GB/T 21769-2025 化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21769—2025代替 GB/T21769—2008

　　化学品 体外 3T3中性红摄取

　　光毒性试验方法

　　Chemicals—In vitro3T3NRU phototoxicitytestmethod

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21769—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T21769—2008《化学品 体外 3T3中性红摄取光毒性试验方法》,与GB/T 21769—2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术内容变化如下 :

　　a) 将 “试验基本原则 ”更 改 为 “试 验 原 理 ”, 更 改 了 实 验 时 关 于 光 照 处 理 时 间 的 要 求(见 第 5 章 , 2008年版的第 4章) ;

　　b) 更改了摩尔消光系数的值(见 6. 1. 1,2008年版的 5. 1. 1) ;

　　c) 将 “新陈代谢系统 ”更改为 “代谢活化系统 ”,更改了试验中对代谢系统的要求(见 6. 1. 3,2008年版的 5. 1. 3) ;

　　d) 增加了 “试验准备 ”中 ,试验细胞选择的要求(见 6. 2. 1) ,培养条件二氧化碳浓度调整的内容(见6. 2. 2) ,受试物系列稀释溶液配制内容(见 6. 2. 4) ,光源的全波段光谱波长范围和对 UVA-照度计定期校准的要求(见 6. 2. 5) ;

　　e) 删除了试验准备中细胞株来源的内容(见 2008年版的 5. 2. 1) ,受试化学物质制备有关选用弱性缓冲液时细胞二氧化碳培养条件的要求和阴性对照组的内容(见 2008年版的 5. 2. 4) , 阴性对照组光敏检查的内容(见 2008年版的 5. 4. 2) ;

　　f) 增加了受试物浓度有关最高浓度降低至 100 μg/mL 的内容(见 6. 3. 1. 2) ;

　　g) 将 “阴性对照组 ”更改为 “溶剂对照组 ”,更改了绝对光密度值的数值(见 6. 4. 3,见 2008年版的5. 4. 3) ;

　　h) 增加了 “避免中性红溶液结晶 ”的内容(见 6. 4. 4) ;

　　i) 更改了试验步骤中细胞培养时间 、孵育过夜时间 、测定波长的要求(见 6. 5,2008年版的 5. 5) ;

　　j) 增加了中性红溶液配制方式内容 、试验使用水的要求(见 6. 5. 3. 2) ;

　　k) 更改了光刺 激 因 子 (PIF) 计 算 公 式 (见 7. 2. 3, 2008年 版 的 6. 2. 3) 、MPE 临 界 值 的 要 求 (见7. 2. 4, 2008年版的 6. 2. 4) ;

　　l) 删除了计算 PIF和 MPE软件获取方式的内容(见 2008年版的 6. 2. 5) ;

　　m) 更改了试验结果预测模型的内容(见 7. 3. 1,2008年版的 6. 3. 1) 、参考化学物质中文名称的内容(见表 2,2008年版的表 1) 、阴性结果 PIF 的要求(见 7. 3. 4,2008年版的 6. 3. 3) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :广州海关技术中心 、宁波海关技术中心 、中检科健(天津)检验检测有限责任公司 。

　　本文件主要起草人 :温巧玲 、潘丙珍 、鲍佳生 、潘芳 、李志勇 、陈德明 、黄丽霞 、黄雄俊 、张梓龙 、席静 、刘汉伟 、易蓉 、陈文锐 、郑建国 、谢文平 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21769—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21769—2025

　　化学品 体外 3T3中性红摄取

　　光毒性试验方法

　　1 范围

　　本文件确立了化学品体外 3T3中性红摄取光毒性试验的原理 ,规定了试验结果和试验报告的内容要求 ,描述了试验方法 。

　　本文件适用于化学品进行光毒性的筛选和检测的试验 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　辐照度 irradiance

　　入射到某一表面的紫外线(UV)或可见光(Vis)的强度 。

　　注 : 单位为瓦每平方米(W/m2 )或毫瓦每平方厘米(mW/cm2 ) 。

　　3.2

　　光剂量 doseoflight

　　入射到某一表面的紫外线或可见光的量(强度与时间的乘积) 。

　　注 : 以单位表面积的焦耳数表示 , 即焦耳每平方米(J/m2 )或焦耳每平方厘米(J/cm2 ) 。

　　3.3

　　紫外线波长 ultravioletlightwavebands

　　在生物学实验中 ,紫外线波长为 100 nm~400 nm 的光波 。

　　注 : 国际照明委 员 会(Commission Internationale de L’Eclairage, CIE) 推 荐 的 名 称 为 : UVA(315 nm ~ 400 nm) 、 UVB(280 nm~ 315 nm) 和 UVC (100 nm ~ 280 nm) 。 UVB 和 UVA 的 分 界 线 通 常 在 320 nm , UVA 可 在340 nm 处分为 UV-A1和 UV-A2。

