GB/T 40140-2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40140—2021

　　葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofgrapespike-stalkbrownspot

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

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　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波海关。

　　本文件主要起草人：吴品珊、段维军、雷荣、徐晗。

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　　葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件规定了葡萄轴枯病菌的分离培养、形态学鉴定、分子生物学鉴定方法。

　　本文件适用于葡萄上葡萄轴枯病菌的检疫和鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 葡萄轴枯病菌的分类信息

　　中文名：葡萄轴枯病菌

　　英文名：grape spike-stalk brown spot

　　病原学名及中文名：Alternariaalternata (Fr.) Keissler,链格孢

　　异名：Alternariaalternata var.rosicola V. G. Rao、Alternariafasciculata (Cooke & Ellis) L. R. Jones & Grout、Alternariarugosa McAlpine、Alternariatenuis Nees、Alternariatenuisf.chalaroides Sacc.、Alternariatenuis f. genuina Unamuno、Alternariatenuis f. trichosanthis D. Sacc.、Alternaria tenuis var. mali Marchal & ?.J. Marchal、Macrosporium fasciculatum Cooke & Ellis、Torula alternata Fr.

　　分类地位：真菌界 Fungi, 子囊菌门 Ascomycota, 座囊菌纲 Dothideomycetes, 格孢腔菌 目 Pleospo- rales, 格孢腔菌科 Pleosporaceae。

　　葡萄轴枯病菌的其他信息见附录 A。

　　5 方法原理

　　依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性，根据该真菌 DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光 PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化，对病菌进行综合检疫鉴定。

　　6 试剂、材料和培养基

　　6 . 1 试剂和材料

　　除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。

　　试剂包括：次氯酸钠溶液( 活性氯 >10%)、琼脂粉、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、CTAB 提取缓冲液 、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNase A、液氮、苯酚、氯仿、蛋白酶 K、TaqDNA

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　　聚合酶、dNTP、TaqMan Master Mix、核酸染料、DNA分子质量标准物等。

　　材料包括：植物基因组提取试剂盒、普通 PCR 反应试剂盒、TaqMan 荧光 PCR 反应试剂盒、50 × TAE 电泳缓冲液。

　　6 . 2 培养基

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯胡萝 卜琼脂培养基(PCA),具体配方的信息见附录 B。

　　7 仪器和用具

　　7 . 1 仪器

　　生物显微镜(放大倍数 400 倍以上)、体视显微镜、二次纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、离心机、PCR仪、实时荧光 PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量 0 . 01 g)、冰箱。

　　7 . 2 用具

　　可调移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL), 吸头，离心管，Eppendorf管 (0.2 mL、0.5 mL、

　　1 . 5 mL),塑料研杵，液氮罐。

　　8 检疫鉴定方法

　　8 . 1 症状检查与病害症状

　　观察葡萄果穗分枝穗轴部位是否有变褐干枯，果粒是否失水萎蔫，表皮是否有褐斑或霉状物。

　　病害症状主要在幼穗的分枝穗轴上，初期有褐色水浸状斑点，后向主穗轴扩展形成褐色病斑，穗轴变褐坏死，不久失水干枯，花穗易在分枝处折断，严重时，整个穗轴及其果柄全部变褐坏死，花蕾或花几乎全部落光。 幼小果粒发病表皮上有圆形深褐色小斑，果粒膨大，病斑表面呈疮痂状，病痂脱落，果穗也萎缩干枯。 湿度大时病斑上可见黑色霉层，即病菌菌丝、分生孢子梗、分生孢子链和分生孢子。 病害症状见图 A. 1 。

　　8 . 2 分离培养

　　将葡萄穗轴用流水冲洗干净，在穗轴的病健交界处切取 0 . 5 cm~1 . 0 cm 左右的小段，用 1%次氯酸钠消毒 5 min,无菌水冲洗 3 次，置于灭菌滤纸上吸去表面水分，放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)或带三层无菌湿滤纸的培养皿上，在 25 ℃下，两支 40 W 灯管(色温 4 200 K) 12 h 光照、12 h 黑暗交替培养 3 d~4 d,灯管距离培养物约 40 cm。

　　有疑似菌落的培养皿置于体视显微镜 50×下观察，用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子链上的单个孢子，转接于马铃薯胡萝 卜琼脂培养基(PCA) 上，在 22 ℃下，两支 40 W 灯管(色温 4 200 K) 8 h 照射和 16 h黑暗交替进行培养，灯管距离培养物约 40 cm,培养物面向上，1 周后观察。

