GB/T 28660-2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记

　　ICS 65. 020 B 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 28660—2012

　　马铃薯种薯真实性和纯度鉴定

　　SSR分子标记

　　Genuinenessandpurity verification ofpotato seed-tuber—

　　SSR molecularmarker

　　2012-09-03发布 2012-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 28660—2012

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37)归 口 。

　　本标准起草单位 :云南师范大学薯类作物研究所 、中国农科院蔬菜花卉研究所 、东北农业大学农学院 、华中农业大学园艺学院 、黑龙江省农业科学院农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心 、国际马铃薯中心(CIP)北京联络处 。

　　本标准主 要 起 草 人 : 李 灿 辉 、郝 大 海 、金 黎 平 、杨 仕 忠 、管 朝 旭 、黄 三 文 、陈 伊 里 、谢 从 华 、白 艳 菊 、谢开云 。

　　Ⅰ

　　GB/T 28660—2012

　　马铃薯种薯真实性和纯度鉴定

　　SSR分子标记

　　1 范围

　　本标准规定了 SSR分子标记鉴定马铃薯(Solanum tuberosum L. )品种的方法 。

　　本标准适用于马铃薯种薯真实性和纯度的检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB 18133 马铃薯脱毒种薯

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　简单序列重复 simplesequencerepeat;SSR

　　基因组中由 1个 ~ 6个核苷酸组成的基本单位串联多次重复构成的 DNA序列 。

　　3. 2

　　聚合酶链式反应 polymerasechain reaction;PCR

　　在耐热 DNA 聚合酶作用下 ,于体外快速大量特异性扩增特定 DNA序列的方法 。

　　4 仪器和试剂

　　4. 1 仪器及用具

　　4. 1. 1 梯度 PCR仪 。

　　4. 1. 2 低温高速离心机 。

　　4. 1. 3 电泳仪(满足 3 000 V稳压)及配套电泳槽 。

　　4. 1. 4 凝胶成像分析系统 。

　　4. 1. 5 冰箱( -28 ℃ ~4 ℃) 。

　　4. 1. 6 紫外/可见分光光度计 。

　　4. 1. 7 电热恒温水浴锅(37℃ 、42℃ 、65℃和 95℃) 。

　　4. 1. 8 制冰机 。

　　4. 1. 9 涡旋仪 。

　　4. 1. 10 高压灭菌器 。

　　4. 1. 11 液氮罐 。

　　4. 1. 12 酸度计(pH 计) 。

　　4. 1. 13 脱色摇床 。

　　1

　　GB/T 28660—2012

　　4. 1. 14 微量移液器(0. 5 μL~ 10 μL、10 μL~ 100 μL、100 μL~ 1 000 μL)及配套的枪头 。

　　4. 1. 15 其他用具 :PCR管 、量筒(100 mL~ 1 000 mL) 、1. 5 mL离心管和配套的研磨棒 。

　　4. 2 试剂

　　4. 2. 1 常用贮备液 :见附录 A。

　　4. 2. 2 DNA提取试剂 :见附录 B。

　　4. 2. 3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 :见附录 C。

　　4. 2. 4 银染试剂 :见附录 D。

　　4. 2. 5 SSR(简单重复序列)标记引物 :见附录 E。

　　4. 2. 6 TaqDNA 聚合酶(TaqDNA polymerase)和配套的 PCR缓冲液 。

　　4. 2. 7 DNA Marker (50bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、300 bp、350 bp、400 bp、500 bp) 。

　　4. 2. 8 无 DNA酶的 RNA酶 A(DNase-free RNaseA,10 mg/mL) 。

　　4. 2. 9 β-巯基乙醇 。

　　4. 2. 10 四甲基二乙胺(TEMED) 。

　　4. 2. 11 异丙醇 。

　　4. 2. 12 乙醇(70%、90%、95%) 。

　　4. 2. 13 灭菌双蒸水(ddH2 O) 。

　　5 供试材料

　　5. 1 取样

　　按照 GB 18133要求的方法 ,采集大田植株或块茎作为检测样品 。

　　5. 2 样品保存

　　选取适量样品,装入冻存管 ,液氮速冻 ,置冰箱( -20℃以下)中保存备用(有效保存期约 6个月) 。

　　6 程序

　　6. 1 总 DNA提取

　　6. 1. 1 称取 100mg样品,置于预冷 1. 5 mL离心管中 ,液氮冷冻下迅速研磨成细粉 。依次加入 700μL的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液(见表 B. 1)和 2 μL的 β-巯基乙醇 ,涡旋混匀 。