　　3.4

　　细胞活性 cellviability

　　测量某一细胞群总活性的参数(如细胞溶酶体摄取活性染料中性红) ,其数值取决于测定的终点和试验所用的设计方案 ,并与细胞总数和/或细胞活力相关 。

　　3.5

　　光刺激因子 photo irritation factor;PIF

　　受试物分别在无光照( -Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下

　　1

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　　获得两组平行有效的细胞毒性浓度(IC50)通过计算得到的比值 。

　　3.6

　　相对细胞活性 relativecellviability

　　与溶剂(阴性)对照组的相关性来表达的细胞活性 。

　　注 : 对照组除了未经受试物处理外 ,整个试验过程与试验组一样( +Irr或 -Irr) 。

　　3.7

　　半数抑制浓度 halfmaximalinhibitory concentration;IC50

　　使细胞活性下降 50%的受试物的浓度 。

　　3. 8

　　平均光效应 mean photo effect;MPE

　　受试物分别在无光照( -Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下获得两组浓度反应曲线通过数学分析导出的数值 。

　　3.9

　　光毒性 phototoxicity

　　皮肤首次接触或全身应用某些化学物质继而暴露于光下所引发的急性毒性反应 。

　　3. 10

　　混合物 mixture

　　两种或两种以上不发生反应的化学物质组成的物质 。

　　3. 11

　　摩尔消光系数 molarextinction coefficient;MEC

　　摩尔吸收系数 molarabsorption coefficient

　　在一组特定条件(如溶剂 、温度和波长)下 ,反映给定分子吸收光子效率的常数 。

　　注 : 单位为升每摩尔厘米 , 即 L/(mol· cm) 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　CPZ:氯丙嗪(Chlorpromazine)

　　DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)

　　EBSS:厄尔氏平衡盐溶液(Earle’s Balanced SaltSolution)

　　HBSS:汉克斯平衡盐溶液(Hanks’Balanced SaltSolution)

　　NR: 中性红(NeutralRed)

　　NRU : 中性红摄取(NeutralRed Uptake)

　　ROS:活性氧(Reactive Oxygen Species)

　　UV/Vis:紫外线/可见光(Ultraviolet/Visible Light)

　　5 试验原理

　　5. 1 体外 3T3中性红摄取(NRU)光毒性试验用于鉴别被光激活的受试物的潜在光毒性 。

　　5. 2 试验中的细胞毒性是以受试物和光照射处理 18h~ 24h后 ,与受试物浓度相关的活性染料中性红(NR,CAS号 :553-24-2)摄取量来表示的 。NR是一种弱的阳离子染料 ,极易以非离子扩散的方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集 。NR在 pH 接近中性的细胞质中不带电 ,但当其处于低 pH 的溶酶体腔内 时 会 变 成 正 电 荷 。 维 持 细 胞 溶 酶 体 腔 的 低 pH 值 , 需 要 腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸 ( Adenosine

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　　Triphosphate,ATP) ,并且有赖于溶酶体膜的完整性 。 光毒性物质可以通过形成活性氧(ROS) 和其他机制 ,导致溶酶体膜的通透性增加、pH 梯度降低 , 以及其他不可逆的变化 ,从而诱导细胞损伤 ,导致细胞吸收和键合 NR 的能力下降从而区分活的 、损伤的或死亡的细胞 。

　　5.3 试验通过测定有光照( +Irr) 和无光照( -Irr) 条件下 ,永生化小鼠成纤维细胞系 BALB/c 3T3经受试物作用后摄取活性染料 NR能力的变化 ,计算受试物的光刺激因子(PIF)或平均光效应(MPE) , 以此来判断受试物是否具有光毒性 。

