GB/T 41522-2022 三种犬病病毒基因芯片检测方法

　　ICS 1 1 . 220 CCS C 30

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 41522—2022

　　三种犬病病毒基因芯片检测方法

　　MethodofDNA microarrayfordetectionofthreecanineviruses

　　2022-07-1 1 发布 2022-07-1 1 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 41522—2022

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC 421)归口 。

　　本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、博奥生物集团有限公司、北京农学院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。

　　本文件主要起草人：汪琳、高志强、尹羿、赵相鹏、任彤、蒲静、方雪恩、张伟、赖平安、蒋迪、刘凤华、薛俊欣、李健、卢先东、刘艳红。

　　Ⅰ

　　GB/T 41522—2022

　　三种犬病病毒基因芯片检测方法

　　1 范围

　　本文件描述了同时检测三种犬病病毒(CDV、CPV 和 CAV-1)的微阵列基因芯片检测方法和微流控芯片检测方法。

　　本文件适用于待测对象鼻拭子、粪拭子、血浆、血清及脏器肌肉组织等样品中三种病毒核酸的同时快速检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫

　　GB/T 40458—2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BSA：牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)

　　CAV-1：犬 1 型腺病毒(Canine adenovirus-1)

　　cDNA：互补 DNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid)

　　CDV：犬瘟热病毒(Canine Distempervirus)

　　CPV：犬细小病毒(Canine Parvovirus)

　　DEPC：焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate)

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　dNTPs：核苷三磷酸(Nucleoside Triphosphate)

　　DMSO：二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide)

　　DTT：二硫苏糖醇(Dithiothreitol)

　　EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)

　　PBS：磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　RNA：核糖核酸(Ribonucleic Acid)

　　1

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　　RNase：核糖核酸酶(Ribonuclease)

　　Rnasin：核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor )

　　RT-PCR：反转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

　　SDS：十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)

　　SSC：柠檬酸钠缓冲液(Citric acd Sodium Citrate Buffer)

　　Taq 酶：Taq 聚合酶(Thermus Aquaticus)

　　Tris-HCL：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(TRIS Hydrochloride)

　　5 原理

　　在序列比对基础上，分别针对 CDV、CPV 和 CAV-1 保守区设计合成引物和探针。

　　对于三种犬病病毒的微阵列基因芯片检测方法，用点样仪将长度为 20 nt左右的寡核苷酸探针，点

　　制在醛基化玻璃基片上。 对待检样品进行检测时，先用引物将样品中存在的病毒核酸保守区扩增出来，

　　再通过标记 PCR将荧光染料 Cy-3 或 Cy-5 标记在扩增产物上，当扩增产物与芯片杂交后，杂交位点就

　　会发出荧光信号，通过芯片扫描仪捕获荧光信号，从而确定样品中是否含有这三种犬病病毒核酸。

　　对于三种犬病病毒的微流控芯片检测方法，将引物分别固定在微流控芯片相应位置后，对微流控芯片进行封装，将提取的核酸模板与反应液(包含荧光物质)混合反应后，加入封装好的微流控芯片中，之后放入带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。 若样本中含有 目 的片段，则能够得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有相应的病毒核酸。

　　6 仪器与材料

　　6 . 1 仪器

　　6 . 1 . 1 芯片点样仪。

　　6 . 1 . 2 芯片扫描仪。

　　6 . 1 . 3 微流控芯片检测仪。

　　6 . 1 . 4 PCR仪 。

　　6 . 1 . 5 纯水仪 。

　　6 . 1 . 6 芯片杂交盒。

　　6. 1 .7 高速微型离心机(离心速度 12 000 r/min 以上)。

　　6. 1 .8 台式高速离心机(离心速度 3 000 r/min 以上)。

　　6 . 1 . 9 旋涡振荡仪。

　　6 . 1 . 10 恒温干燥箱。

　　6 . 1 . 1 1 旋涡振荡仪 。

　　6 . 1 . 12 微量点样仪。

　　6 . 1 . 13 低温冰箱 。

　　6. 1 . 14 微量进样器(0.5 μL、2 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL)。