　　8 . 3 形态学鉴定

　　8 . 3 . 1 培养物观察与测量

　　将上述培养物在体视显微镜 50×下观察分生孢子梗产生的分生孢子和分生孢子链的特征(产孢表型)，显微镜下测量分生孢子大小包括长、宽、喙长、横纵(斜)隔膜数，孢子颜色，孢子表面有无突起等，测量分生孢子和喙胞的大小各 30 个 。

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　　8 . 3 . 2 病菌形态学特征

　　葡萄轴枯病菌菌落深灰色至暗青褐色，菌丝密集，褐色，分隔，多分枝。 分生孢子梗单生或簇生，直立或弯曲，有分隔，在其上部形成具短分枝的分生孢子链。 分生孢子单生或短链生，近椭圆形、卵形或倒

　　棍棒状，呈淡褐色至暗褐色，表面光滑或具微刺;成熟时具 2 个 ~8 个横隔膜，1 个 ~4 个纵、斜隔膜;分生孢子一般 2 个 ~8 个串生在一起，单生较少，大小(17. 5 μm~40.0 μm) × (5.0 μm~ 12. 5 μm), 平均

　　26.5 μm×9.1 μm,短喙圆柱形或锥形，褐色，大小(2.5 μm~12.5 μm) × (2.5 μm~5.0 μm),部分转变为产孢细胞，可二次分枝或产孢。 形态图见附录 A 中 A. 4 。

　　8 . 4 分子生物学鉴定

　　8 . 4 . 1 DNA提取

　　将分离的疑似病菌收集，放入浸在液氮里的 1 . 5 mL 离心管中，用一次性塑料杵碾碎，按照 CTAB法或植物基因组提取试剂盒提取 DNA。 DNA提取方法按照附录 C操作。

　　8 . 4 . 2 常规 PCR检测

　　采用特异性引物 AaltFor/AaltRev,按照附录 D进行常规 PCR检测。

　　8 . 4 . 3 实时荧光 PCR检测

　　采用实时荧光 PCR特异性引物 OPAF/R和 TaqMan探针 OPAP,按照附录 E进行实时荧光 PCR检测。

　　9 结果判定

　　病害症状和分离物的形态特征与 8 . 1 和 8 . 3 描述的一致，且常规 PCR 特异性引物扩增结果符合附录 D为阳性或实时荧光 PCR检测结果符合附录 E 为阳性，可判定为检出葡萄轴枯病菌。

　　10 样品和档案保存

　　10 . 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存。 检出葡萄轴枯病的样品经登记签字，保存于 4 ℃冰箱中，至少保存 6 个月以备复核，保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 对不需要长期保存的染病材料应及时高压灭菌处理。

　　10 . 2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　葡萄轴枯病的其他信息

　　A.1 危害情况

　　葡萄轴枯病也叫葡萄穗轴褐枯病，发病一般在开花前后。 主要危害葡萄幼嫩的穗轴，使穗轴变褐枯死，危害严重。

　　传播途径：病菌以分生孢子在葡萄枝蔓表皮以及在病残体越冬，为翌年初侵染来源。 葡萄开花前至开花期为病菌的主要侵染时期，以分生孢子通过伤口或自然孔口侵入幼穗穗轴的表皮组织。 病菌近距离传播主要靠染病穗轴上的分生孢子和农事操作，远距离传播主要靠葡萄贸易。

　　葡萄轴枯病在我国一些葡萄产区有分布，多雨或空气湿度大的地区和年份发生较多。 严重时，发病穗率可达 20%~40%,导致减产 10%~30%,严重的减产 40% 以上。 该病害是新西兰和澳大利亚进口中国鲜食葡萄上关注的有害生物。

　　A.2 病原菌情况

　　引起葡萄轴枯病的致病病原菌一直存有争议，最早国内认为葡生交链孢菌(Alternaria℃iticola)是致病菌，国外研究认为是由链格孢菌(Alternariaalternata)引起。 近年经广泛搜集资料和采集样本，发现引起国内葡萄轴枯病的致病菌非以往报道的葡生交链孢菌(Alternaria℃iticola)，而主要是链格孢菌(Alternariaalternata)。

　　A.3 病害症状

　　葡萄轴枯病菌病害症状见图 A. 1 。

　　图 A.1 葡萄轴枯病菌病害症状

　　A.4 病菌形态特征

　　葡萄轴枯病菌分生孢子链和分生孢子见图 A. 2 。

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　　a)分生孢子链 b)分生孢子

　　注：引 自 Woudenberg J.H.C.等，2013。

　　图 A.2 葡萄轴枯病菌分生孢子链和分生孢子(图中标尺为 10 μm)

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　培养基配制方法

　　B.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)