　　6 试验方法

　　6. 1 试验前须知

　　6. 1. 1 光化学特性

　　许多种类的化学物质能诱导产生光毒性效应 ,它们的共同特点是在太阳光的波长范围内能够吸收光能量 。 只有吸收足够的光量子才能发生光化学反应 。 因此 ,进行该试验前 ,宜按 OECD试验指南 101 (OECD TG 101)的方法先测定受试物的 UV/Vis吸收光谱 。在适当的溶剂(如甲醇)中 ,如果化学物质的摩尔消光系数(MEC)小于 1 000 L/(mol· cm) ,则该化学物质不具有光反应性 ,无须进行体外 3T3中性红摄取光毒性试验 ,或其他测定不良光化学效应的生物学试验 。通常情况下 ,该原则适用于所有受试物 ,但有些化学物质 根 据 其 预 期 用 途 或 可 能 的 暴 露 条 件 , 宜 使 用 特 定 的 指 南(如 药 品 按 ICHS10测试) 。3T3NRU光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用 ,见附录 A。

　　6. 1.2 预测范围

　　对体外 3T3中性红摄取光毒性试验的可靠性和相关性的评价结果表明 ,体外 3T3中性红摄取光毒性试验能预测动物和人类的体内急性光毒性效应 。本试验不适用于预测受试物与光联合作用可能产生的其他不良效应 ,如光遗传毒性 、光过敏性或光致癌性 。此外 ,本试验也不能阐明光毒性的间接机制 、受试物的代谢作用或混合物的效应 。体外 3T3 中性红摄取光毒性试验阴性结果表明该受试物可能无须进行其他试验(如光遗传毒性试验) 。

　　6. 1.3 代谢活化系统

　　体外 3T3中性红摄取光毒性试验无须通过代谢活化系统进行 。

　　6.2 试验准备

　　6.2. 1 细胞

　　6.2. 1. 1 选用永生化小鼠成纤维细胞系 BALB/c 3T3。根据 OECD第 34号指导文件(OECD GD 34)的原则 ,如果培养条件能满足细胞的特殊需要 ,其他细胞或细胞系也可用于本试验 ,但应证明其等同性(即对参考化学物质有适当反应) 。

　　6.2. 1.2 细胞到达实验室后应检查支原体污染 ,应使用无支原体污染的细胞 。

　　6.2. 1.3 按 6. 4规定的质量控制步骤定期检查 BALB/c 3T3细胞的紫外线敏感性非常重要 。 由于细胞对 UVA 的敏感性随 传 代 数 的 增 多 可 能 增 高 , 因 此 , 应 使 用 可 获 得 的 最 低 传 代 数 的 BALB/c 3T3 细胞 ,总传代次数应少于 100次 ,光模拟器的谱能和细胞的敏感性的内容见附录 B。如果使用更高传代次数的细胞 ,则应提供数据来证明细胞符合本试验中的质量参数 。

　　6.2.2 培养基和培养条件

　　常规细胞传代和试验过程应使用合适的培养基和培养条件 。 即对于 BALB/c3T3细胞 ,用 DMEM

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　　(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养基补充 10%新生小牛血清 、4 mmol/L谷氨酰胺 、青霉素(100IU) 和链霉素(100μg/mL) ,温度条件为 37℃ ,二氧化碳浓度(CO2 )为 5% ~ 7. 5%(视缓冲液不同而定 ,见 6. 2. 4. 2)的条件下培养 。根据使用的缓冲液 ,可以调整 CO2 浓度水平 。另外 , 细胞培养条件应确保细胞或细胞系的细胞分裂周期时间在正常历史数据范围内 。

　　6.2.3 培养物制备

　　6.2.3. 1 将冷冻保存的细胞取出并复苏 ,用于光毒性试验前至少传代 1 次 。

　　6.2.3.2 用于试验的细胞应接种到培养基中 ,并确保在试验结束时 ,也即在接种 48 h 后测定细胞活性时 ,培养物仍未达到完全汇合 。对生长在 96孔培养板中的 BALB/c 3T3细胞 ,细胞接种密度宜为每孔1×104 个细胞 。

　　6.2.3.3 对每种受试物 ,细胞以相同的方式接种在两块独立的 96孔培养板上 ,整个试验过程中按相同的培养条件培养 , 区别在于一块培养板进行照射处理(+Irr) ,而另一块培养板置于暗处( -Irr) 。

　　6.2.4 受试物制备

　　6.2.4. 1 除有稳定性数据证明储存液可以正常使用外 ,试验中的受试物应在使用当天现配现用 。试验进行照射前 ,化学物质的操作和细胞的初始处理都应避免将受试物暴露于具有光活化或光降解的光线条件下 。