　　6. 1. 2 置 65 ℃水浴 1 h,期间每隔 10 min摇动混匀一次 。

　　6. 1. 3 冰上冷却约 10 min后 ,加入 700 μL的三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1) 混合液(见表 B. 2) , 涡旋混合 ,轻缓颠倒混匀数次 。 12 000 r/min离心 5 min。

　　6. 1. 4 吸取上层水相至新 1. 5 mL离心管中 ,加入等体积(400μL ~ 500 μL)的预冷异丙醇 。轻缓颠倒混匀 ,4℃冰箱静置 30 min后 ,12 000 r/min离心 15 min。

　　6. 1. 5 弃上清液 。 向离心管中加入 70%乙醇 1. 0 mL,静置 3 min后 ,12000 r/min离心 20min。小心倒出 70%乙醇 ,再加入 90%乙醇 1. 0 mL,静置 5 min后 ,12000 r/min离心 10min,小心倒去乙醇 。在干净的吸水纸上倒置离心管 , 自然干燥 15 min。 晾干的 DNA,应为透明状 。

　　6. 1. 6 加入 100 μL的 1× TE缓冲液[将 10倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(见表 B. 3)稀释 10倍并灭菌]溶解 DNA,再加入 2 μL的无 DNA酶的 RNA酶 A(10mg/mL) 。37 ℃温浴 1 h 去除RNA。4 ℃冰箱放置备用 。

　　6. 1. 7 取 DNA提取液 1 μL ~ 5 μL于新的 1. 5 mL离心管中 ,加入 1× TE缓冲液稀释至 1. 0 mL,混

　　2

　　GB/T 28660—2012

　　匀后转入石英比色皿中 ,用紫外/可见分光光度计测定 OD260和 OD280下的光密度值 。按式(1)计算提取液中 DNA浓度 ,并检测质量(OD260/OD280 比值为 1. 8 ~ 1. 9表明纯度较高) 。

　　DNA …………………………( 1 )

　　式中 :

　　dsDNA — 双链 DNA分子的含量 ,单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　OD260 — 260 nm 下的光密度值 ;

　　t — 稀释倍数 。

　　6. 1. 8 用 1×TE缓冲液将所提取的总 DNA稀释为 50 ng/μL,根据每次用量分装 ,置 -20℃冰箱保存备用 。

　　6. 2 PCR反应

　　6. 2. 1 PCR反应体系

　　在冰盘中或 4 ℃条件下按表 1所列成分和用量 ,顺序依次加入 PCR管 ,准备 PCR反应体系 。

　　表 1 PCR反应体系(供 1 个样品、1对 SSR 引物检测 ,25μL)

　　成 分

　　用量/μL

　　ddH2 O

　　16. 1

　　10× PCR 缓冲液

　　2. 5

　　dNTPs(2. 5 mmol/L,每一种)

　　2. 0

　　正向引物 (10 mmol/L)

　　1. 0

　　反向引物 (10 mmol/L)

　　1. 0

　　TaqDNA 聚合酶 (2. 5 U/μL)

　　0. 4

　　DNA 模板 (50ng/μL)

　　2. 0

　　总体积

　　25. 0

　　6. 2. 2 反应程序

　　按表 2程序设置 PCR反应流程 。

　　表 2 PCR反应程序

　　反应程序

　　时间

　　备注

　　94 ℃ 预变性

　　5 min

　　94 ℃ 变性

　　1 min

　　55 ℃ 退火

　　1 min

　　不同 SSR 引物所需的退火温度见附录 E

　　72 ℃ 延伸

　　1 min

　　循环次数

　　35次

　　变性→ 退火→ 延伸反应循环次数

　　72 ℃ 延伸

　　5 min

　　4 ℃ 终止反应

　　3

　　GB/T 28660—2012

　　6. 2. 3 PCR产物变性处理

　　PCR结束后 ,于 25μL的反应体系中加入 7. 0 μL的上样缓 冲 液(见 表 A. 4) , 95℃水 浴 变 性 处 理5 min后 ,立即转入冰浴冷却 ,备用 。