　　称取去皮马铃薯 200 g,切片，加适量蒸馏水煮沸 20 min左右，双层纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖20 g,琼脂粉 17 g,加蒸馏水补足至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

　　B.2 马铃薯胡萝 卜琼脂培养基(PCA)

　　称取去皮马铃薯 20 g,胡萝 卜 20 g,切片，加适量蒸馏水煮沸 20 min左右，双层纱布过滤，在滤液中加入琼脂粉 17 g,加蒸馏水补足至 1 000 mL, 121 ℃高压灭菌 20 min。

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　　附 录 C (规范性) DNA提取

　　C.1 试剂

　　C.1 . 1 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)DNA提取缓冲液

　　十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) 4 g, 乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA ·2H2 O, 0.5 mol/L) 8 mL, 氯化钠(NaCl) 16.4 g, 1 mol/L 三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 20 mL, 巯基乙醇(C2 H6 OS) 4 mL,加蒸馏水定容至 200 mL,调 pH 至 8.0 , 121 ℃高压灭菌 30 min。

　　C.1 . 2 蛋白沉淀液

　　蛋白沉淀液由 Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇三种溶液以 25 ∶ 24 ∶ 1 的体积比进行配制，置于4 ℃保存。

　　C.2 DNA提取步骤

　　挑取菌丝约 0 . 1 g,用灭菌滤纸吸干水分，放入 1 . 5 mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎待用。或将病组织 0 . 1 g~0 . 2 g,在灭菌研钵中，加入液氮研磨后，放入 1 . 5 mL离心管中，待用。

　　离心管中加入 300 μL~500 μL CTAB DNA 提取缓冲液和 0.1 g 蛋白酶 K,混匀，65 ℃水浴 1 h, 12 000 r/min 离心 5 min,保留上清液。

　　取上清液于 1 . 5 mL离心管中，加 500 μL 的 Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1)混匀，12 000 r/min离心 5 min。

　　再取上清液于 1. 5 mL离心管中，加 500 μL 的 Tris 饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(体积比为 25 ∶ 24 ∶ 1)轻摇混匀，12 000 r/min离心 5 min。

　　取上清液，加入 1 mL异丙醇混匀，-70 ℃下放置 1 h,或 - 20 ℃过夜;12 000 r/min 离心 30 min,

　　可见 DNA沉淀。

　　弃去上清液，70%乙醇洗 DNA 沉淀 2 次，室温干燥后，用 30 μL~50 μL Tris-EDTA 缓冲液溶解

　　DNA,待用。

　　用微量分光光度计测量 DNA浓度，A260/A280 比值应接近 1 . 8 。

　　注：或者按照等效 DNA提取试剂盒进行操作。

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　　附 录 D

　　(规范性)

　　常规 PCR检测方法

　　D.1 引物序列

　　引物系列见表 D. 1 。

　　表 D.1 PCR引物序列

　　D.2 PCR扩增

　　0.2 mL PCR管中，包含 2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL, 引物各 1.0 μL(10 μmol/L), DNA模板

　　2 μL (20 ng/μL) , ddH2 O 8.5 μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。

　　反应条件为 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 35 个循环;72 ℃ 5 min, 4 ℃保存。

　　D.3 琼脂糖凝胶电泳检测

　　在 1 × TAE 电泳缓冲液中，2%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm,0 . 5%核酸染料染色 20 min,凝胶成像仪分析结果。

　　D.4 结果判定

　　如果阳性对照及检测样品出现约 184 bp 的条带，阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阳性。

　　如果阳性对照出现约 184 bp 的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阴性。

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　　附 录 E

　　(规范性)

　　实时荧光 PCR检测方法

　　E.1 引物和探针序列

　　引物和探针序列见表 E. 1 。

　　表 E.1 实时荧光 PCR引物序列和探针

　　E.2 实时荧光 PCR反应体系

　　反应体 系 为：0. 2 mL 离 心 管 中 加 入 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL, OPAF (10 μmol/L)、OPAR(10 μmol/L)各 0.5 μL,探针 OPAP(10 μmol/L)0.5 μL, DNA模板 2 μL, 补水至

　　20 μL。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。 将反应体系混合均匀后置于荧光 PCR仪中进行反应。

　　反应程序：95 ℃ 10 min; 94 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 共 40 个循环。

　　注：PCR反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用等效试剂盒。

　　E.3 结果判定

　　在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct 值 ≤ 30 并出现典型扩增曲线的条件下：

　　待测样品的 Ct值≤35 时，判定葡萄轴枯病菌阳性;

　　待测样品的 Ct值 ≥40 时，判定葡萄轴枯病菌阴性;

　　待测样品的 35

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　　参 考 文 献

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