　　6.2.4.2 受试物应溶解在平衡盐溶液中 ,如 Earle’s平衡盐溶液(EBSS) 、Hanks’平衡盐溶液(HBSS)或其他生理平衡盐溶液 , 平 衡 盐 溶 液 不 应 含 有 蛋 白 质 成 分 和 光 吸 收 成 分(如 酚 红 等 pH 指 示 剂 和 维 生素) , 以避免照射时产生干扰 。 因为照射期间 ,细胞要在 CO2 培养箱外放置约 50 min,应避免培养基碱化 。如果细胞只在 5%的 CO2 条件下培养 ,应选用更强缓冲作用的平衡盐溶液 。

　　6.2.4.3 在水中溶解度有限的受试物应先将其溶解在适当的溶剂中 。如使用溶剂 ,溶剂的体积应当在试验各培养物中保持一致 , 即在溶剂对照组和所有受试物浓度组中保持一致 ,并且溶剂在该浓度下无细胞毒性 。

　　6.2.4.4 受试物不溶于水时 ,宜使用二甲基亚砜(DMSO)或乙醇作为溶剂 。如果受试物难溶于水 、DM- SO 或乙醇 ,也可使用其他低细胞毒性的溶剂 。使用前 ,应评估溶剂的特定性质 ,例如 ,是否与受试物反应 ,是否会引发光毒性 、使光毒性效应猝灭 、影响自由基清除性质和/或化学稳定性 。对于溶解在有机溶剂 DMSO 或乙醇中的受试物 ,用同一溶剂制备 8个浓度的系列稀释液 ,并将在有机溶剂中制备的 8 个浓度的储备溶液转移到水性溶液(如 EBSS或 HBSS) 中 ,然后再应用于细胞 。 每种受试物的储备溶液应以其在 DMSO 或乙醇中的最高溶解浓度制备 , 以使其在水性溶液中达到 1 000 μg/mL 的最高浓度 。在 8个测试浓度的水性溶液中 ,溶剂的终浓度应保持一致 ,通常为 1%(体积分数) 。在有机溶剂中制备的受试物转移到水性溶液时可能会产生沉淀 。 因此 ,应评估水性溶液剂量稀释液的溶解度并记录观察结果 。

　　6.2.4.5 不影响受试物稳定性的情况下 ,可以使用涡旋混合 、超声处理和/或加热到适当温度等方法辅助溶解 。

　　6.2.5 照射条件

　　6.2.5. 1 光源

　　6.2.5. 1. 1 选择合适的光源(如太阳光模拟器)和滤光片是光毒性试验的关键因素 。体内光毒性反应通常与 UVA 和可见光区域的光相关 ;与 UVB相关性较小 ,但 UVB具有较高的细胞毒性 。 随着 UVB波长从 313 nm 变化 至 280 nm , 细 胞 毒 性 增 加 1 000 倍 。 合 适 的 光 源 应 发 出 全 波 段 光 谱 (290 nm ~ 700 nm) 。可使用滤光片来调整光谱 ,允许 UVA 和可见光透过(见图 B. 1) 同时减弱 UVB 的强度 。此

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　　外 ,所用波长 、剂量和使用的光源设备(如开放或封闭系统)不应对测试系统产生不良影响(如红外区域散发的热量 、发射的波长等) 。

　　6.2.5. 1.2 使用太阳光模拟器模拟太阳光是一种理想的人造光源 。经过滤的太阳光模拟器发出的光能分布应接近于室外自然光 。氙弧灯和(掺杂)汞金属的卤化物弧灯常被用作太阳光模拟器 。 由于所有太阳光模拟器都会发射出相当数量的 UVB, 因此 ,它们应经过适当的过滤以减弱 UVB的高细胞毒性 。

　　6.2.5. 1.3 试验中的细胞培养塑料材料含有 UV稳定剂 , 因此应检测透过同类型 96孔板盖的光谱 。通过滤光片或设备无法避免的滤波效应来减弱光谱 ,滤光片下测得的光谱不应偏离标准的室外自然光范围 。采用国际公认的室外自然光源标准—D65标准光源 ,见 ISO 18909:2006。经滤过的太阳光模拟器光谱分布资料见附录 B 的图 B. 1。