　　6. 3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　6. 3. 1 电泳玻璃板清洗

　　用洗涤剂仔细清洗电泳玻璃板(长板和短板) , 自来水漂洗干净 ,再用蒸馏水冲洗 ,斜置滤干 ,最后用95%乙醇冲洗 ,并空置晾干 。使用之前 ,再次用无水乙醇将玻璃板擦拭干净 。

　　注 : 洗板时 ,长板和短板分别单独清洗 , 以避免相互污染 。

　　6. 3. 2 电泳玻璃板处理

　　短板处理 :用镜头纸蘸取适量 2% 剥离硅烷溶液(见表 C. 1) ,均匀地涂布在短板上;5 min~ 10 min后 ,喷施数毫升 95%乙醇 ,用干净的镜头纸擦去多余的 2%剥离硅烷 ;空置约 20 min, 晾干 。

　　长板处理 :更换新手套 ,用镜头纸蘸取适量亲和硅烷溶液(见表 C. 2) ,均匀涂布在长板上 ;4 min~ 5 min后 ,用镜头纸蘸取 95%乙醇沿一定方向轻轻地擦拭 ;此后 ,再用 95%乙醇沿着与前次操作方向相垂直的方向轻轻地擦拭 ,如此擦洗 3 次 , 以去除多余的亲和硅烷 ;空置约 20 min, 晾干 。

　　注 : 剥离硅烷和亲和硅烷均有剧毒 ,涂板处理时 ,需 带 手 套 操 作 , 避 免 两 种 溶 液 相 互 污 染 。剥 离 硅 烷 溶 液 处 理 的 目的是使短板容易与凝胶分离 ;亲和硅烷溶液处理的目的是使聚丙烯酰胺凝胶能很好地附着在长板上面 ,不易剥离 。

　　6. 3. 3 胶槽装配

　　将长板 、短板和压条装配好 ,周边用胶带密封 ,用夹子夹紧 ,插入合适的梳子 , 以方便灌胶的倾斜角度放置在安全支架上 。

　　6. 3. 4 灌胶

　　取 6. 0%变性聚丙烯酰胺贮备液(见表 C. 5)60 mL,加入 10%过硫酸铵贮备液(见表 C. 4)300μL,四甲基二乙胺(TEMED) 60 μL,轻轻混匀 。轻缓抽出梳子 ,沿压条边缘轻缓地将混匀的凝胶溶液注入胶槽中 ,及时清除 可 能 出 现 的 气 泡 后 , 重 新 将 梳 子 插 入 至 适 当 位 置 。 将 胶 板 调 至 水 平 位 置 , 室 温 下(20 ℃ ~ 25 ℃) 放置 2 h 以上 , 以便凝胶完全凝固 。

　　6. 3. 5 预电泳

　　待凝胶完全凝固后 ,小心拔出梳子 ,并用 1× TBE缓冲液[将 10倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液(见表 A. 3)稀释 10倍]清洗和整理样品槽 。去掉密封胶带 ,用吸水纸将玻璃板擦干 , 以防电泳时短路 。将胶板装到电泳槽中 ,加入电泳缓冲液(1× TBE缓冲液) ,清除样品槽中的气泡 ,接通电源 , 以 70W 的恒定功率预电泳 30 min。

　　6. 3. 6 电泳

　　预电泳结束后 ,用 1× TBE缓冲液仔细清洗和整理样品槽 ,去除预电泳扩散出的尿素 。 根据检测样品数量 ,分别于每个样品槽中加入已经变性处理的 PCR产物 6 μL~ 8 μL;并在胶板的一侧或适当位置的样品槽中加入 4 μL的 DNA Marker。 以 70W 恒定功率电泳 2 h~ 3 h,或电泳至上样缓冲液中示踪染料的第一条带迁移至胶板底端为止 。