　　6 . 2 试剂和耗材

　　6 . 2 . 1 总则：除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，水为按照 GB/T 6682 规定的三级水，所有试剂均用无 RNase 污染的容器分装。

　　2

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　　6 . 2 . 2 阴性对照、阳性对照和微流控芯片内参对照的成分如下。

　　— 阴性对照：无 RNase水。

　　— 阳性对照：从阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的 DNA 片段。

　　— 内参对照：包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒，其中引物固定于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液中。

　　6.2.3 PBS(应符合附录 A 的规定)：121 ℃ , 15 min 高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各 10 000 U/ mL。

　　6 . 2 . 4 核酸裂解液：100 mmol/ L Tris-HCL, 50 mmol/ L EDTA, 0 . 5% SDS, 5 mol/ L 盐酸胍，5 mol/ L尿素，1% 吐温-20 。

　　6.2.5 核酸提取试剂：包含蛋白酶(20 mg/mL)、磁珠(50 mg/mL)、裂解液、异丙醇、洗液一、洗液二、洗液三和洗脱液等。 也可以使用其他等效核酸提取试剂或者将 DNA 或 RNA分别提取的试剂。

　　6.2.6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC水(符合 GB/T 6682 要求)配制，-20 ℃预冷。

　　6 . 2 . 7 微阵列芯片检测缓冲液配制、引物、探针序列、反应液体系、杂交液体系组成、芯片制作及使用注意事项应符合附录 A 和附录 B 中表 B.1~表 B.3 的规定。

　　6.2.8 微流控芯片反应液：20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8) , 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2 SO4 , 8 mmol/L MgSO4 , 0.1% 吐温-20 , 1.4 mmol/L dNTPs; Bst 酶，800 U/mL; 50 μmol/L SYBR Green荧光染料;内参质粒(400 copies/μL);反转录酶，40 U/μL;Rnasin,0.8 U/μL。

　　6.2.9 微流控芯片：5 μL/反应池，8 样本的离心微流控芯片。CPV、CDV 和 CAV-1 引物应符合附录 C中表 C.2~表 C.4 的规定。微流控芯片试剂组分和存放条件应符合表 C.1 的规定。微流控芯片制作与质量控制相关示例见附录 D。

　　6.2. 10 耗材：微阵列芯片、微流控芯片、封口膜、磁珠、无 RNase 吸头(10 μL、100 μL、1 000 μL)、无RNase 离心管(1.5 mL、2 mL)等。

　　7 试验方法

　　7 . 1 样品

　　7 . 1 . 1 通用要求

　　所有测试样品的采集、保存和运输应按照 GB/T 27401 的规定执行。

　　7 . 1 . 2 采样工具

　　下列采样工具应经 121 ℃、15 min 高压灭菌并烘干：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL 离心管、研

　　钵等。

　　7 . 1 . 3 样品的采集

　　7 . 1 . 3 . 1 活动物

　　取鼻拭子和粪拭子，采集方法如下：

　　— 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮 2 次~3 次并旋转，粘取鼻腔分泌液;

　　— 取粪拭子时将拭子深入肛门旋转一圈并沾取少量粪便。

　　将采样后的拭子分别放入盛有 1 .0 mL PBS 的 1 .5 mL 离心管中，加盖、编号。

　　7 . 1 . 3 . 2 脏器和肌肉组织

　　用无菌剪刀、镊子采集病死动物实质脏器和肌肉组织，装入一次性无菌样品袋或其他灭菌容器，

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　　编号。

　　7 . 1 . 3 . 3 血清、血浆

　　用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。

　　7 . 1 . 4 样品运输

　　样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，采集的样品置保温箱中，加

　　入预冷的冰袋，密封，24 h 内送实验室。

　　7 . 1 . 5 样品保存

　　采集或处理好的样品在 2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存，应放置于- 70 ℃冰

　　箱，避免反复冻融(冻融不超过 3 次)。

　　7 . 1 . 6 样品处理

　　7 . 1 . 6 . 1 拭子

　　样品在混合器上充分混合后，用灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3 000 r/min 离心 5 min,吸取上清液 1 mL转入无菌的 1.5 mL离心管中备用。