　　6.2.5.2 剂量

　　6.2.5.2. 1 每次进行光毒性试验前 ,应使用合适的宽波段 UVA-照度计对光强度(辐照度) 做常规检测 。透过试验所用的 96孔 板 盖 的 光 辐 照 度 也 应 检 测 。 UVA-照 度 计 需 经 光 源 校 准 。 在 更 长 的 时 间 间 隔内 ,应使用外部校准的参考紫外线-可见光照度计在现场测量过滤光源的光辐照度 ,并在需要时调整宽波段 UVA-照度计的校准 。或在配备了相同的光源/滤光片设备的校准实验室对 UVA-照度计进行定期校准 。

　　6.2.5.2.2 剂量为 5 J/cm2 的光线(UVA范围内测定)证实对 BALB/c 3T3细胞无毒性作用 ,但可以激发化学 物 质 产 生 光 毒 性 反 应 。 为 在 50 min 内 达 到 5 J/cm2 剂 量 , 辐 照 度 调 整 为 1. 7 mW/cm2 , 见图 B. 2。通过调整光照射时间和/或辐照度值以达到 5 J/cm2 剂量 。光照射暴露时间按公式(1)计算 :

　　t …………………………( 1 )

　　式中 :

　　t — 照射时间 ,单位为分(min) ;

　　H — 照射剂量 ,单位为焦耳每平方厘米(J/cm2 ) ;

　　E — 辐照度(光强度) ,单位为毫瓦每平方厘米(mW/cm2 ) 。

　　注 : 1 焦耳(J)= 1 瓦特(W) ×秒(s) 。

　　6.2.5.2.3 如果使用其他细胞系或不同的光源 ,照射剂量应校准 , 以便选择对细胞无害并足以对标准光毒性物质(见表 2列明的参考化学物质)产生激发作用的剂量 。

　　6.3 试验条件

　　6.3. 1 受试物浓度

　　6.3. 1. 1 应当通过预试验确定有光照(+Irr)和无光照( -Irr)条件下受试物的浓度范围 ,预试验对于评估受试物在试验开始时和 60 min内(或其他任何处理时间)的溶解度适用 , 因为溶解度可能在试验或暴露期间发生变化 。含受试物的细胞培养基的 pH 范围应为 6. 5~ 7. 8。

　　6.3. 1.2 受试物最高浓度应在生理试验条件下确定 ,例如应避免出现渗透性和极端的 pH 情况 。 根据受试物性质不同 ,宜考虑限制受试物达到最高试验浓度的其他物理化学因素 。溶解性低的受试物 ,如果其最高溶解饱和浓度点不具有毒性 ,则应当用该物质所能达到的最高溶解浓度进行试验 。对于无细胞毒性受试物(产生沉淀前无 IC50值) ,则应确定其在测定条件下的溶解度极限(限度浓度) ; 在这种情况下 ,可在主试验中包括两个或三个可能发生沉淀的浓度 ,然后在光毒性试验中排除这些浓度 。受试物的最高浓度不应超过 1 000 μg/mL,在许多情况下 ,最高浓度可以降低至 100 μg/mL, 因为在此限值无显著细胞毒性(照射条件下)的化合物可视为无相关光毒性 。在不照射的情况下 ,使用更高的最大浓度以确定用于光刺激因子 (PIF)计算的 IC50值 。预试验时 ,受试物 8个浓度应采用同一稀释因子 ,正式试验时 ,根据预试验结果 ,合理设置稀释因子 。

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　　6.3. 1.3 如果有资料(如范围确定预试验)表明 ,受试物在无光照试验条件下( -Irr)在达到限度浓度时无细胞毒性 ,但在有光照条件下(+Irr)具有较高的细胞毒性 ,这时 ,有光照试验( +Irr)浓度范围的选择应不同于无光照试验( -Irr)浓度范围的选择 , 以符合数据质量控制的要求 。

　　6.4 质量控制

　　6.4. 1 建立细胞光敏感性历史数据

　　通过评估暴露于逐渐增加的辐照度(光强度)后的细胞活性对工作细胞的光源敏感性进行检查 ,应至少检查一次 。应使用传代数最高的细胞来检查其对 UV 的敏感性 。评估时应使用多个照射剂量 ,包括高于体外 3T3NRU光毒性试验使用剂量在内的多个剂量的照射水平都可用于这一检测 。通过测定光源的 UV部件可较为容易地对这些照射剂量加以定量 。细胞按 6. 2. 3. 2 描述的密度接种 ,次日进行照射(见试验步骤中 6. 5. 2) 。第三天使用中性红摄取法检测细胞活性 。检测结果应表明最高无细胞毒性剂量(如 5 J/cm2 UVA) ,并足以对参考化学物质(见表 2)进行正确分类 。