　　4

　　GB/T 28660—2012

　　6. 4 银染

　　6. 4. 1 固定/脱色

　　从电泳槽中取出胶槽 ,轻轻取下短板 ,将附着胶板的长板放入装有适量固定/脱色液(见表 D. 1) 的塑料方盒中 ,轻轻摇动 20 min~ 30 min,至胶板上示踪染料的色带全部退去为止 。

　　6. 4. 2 漂洗

　　将胶板转入 dd H2 O 中漂洗 2 次 ~ 3 次 ,每次 2 min。取出胶板 ,滤去水分 。

　　6. 4. 3 染色

　　将胶板转入硝酸银染色液(见表 D. 2)中染色 30 min。

　　6. 4. 4 水洗

　　在 dd H2 O 中迅速漂洗 5 s~ 6 s。

　　6. 4. 5 显影

　　将胶板迅速转入预冷至 4℃的显影液(见表 D. 3)中 ,轻轻摇动至胶板上预期产物条带(见表 E. 1)清晰为止 。

　　6. 4. 6 定影

　　待影像清晰后 ,将胶板迅速转入固定/脱色液(见表 D. 1)中 ,停止显影 。定影 3 min~ 5 min。

　　6. 4. 7 漂洗

　　将胶板转入 ddH2 O 中漂洗 2 次 ,每次 5 min。

　　6. 4. 8 成像

　　在白色透射光背景上观察和记录电泳结果 ,数码拍照 ;或用凝胶成像分析系统扫描记录和拍照 。

　　7 结果记录和分析

　　7. 1 SSR标记结果记录

　　参照 DNA Marker电泳结果或扫描结果 ,根据每对 SSR引物从检测样品中扩增出的条带数及其分子量大小 ,按 “有 ”对应条带记录为“1”、“无 ”对应条带记录为“0”的方法 ,仔细记录每对 SSR 引物的 PCR扩增结果 。建立 SSR引物 、检测样品及有无(1/0)对应扩增条带的数据库 。

　　7. 2 SSR标记结果分析

　　利用相关统计分析软件 ,根据 Nei(1973)的遗传相似系数(GeneticSimilarity, GS) ,按式(2)计算检测样品间的遗 传 相 似 性 水 平 。 采 用 非 加 权 组 平 均 法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)进行聚类分析 ;绘制聚类分析结果图 ,显示 SSR标记分析的直观结果 。

　　…………………………( 2 )

　　5

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　　式中 :

　　GS— 遗传相似系数 , % ;

　　Ni — 第i个样品的扩增条带数 ;

　　Nj — 第 j 个样品的扩增条带数 ;

　　Nij — 第i个样品和第j个样品共有的扩增条带数 。

　　8 鉴定结果判定

　　8. 1 种薯真实性鉴定

　　直接比较待测品种与标准品种样品的标记分析结果 ,如在本标准要求的 12个 SSR标记位点上 ,待测品种样品与标准品种样品之间不存在多态性条带 ,则判定为同一品种 ;如存在多态性条带 ,则判定为不同的品种 。或根据聚类分析结果 ,如待测品种与标准品种样品间无 100%的遗传相似性 ,则判定为不同样品,即判定为不同的品种 。

　　8. 2 种薯纯度检测

　　根据聚类分析结果 ,如在本标准要求的 12个 SSR 标记 位 点 上 , 所 有 检 测 样 品 间 的 遗 传 相 似 性 为100% ,则判定为相同样品,即种薯纯度(P) 为 100% 。如达不到 100%的遗传相似性水平 ,则根据有差异的检测样品数量(S)占总抽样检测样品数量(T)的百分比来判定种薯纯度 。计算见式(3) :

　　P …………………………( 3 )

　　式中 :

　　P — 种薯纯度 , % ;

　　S — 有差异的检测样品数量 ;

　　T— 总抽样检测样品数量 。

　　6

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　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　常用贮备液

　　表 A. 1 至表 A. 5 给出了常用的贮备液 。

　　表 A. 1 1. 0 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸贮备液(Tris-HCl贮备液)(pH8. 0, 1 000mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)

　　121. 1 g

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　800 mL

　　37%浓盐酸 (HCl)