　　7 . 1 . 6 . 2 脏器或肌肉组织

　　取待检样品 2.0 g 于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 10 mL PBS 混匀，取上清液 1 mL 转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。

　　7 . 1 . 7 样品存放

　　制备的样品在 2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过 24 h,若需长期保存应置- 70 ℃以下，避免反复冻

　　融(冻融不超过 3 次)。

　　7 . 2 核酸提取

　　7 . 2 . 1 通用要求

　　CDV 属于 RNA 病毒，CPV 和 CAV-1 属于 DNA 病毒，本文件以常规核酸提取试剂(可同时提取DNA 和 RNA)为例说明核酸提取步骤，也可按照 GB/T 40458—2021 的方法提取，还可采用其他等效商品化试剂盒提取。 实验前，将各试剂于室温下溶解，充分混匀并短暂离心后使用。

　　7 . 2 . 2 核酸提取纯化准备

　　7.2.2. 1 裂解液如有沉淀，请于 56 ℃温浴至沉淀完全溶解后使用。

　　7.2.2.2 使用前，加 24 mL无水乙醇至洗液三中，混匀，并做好标记(拧紧瓶盖，防止乙醇挥发)。

　　7.2.2.3 将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管 20 μL分装至各离心管中。

　　7 . 2 . 3 核酸提取纯化

　　7.2.3. 1 向上述已加蛋白酶的离心管中加入 200 μL 制备好的样本，混匀;再加入 400 μL 裂解液，旋涡振荡 10 s, 56 ℃孵育 10 min; 2 ℃ ~8 ℃ 8 000 r/min 离心 1 min,取上清待用。

　　7.2.3.2 加入 300 μL 异丙醇和 2 μL磁珠，上下颠倒离心管 10 次，使管内磁珠分布均匀。

　　7.2.3.3 静置离心管 10 min,期间每隔 2 min上下颠倒离心管 5 次，使管内磁珠分布均匀。

　　4

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　　7.2.3.4 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8 000 r/min 离心 1 min,用移液器吸去管内液体。

　　7.2.3.5 加入 500 μL洗液一，用移液器吸头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡 10 s,直至其分布均匀。

　　7.2.3.6 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8 000 r/min 离心 1 min,用移液器吸去管内液体。

　　7.2.3.7 加入 500 μL洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡 10 s,直至其分布均匀。

　　7.2.3.8 将离心管置于离心机上，2 ℃ ~8 ℃ 8 000 r/min 离心 1 min,用移液器吸去管内液体。

　　7.2.3.9 加入 500 μL洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，旋涡振荡 10 s,直至其分布均匀。

　　系组成应符合 B.3 的规定，充分混匀后，盖紧管盖，500 r/min 离心 30 s,将离心后的 PCR 管放入

　　PCR仪反应。

　　循环条件设置：

　　— 第一阶段，预变性 94 ℃ 5 min;

　　— 第二阶段，94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s ; 40 个循环 ;

　　— 第三阶段，72 ℃ 5 min。

　　7 . 2 . 3 . 10 以得到的 PCR产物与基因芯片进行杂交，杂交反应体系组成应符合 B. 3 的规定。 芯片杂交盒中加入 200 μL 去离子水，将芯片正面朝上放进杂交盒中，对准方向放入盖片，通过加样孔将变性后的杂交液取 15 μL一次性注入，使其充满盖片和芯片之间空隙，封闭杂交盒，42 ℃恒温水浴杂交 2 h。

　　7 . 2 . 4 洗片

　　杂交完毕后，弃去盖片，芯片探针面向下在少量预热的 2×SSC(含 0.2% SDS) 中漂去残余杂交液(注意避免四个矩阵的杂交液交叉污染)，撕去芯片上的橡胶围栏，在预热至 42 ℃的杂交洗液 I 搅拌清洗 4 min,继续在预热至 42 ℃的 0.2 × SSC 中搅拌清洗 4 min, 2 000 r/min 离心 1 min,置于暗盒室温