　　6.4.2 检查当前试验细胞的光线敏感性

　　试验应符合的质量标准为 :有光照(+Irr)条件下溶剂对照组的细胞活性与无光照( -Irr)条件下溶剂对照组的细胞活性相比大于 80% 。

　　6.4.3 溶剂对照的活性

　　溶剂对照组中性红提取物测得的绝对光密度(OD540±10NRU ) 表明在试验的两天内以每孔 1× 104 个细胞的 密 度 接 种 细 胞 是 否 以 正 常 的 倍 增 时 间 生 长 。 试 验 应 符 合 质 量 标 准 为 : 溶 剂 对 照 组 平 均OD540±10NRU ≥0. 4, 即约为背景溶剂吸光值的 20倍 。

　　6.4.4 避免中性红溶液结晶

　　在 NR与细胞一起孵育期间 ,应注意 NR溶液的结晶 , 因为晶体可能会导致高变异性 。 中性红溶液pH值的变化可能会触发 NR 晶体的形成 。在细胞培养基中添加 pH稳定剂如 4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4- (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES]可以防止结晶 。 由于不同来源的中性红的质量可能有差异 ,实验前宜评估储备的中性红是否适合用于试验 。宜对细胞培养基中的 NR溶液进行过滤或离心 。

　　6.4.5 阳性对照

　　6.4.5. 1 进行体外 3T3 NRU 光毒性试验时 ,应同时测试一种已知的光毒性化学物质 。宜使用氯丙嗪

　　(CPZ,CAS号 :50-53-3) 。根据历史数据 ,试验可接受标准为 :

　　c) 光刺激因子(PIF) :PIF>6。

　　b(a))) CPZ无光照(CPZ有光照)((+- Irr(Irr))) :: IC50(IC50)7(0)..0(1)μ(μ)g(g)/(/)mL(mL)9(2)0.00μμ(g)g(/)/m(mL)L;;

　　6.4.5.2 应监测阳性对照的历史数据 。进行该试验的实验室应建立本实验室的历史数据 ,包括平均光效应(MPE) , 以监测一段时间内阳性对照物的性能(见表 2) 。

　　6.4.5.3 其他光毒性化学物质 ,若其化学分类或溶解性已被评估过 ,可替代 CPZ用作阳性对照物(见表 2) 。

　　6.5 试验步骤

　　6.5. 1 第一天

　　6.5. 1. 1 加 100 μL培养基于 96孔组织培养板的外围孔(空白对照) , 在其余孔中加入 100 μL密度为

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　　1×105 个细胞/mL 的细胞悬液(即每孔 1×104 个细胞) 。每次试验 ,应制备两块培养板 ,包括相同的受试物浓度序列 、溶剂对照 。 同样 ,对于阳性对照物也应准备两块培养板(包括溶剂对照) 。

　　6.5. 1. 2 细 胞 培 养 18 h~ 24 h 直 至 形 成 近 半 汇 合 单 层 。 在 此 培 养 期 间 细 胞 恢 复 活 力 、贴 附 和 指 数增长 。

　　6.5.2 第二天

　　6.5.2. 1 去除培养基 ,用 150μL孵育缓冲液轻洗细胞 。 加 100 μL含适当浓度受试物或溶剂(溶剂对照)的缓冲液到孔中 。将受试物的 8个不同序列浓度加到两块培养板上 。在暗处将细胞与受试物共同孵育 60 min。

　　6.5.2.2 两块培养板随机选择 ,其中一块用于检测细胞毒性( -Irr) , 即对照板 ;另一块用于检测光细胞毒性(+Irr) , 即处理板 。

　　6.5.2.3 处理板进行 +Irr暴露照射 ,在室温下以无细胞毒性的最高光照射剂量(即 5 J/cm2 ,见附录 B)透过 96孔板盖照射约 50 min,将对照板( -Irr)在室温 、黑暗条件下放置约 50 min(与光照射时间保持一致) 。