　　~ 42 mL

　　用约 42 mL浓盐酸调节 pH 至 8. 0

　　最终体积

　　1 000 mL

　　用 ddH2 O 定容至 1 000 mL。灭菌后 ,室温保存

　　表 A. 2 0. 5 mol/L 乙二胺四乙酸贮备液(EDTA贮备液)(pH8. 0, 1 000mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　乙二胺四乙酸二钠 (Na2 EDTA-2H2 O)

　　186. 1 g

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　700 mL

　　10 mol/L氢氧化钠 (NaOH)

　　~ 50 mL

　　用约 50 mL氢氧化钠调节 pH 至 8. 0

　　最终体积

　　1 000 mL

　　用 ddH2 O 定容至 1 000 mL。灭菌后 ,室温保存

　　表 A. 3 10倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液(10× TBE缓冲液)(pH8. 0, 1 000mL)

　　成分

　　用量

　　备注

　　Tris碱 (tris base)

　　108 g

　　硼酸 (boric acid)

　　55 g

　　0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　37. 25 mL

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　800 mL

　　用 ddH2 O 定容至 1 000 mL

　　最终体积

　　1 000 mL

　　灭菌后 ,室温保存

　　表 A. 4 上样缓冲液(50mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　98%甲酰胺 (formamide)

　　47 mL

　　0. 2 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　2. 5 mL

　　溴酚蓝(bromophenol)

　　0. 25 g

　　也可用 5 mL ddH2 O 溶解后 ,按需要量加入

　　二甲苯青(xylene cyanol)

　　0. 25 g

　　最终体积

　　50 mL

　　4 ℃冰箱保存

　　7

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　　表 A. 5 10mg/mL硫代硫酸钠贮备液(100mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　硫代硫酸钠 (sodium thiosulfate)

　　1 g

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　100 mL

　　最终体积

　　100 mL

　　4 ℃冰箱保存

　　8

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　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　DNA提取试剂

　　表 B. 1 至表 B. 3 给出了 DNA提取试剂 。

　　表 B. 1 两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液(2× CTAB缓冲液,pH8. 0, 1 000mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　1. 0 mol/LTris-HCl(pH8. 0)

　　100 mL

　　0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　40 mL

　　氯化钠 (NaCl)

　　81. 82 g

　　加入 600 mL ddH2 O加热搅拌

　　十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)

　　20 g

　　聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)

　　2 g

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　用 ddH2 O 定容至 1 000 mL

　　最终体积

　　1 000 mL

　　灭菌后 ,室温保存

　　表 B. 2 三氯甲烷 ∶ 异戊醇混合液(24 ∶ 1, 100mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　三氯甲烷 (chloroform)

　　96 mL

　　异戊醇 (lsoamylol)

　　4 mL

　　最终体积

　　100 mL

　　临时配制

　　表 B. 3 10倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(10× TE缓冲液,pH8. 0, 1 000mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　1. 0 mol/LTris-HCl(pH8. 0)

　　100 mL

　　0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0)

　　20 mL

　　灭菌双蒸水 (ddH2 O)

　　800 mL

　　用 ddH2 O 定容至 1 000 mL

　　最终体积

　　1 000 mL

　　灭菌后 ,室温保存

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　　GB/T 28660—2012

　　附 录 C

　　(规范性附录)

　　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂

　　表 C. 1 至表 C. 5 给出了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 。

　　表 C. 1 2% 剥离硅烷(repelsilane)溶液(500mL)

　　成分

　　用量

　　备 注

　　剥离硅烷(repelsilane)

　　10 mL

　　三氯甲烷 (chloroform)

　　490 mL

　　最终体积

　　500 mL

　　室温保存

　　表 C. 2 亲和硅烷(bindingsilane)溶液

　　成分

　　用量

　　备 注

　　无水乙醇 (ethanol)

　　3 mL

　　亲和硅烷 (binding silane)

　　10 μL

　　冰乙酸 (glacialacetic acid)

　　10 μL

　　最终体积

　　3. 02 mL

　　现配现用 ,约一块玻板的用量

　　表 C. 3 6. 0%变性聚丙烯酰氨贮备液(1000mL)

　　成分