　　保存。

　　7 . 2 . 5 扫描

　　将芯片置于芯片扫描仪中进行扫描分析，Cy-3 标记用 532 nm 激光管扫描，Cy-5 标记用 635 nm 激

　　光管扫描，光电耦合装置信号设为 900 。获得各点荧光强度、背景强度等数据。

　　7 . 2 . 6 微阵列芯片结果判定

　　7 . 2 . 6 . 1 检测结果判读原则

　　依据以下原则判读检测结果：

　　— 每个检测点信号值=该点荧光强度值-该点背景强度值;

　　— 阴性对照平均信号值=3 个阴性对照点信号值的平均值-该点背景强度值;

　　— 检测点阳性判读标准：检测点信号值-该点背景强度值>2 倍阴性对照平均信号值。

　　7 . 2 . 6 . 2 质控标准

　　7 . 2 . 6 . 2 . 1 阴性对照信号值接近背景强度值。

　　7 . 2 . 6 . 2 . 2 探针结合对照、杂交对照、标记对照、阳性对照信号值均为阳性。

　　7 . 2 . 6 . 2 . 3 若探针结合对照点中任何一个为阴性，则表明探针与片基结合存在问题;若杂交对照为阴性，则表明杂交环节存在问题;若标记对照为阴性，则表明标记扩增环节存在问题;若阳性对照为阴性，则表明总 RNA 提取环节存在问题。 出现上述情况任何一种，此次实验视为无效。

　　7 . 2 . 6 . 3 结果描述及判定

　　7 . 2 . 6 . 3 . 1 阴性

　　病毒的每条探针检测点都是阴性即待测样品不携有该种病毒，判为阴性。

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　　7 . 2 . 6 . 3 . 2 阳性

　　每种病毒的一条以上探针检测点为阳性即待测样品携有相对应病毒，判为阳性。

　　7 . 3 微流控芯片

　　7 . 3 . 1 微流控芯片的制作

　　微流控芯片的制作方法见附录 D。

　　7 . 3 . 2 检测加样体系

　　三种犬病毒联检反应体系为：10 μL反应液、15 μL模板，总体积为 25 μL。

　　7 . 3 . 3 试剂准备区

　　样本芯片加样试剂准备：从-20 ℃取出试剂盒，将各试剂于室温下解冻，充分混匀并短暂离心后使用。取 N 个(N=待检测样本数)1.5 mL离心管，每管加入反应液 10 μL。

　　7 . 3 . 4 样本准备区

　　加样：在准备好试剂的各个离心管中分别加入 15 μL 不同的待测核酸样本，旋涡振荡混匀，瞬时离心，把各管中混好的样本(25 μL)分别加入到微流控芯片中的加样孔中，最后用样本封口膜封住加样孔

　　(见附录 D)及透气孔，使用刮片赶走气泡，确保封口膜完全贴合。

　　7 . 3 . 5 恒温扩增区

　　上机：将上述封装好的芯片的凹处对准微流控芯片检测仪卡扣的凸处，水平彻底按下去即可。

　　程序设置：1 600 r/min 低速离心 10 s, 4 600 r/min 高速离心 30 s。温度为 63. 5 ℃ ,反应时间为

　　30 min 。

　　运行：仪器运行后，待温度上升到设定温度，微流控芯片仪开始离心，离心结束后，仪器便开始连续采集荧光信号。

　　7 . 3 . 6 阴性对照、阳性对照、内参引物和内参质粒的设置

　　阴性对照：不含外源目标核酸序列的 DNA 片段，单独作为一个样本，加入到加样孔中。

　　阳性对照：从可溯源的标准物质提取核酸，或从含有已知序列阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的 DNA 片段。