　　6.5.2.4 去除试验溶液 ,用 150μL孵育用但不含受试物的缓冲液小心洗两次 。用培养基代替缓冲液孵育过夜(18h~ 24h) 。

　　6.5.3 第三天

　　6.5.3. 1 显微镜观察

　　相差显微镜观察细胞生长情况 、形态和细胞单层的完整性 。记录细胞形态和生长的变化 。

　　6.5.3.2 中性红摄取试验

　　6.5.3.2. 1 用 150μL预温至 37 ℃的缓冲液冲洗细胞 。去除缓冲液 。加 100μL含 50μg/mL NR 的无血清的培养基 ,按照 6. 2. 2要求孵育 3 h。NR溶液可以按以下方式配制 。

　　a) NR原液 :称取 0. 4 g 中性红染料 ,溶于 100 mL水中(室温避光可保存 2个月) 。

　　b) NR培养基 :在 79 mL无血清 DMEM培养基中加入 1 mL NR原液 , 即为 NR 培养基 ,终浓度为 50 μg/mL。 NR 培 养 基 应 在 37 ℃下 孵 育 过 夜 , 应 以 不 低 于 1 890 r/min(转 子 半 径 为15 cm) 的速度离心 10 min, 或过滤(如微孔滤膜过滤) ,去除 NR 晶体 ,确保 NR 培养基不含晶体 。

　　6.5.3.2.2 孵育后 ,去除 NR 培养基 ,用 150 μL缓冲液清洗细胞 。 以吸干或离心方式倾倒和去除多余缓冲液 。

　　6.5.3.2.3 加入 150μL中性红洗脱液(水 、乙醇 、乙酸按 49 ∶ 50 ∶ 1 的体积比浓度现配现用 ,储存时间不超过 1 h) 。

　　6.5.3.2.4 将 96孔板置于微量滴定板振荡器上轻轻摇动至少 10 min,直到 NR从细胞中提取出来并形成均匀溶液 。

　　6.5.3.2.5 用分光光度计或酶标仪在 540 nm±10 nm 下以空白孔为参照测定 NR提取物的光密度 。试验数据以电子数据形式保存 ,便于后续分析 。

　　6.5.3.2.6 中性红摄取试验(见 6. 5. 3. 2)中使用的水应符合 GB/T 6682中一级水的要求 。

　　7 试验结果

　　7. 1 试验数据的质量和数量

　　7. 1. 1 在有光照和无光照下通过浓度-反应试验选择合适的浓度 , 以便得到的试验数据都能进行有意义

　　7

　　GB/T 21769—2025

　　的分析 。尽可能确定使细胞活性下降 50%的受试物的浓度(IC50 ) 。如果观察到细胞毒性 ,可以重新设置试验的浓度范围以获得浓度-反应范围(如导致细胞活性高于和低于 50%的浓度) 。

　　7. 1.2 对于明显阳性和明显阴性的结果 ,应增加一个或多个浓度范围确定预试验 ,无需重复试验进行确认。

　　7. 1.3 对于无法定性或处于临界范围附近的实验结果应通过进一步试验进行确认并改变原来的试验条件 。可改变的试验条件包括 :浓度范围或间距 、孵育时间 、照射暴露时间等 。对于在水中不稳定的化学物质可以选择缩短暴露时间 。

　　7.2 试验结果评价

　　7.2. 1 为评价试验数据 ,应计算光刺激因子(PIF)或平均光效应(MPE) 。

　　7.2.2 为计算光细胞毒性的数值 ,应通过连续浓度-反应曲线(模型)对离散的浓度反应值进行估算 。通常采用非线性的回归方法对数据进行曲线拟合 ,为评估数据变异性对拟合曲线的影响 ,宜采用自举法程序(bootstrap procedure)进行分析 。

　　7.2.3 如果在有光照(+Irr)和无光照( -Irr)两种情况下都得到完整的浓度响应曲线 ,通过公式(2) 计算 PIF值 :

　　PIF …………………………( 2 )

　　式中 :

　　PIF — 光刺激因子 ;

　　IC50 ( -Irr) — 无光照( -Irr)条件下使细胞活性下降 50%的受试物浓度(IC50) ;

　　IC50 (+Irr) — 有光照(+Irr)条件下使细胞活性下降 50%细的受试物浓度(IC50) 。

　　如果在有光照(+Irr)或无光照( -Irr)条件下无法计算 IC50 ,则无法确定受试物的 PIF。

　　7.2.4 平均光效应

　　平均光效应(MPE)是一种基于比较完全浓度反应曲线的计算方法 ,它的定义是指全部具有代表性的光效应数值的加权平均数 。MPE值通过公式(3)计算 :

