混合物离心或过滤后取液相分析其硝酸盐含量 。

　　4.3 数据处理

　　4.3. 1 CO2 吸收法

　　记录每个平行滴定时消耗的酸的体积 ,求出所有平行的平均值 ,用统计学方法计算土壤样品释放出

　　的 CO2量以及处理组相对于对照的影响率 。

　　4.3.2 氮转化法

　　记录每个平行土壤样品形成的硝酸盐量 ,求出所有平行的平均值 ,用统计学方法计算氮转化率 。形成的硝酸盐量以每天每千克干重土壤产生硝酸盐的毫克数表示 ,单位为 mg/(kg · d) 。 比较每个处理组和对照组中土壤样品的硝酸盐形成速率 ,并计算出处理组偏离对照组的百分率 。

　　4.4 质量控制

　　质量控制条件包括 :

　　— 各处理土壤中 ,供试物的加入量 、供试物在土壤中的均匀度要保持一致(两种方法均适用) ;

　　— 培养期间 ,各标本瓶要保持密闭(适用于 CO2 吸收法) ;

　　— 滴定操作时 ,对滴定终点的判断要准确一致(适用于 CO2 吸收法) ;

　　— 对照组重复之间的差异应小于 ±15%(适用于氮转化法) 。

　　5 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 :

　　a) 完整的试验土壤信息(两种方法均适用)完整的试验土壤信息包括 :

　　— 取样点的地理位置和背景信息 ;

　　— 取样深度(cm) ;

　　— 土壤理化性质(颗粒组成、pH、有机碳含量 、氮含量 、初始硝酸盐浓度 、阳离子交换量 、微生物生物量等) ;

　　— 土壤采集和保存情况 ;

　　— 土壤预培养的细节 。

　　b) 供试物信息(两种方法均适用)

　　包括供试农药的通用名 、化学名称 、结构式 、CAS号 、纯度 、基本理化性质 、来源等 。

　　c) 底物(适用于氮转化法)底物信息包括 :

　　— 来源 ;

　　— 组成 ;

　　— 碳 、氮含量 。

　　d) 试验条件

　　试验条件包括 :

　　— 试验设置浓度及组数 ;

　　— 向土壤中施入供试物的详细步骤 ;

　　— 培养温度 ;

　　— 稀释水 ;

　　— 试验期间各处理土壤中加水的频率和方法 ;

　　— 试验开始时和试验过程中的土壤湿度 ;

　　— 土壤的培养方式 ;

　　— 取样次数 ;

　　— 土壤 CO2 释放量测定方法(适用于 CO2 吸收法) ;

　　— 从土壤中浸提硝酸盐的方法(适用于氮转化法) ;

　　— 用于分析测定硝酸盐含量的方法和仪器(适用于氮转化法) 。

　　e) 结果

　　结果包括 :

　　— 数据分析方法 、土壤 CO2 释放量随时间变化的曲线图 、农药对土壤微生物呼吸强度的影响率(适用于 CO2 吸收法) ;

　　— 各组各平行的硝酸盐含量 ,处理组和对照组之间的差异(适用于氮转化法) ;

　　— 有助于解释结果的全部信息和观察资料 ;

　　— 对土壤微生物的毒性等级划分参见附录 C。

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　氮转化法对土壤的要求

　　氮转化法对土壤的要求参见表 A. 1。

　　表 A. 1 氮转化法试验土壤应具备的特征

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　试验土壤的采集与贮存

　　B. 1 土壤的采集

　　选择的土壤采集点应能长期使用 ,需了解土壤采集点的详细背景信息 ,包括 :地点 ,植被覆盖情况 ,农药 、肥料等的施用情况 。要求采样地点在采样前至少一年内未施用过农药 ,至少 6个月内未施用过有机肥 。如果在必需的情况下施用了无机肥 ,则应在施肥至少 3个月后才能采集土壤 。

　　应避免在长时间干旱或水涝期间(超过 30 d) 采样 , 或在此期后立即采样 。 在耕地 ,采样的深度为0 cm~20 cm;在长期没有耕作(至少一个生长季节)的草场牧地或其他类型的土壤中采样时 ,最大深度可略超过 20 cm。

　　运输土壤样品时应使用合适的容器 ,并保持适宜的温度以确保土壤的性质不会发生显著的改变 。

　　B.2 土壤的贮存

　　土壤风干后应置于 4℃±2℃黑暗处保存 ,最长可保存 3 个月 。 土壤在储存期间应保持有氧条件 。如果采样地区每年至少有 3个月冰冻期 ,则采集的土壤可在 -22℃ ~-18℃条件下储存 6个月 。用于氮转化试验的土壤 , 在 每 次 试 验 前 应 测 定 土 壤 微 生 物 的 生 物 量 , 其 碳 含 量 应 至 少 占 土 壤 有 机 碳 含 量的 1% 。

　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　农药对土壤微生物毒性的毒性等级划分

　　C. 1 CO2 吸收法

　　CO2 吸收法中 ,农药对土壤微生物的毒性分成三个等级 :土壤中农药加量为常量 ,在 15 d 内对土壤微生物呼吸强度抑制达 50%则划分为高毒 ; 土壤中农药加量为常量 10倍 , 能达到上述抑制水平的 ,划分为中毒 ;土壤中农药加量为常量 100倍 ,能达到上述抑制水平的 ,划分为低毒 ;若三种处理均达不到上述抑制水平 ,则同样划分为低毒 。

　　C.2 氮转化法

　　在试验 28d后的任何时间所取样品,若测定其低浓度处理组和对照组的硝酸盐形成速率的差异不大于 25% ,则可认为该农药对土壤中的氮转化没有长期影响 。

　　参 考 文 献

　　[1] NY/T 1667. 1—2008 农药登记管理术语 第 1 部分 :基本术语

　　[2] NY/T 1667. 2—2008 农药登记管理术语 第 2 部分 :产品化学

　　[3] OECD(2000) . Guideline 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test, OECD Guidelines for the Testing ofChemicals.

　　[4] 蔡道基 . 农药环境毒理学研究 . 北京 : 中国环境科学出版社 ,1999.