　　内参引物：存在于微流控芯片反应孔中，含扩增内参基因片段的引物(非 CPV、CPV 和 CAV-1 的引物)，用来质控是否可以正常进行恒温扩增反应。

　　内参质粒：人工合成的内参基因序列(非 CPV、CPV 和 CAV-1 的基因片段)。

　　7 . 3 . 7 微流控芯片结果判断

　　7 . 3 . 7 . 1 微流控芯片检测仪阈值线设置

　　阈值线一般情况设置为 800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型 S 型扩

　　增曲线的最高点，且 Ct值显示为 0) ,判定为阳性的 Ct值设置为 30,仪器配套软件自动分析结果。

　　7 . 3 . 7 . 2 质量控制

　　阳性对照出现明显的 S 型扩增曲线，阴性对照无明显的 S 型扩增曲线，内参引物检测孔在 Ct 值 ≤

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　　30 时，出现扩增曲线，实验结果有效;否则实验无效。

　　7 . 3 . 7 . 3 结果判定

　　阳性：检测孔在 Ct值≤30 时，有明显扩增曲线，判定对应检测指标为阳性。

　　阴性：30 min 内，检测孔无扩增曲线，判定对应检测指标为阴性。

　　注：如果样品做重复实验，扩增多次，只要有一次实验结果判定是阳性，那么该样本判定为阳性样本。

　　8 生物安全措施

　　8 . 1 实验室设备、设施要求及废弃物处理应符合 GB 19489 的规定。

　　8 . 2 微流控芯片的检测工作应由具备生物实验操作经验人员承担。

　　8 . 3 检验过程中防止交叉污染的措施应按照 GB/T 27401 的规定执行。

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　　附 录 A (规范性)缓冲液配方

　　以下所用试剂均为分析纯。

　　A.1 磷酸盐缓冲液

　　A.1 . 1 A 液

　　0.2 mol/L NaH2 PO4 水溶液：NaH2 PO4 · H2 O 27.6 g,溶于蒸馏水中，最后稀释至 1 000 mL。

　　A.1 . 2 B 液

　　0. 2 mol/L Na2 HPO4 水 溶 液：Na2 HPO4 · 7H2 O 53. 6 g,(或 Na2 HPO4 · 12H2 O 71. 6 g 或Na2 HPO4 ·2H2 O 35.6 g)加蒸馏水溶解，最后稀释至 1 000 mL。

　　A.1 .3 0.0 1 mol/L PH 7.2 磷酸盐缓冲生理盐水

　　A 液 14 mL、B 液 36 mL、NaCl 8.5 g,加蒸馏水至 1 000 mL。

　　A.2 20 ×sCC

　　NaCl 175.3 g、Na3 C6 H5 O7 ·2H2 O 88.2 g,加超纯水至 1 000 mL。充分溶解，室温保存。

　　A.3 2 ×sCC

　　20 × SCC 50 mL,加超纯水至 1 000 mL。 充分溶解，室温保存。

　　A.4 0 . 2 ×sCC

　　2 × SCC 50 mL,加超纯水至 1 000 mL。 充分溶解，室温保存。

　　A.5 DTTMgCl2(0. 1 mol/L)

　　DTT 15.4 g、MgCl2 9.5 g,加超纯水至 1 000 mL。充分溶解，室温保存。

　　A.6 10%sDs

　　SDS 100 g、超纯水 900 mL,加热至 68 ℃ 以溶解 SDS 结晶，再加超纯水定容至 1 000 mL,室温

　　保存。

　　A.7 50 × Denhardt’s

　　聚蔗糖 5 g、聚乙烯吡咯烷酮 5 g、BSA 5 g,加超纯水至 500 mL。充分溶解，-20 ℃保存。

　　A.8 裂解液

　　1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10 mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 10 mL、SDS0.50 g、盐酸胍 47.77 g、尿素 30.03 g、吐温-201 mL,加超纯水至 100 mL。充分溶解，室温保存。

　　A.9 洗液 一

　　盐酸胍 40.12 g、异丙醇 40 mL,加超纯水至 100 mL。充分溶解，室温保存。

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　　A.10 洗液二

　　NaCl 0.58 g、异丙醇 25 mL、无水乙醇 25 mL,加超纯水至 100 mL。充分溶解，室温保存。

　　A.1 1 洗液三

　　无水乙醇 80 mL,加超纯水至 100 mL。充分混匀，室温保存。

　　A.12 洗脱液

　　1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 1 mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)0.2 mL,加超纯水至 100 mL。充分混匀，1.034 × 105 Pa高压蒸汽灭菌 10 min,室温保存。

　　A.13 DEPC水

　　超纯水 100 mL加 DEPC 50 μL,室温过夜，121 ℃ , 15 min灭菌，或直接购买无 RNase超纯水。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　基因芯片引物、探针序列、探针排布及 RT-PCR反应体系组成

　　B.1 基因芯片引物、探针、质控序列及排布

　　微阵列芯片检测引物序列见表 B.1 所示，每对引物的上游引物的 5 ′ 端标记荧光，用于杂交检测。

　　表 B.1 引物序列

　　引物名称

　　序列(5′-3′)

　　引物名称

　　序列(5′-3′)

　　CDV1-F

　　GGCAGATGAGTTCTTCAAAA

　　CDV1-R

　　CAATTCTAGGCTTGTTCCC

　　CDV2-F

　　GGTGTCAAGGAACAACTGG

　　CDV2-R

　　CTATCCCTCCTAGAGCAAAC

　　CAV-1-1-F

　　CGTCCTCACCTAAGCCTAA

　　CAV-1-1-R

　　AAGGTAGTAATGTTCAGCGG

　　CAV-1-2-F

　　ATGCCGCTGAACATTACTAC

　　CAV-1-2-R

　　GAAAGGTTAGCAGGCTTACA

　　CPV1-F

　　ACTCCAGCAGCTATGAGATC

　　CPV1-R

　　AGCAAATTCATCACCTGTTC

　　CPV2-F

　　CAGGTGATGAATTTGCTACA

　　CPV2-R

　　CCATTTGAGTTACACCACG

　　微阵列芯片检测探针序列、质控对照探针序列和探针排布见表 B. 2 所示。

　　表 B.2 探针序列、质控对照探针序列和探针排布

　　探针名称

　　缩写

　　检测病毒

　　序列(5′-3′)

　　CDV1

　　CDV1

　　CDV

　　CTTTCGACCCTTCGTCTACA

　　CDV2

　　CDV2

　　CDV

　　CCTATCCCTCCTAGAGCAAA

　　CAV-1-1

　　CAV1

　　CAV-1

　　GTGCCATTGGAGAGACAGAG

　　CAV-1-2

　　CAV2

　　CAV-1

　　GAATCATACGGCATCTGGTG

　　CPV1

　　CPV1

　　CPV

　　AACCCAATGTCTCAGATCTCA

　　CPV2

　　CPV2

　　CPV

　　TGGTAAGCCCAATGCTCTAT

　　表面化学对照-Cy-3

　　SC

　　质控对照

　　CACATCACTCAGTTATAGTC

　　阴性对照

　　NC

　　质控对照

　　GACCGCGCTTATACTATAGTC

　　杂交对照

　　HC

　　质控对照

　　CCCGCTCCGATGGGATAGTC

　　标记对照

　　DC

　　质控对照

　　CTCAAAAGCCCTTCCTGCCCA

　　阳性对照

　　PC

　　质控对照

　　GATGGTAGGATAGTGGCCTA

　　微阵列芯片质控对照模板序列见表 B. 3 所示。

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　　表 B.3 质控对照模板序列

　　对照名称

　　对照序列 5′-3′

　　杂 交 对 照-

　　Cy-3

　　GACTATCCCATCGGAGCGGG

　　标 记 对 照模板

　　CACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATATTCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGT TGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAGAGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGA CGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAATAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTG

　　将合成的探针用点样缓冲液(50%DMSO)溶解，浓度为 50 μmol/L,芯片每条探针横向重复 3 点，每点约 0.25 nL,点直径约 130 μm,点间距 300 μm,点样均匀度的标准方差约为 15%。

　　探针排布：一张芯片上 4 个相同矩阵，矩阵位置如图 B. 1 所示。

　　单位为毫米

　　标引序号说明：

　　1 — 围栏;

　　2 — 芯片。