　　MPE …………………………( 3 )

　　式中 :

　　MPE — 平均光效应 ;

　　w — 加权因子 ;

　　PEc — 任何一个浓度(C)下的光效应(PEc ) 。

　　剂量(是指)公((Pr(照效(I(rr(R)条c)件下观察到(和剂量效应)的(反(DE)c应)之(的)间(乘)的(积),差(即)别P,E(R)。Ir) 应- R(效)c应(+(Irr(RE))。

　　DEc …………………………( 4 )

　　式中 :

　　DEc — 剂量效应 ;

　　C — 浓度 ;

　　C* — 等效浓度 , 即浓度为 C 的 -Irr反应相当于 +Irr时反应的浓度 。

　　其中 C* 代表等效浓度 , 即浓度为 C 时 -Irr反应相当于 +Irr的反应浓度 ,如果由于 +Irr曲线中的反应值整体高于或低于 Rc( -Irr)而使 C* 无法确定 ,则剂量效应定为 1。加权因子 wi 由最高反应值得出 , 即 wi=MAX {Ri(+Irr) ,Ri( -Irr)} 。 网格浓度 Ci 的选择使得落在由试验浓度值确定的每个

　　8

　　GB/T 21769—2025

　　浓度区间内的点数相同 。MPE 的计算仅限于最高浓度值 ,在该浓度下的两条曲线中至少有一条曲线的反应值仍出现至少 10%的情况 。如果这一最高浓度高于 +Irr试验中使用的最高浓度 ,则 +Irr曲线的剩余部分设定为反应值“0”。依据 MPE 的值是否大于正常选择设定的临界值(MPEc≥0. 15) ,对化学物质进行光毒性分类 。

　　7.3 结果解释

　　7.3. 1 由预测模型得出的数值如表 1所示 ,分为以下几种情况 :

　　a) 当 PIF数值小于 2 或 MPE数值小于 0. 1 时 ,预测受试物为“无光毒性 ”;

　　b) 当 PIF数值大于或等于 2且数值小于 5,或 MPE数值大于或等于 0. 1 且数值小于 0. 15时 ,预测受试物为 “可能具有光毒性 ”;

　　c) 当 PIF数值大于或等于 5 或 MPE数值大于或等于 0. 15时 ,预测受试物为“光毒性 ”。

　　表 1 试验结果预测模型

　　受试物光毒性预测情况

　　PIF

　　MPE

　　无光毒性

　　PIF<2

　　或 MPE<0. 1

　　可能具有光毒性a

　　2≤PIF<5

　　或 0. 1≤MPE<0. 15

　　光毒性

　　PIF≥5

　　或 MPE≥0. 15

　　注 : 药用化学品使用其他指南(如 ICHS10) 。

　　a 在制药领域 ,这一类别的化学品与全身性药物的相关性不明确时 ,通常不需要进行进一步的光安全性评估

　　7.3.2 对于初次建立该试验方法的实验室 ,常规进行化学物质光毒性检测前应使用参考化学物质进行试验 ,参考化学物质的种类见表 2。试验得到的 PIF值或 MPE值应接近于表 2 中所列数值 。

　　表 2 参考化学物质的光毒性测定数据

　　化学物名称

　　CAS号

　　PIF

　　MPE

　　光毒性

　　吸收峰

　　盐酸胺碘酮

　　Amiodarone HCL

　　19774-82-4

　　>3. 25

　　0. 27~ 0. 54

　　是

　　242 nm

　　300 nm(肩峰) , 乙醇

　　盐酸氯丙嗪

　　Chloropromazine HCL

　　69-09-0

　　>14. 4

　　0. 33~ 0. 63

　　是

　　309 nm , 乙醇

　　诺氟沙星Norfloxacin

　　70458-96-7

　　>71. 6

　　0. 34~ 0. 90

　　是

　　316 nm , 乙腈

　　蒽

　　Anthracene

　　120-12-7

　　>18. 5

　　0. 19~ 0. 81

　　是

　　356 nm , 乙腈

　　原卟啉 IX二钠盐

　　Protoporphyrin IX, Disodium

　　50865-01-5

　　>45. 3

　　0. 54~ 0. 74

　　是

　　402 nm , 乙醇

　　L-组氨酸

　　L-Histidine

　　7006-35-1

　　无 PIF

　　0. 05~ 0. 10

　　否

　　211 nm ,水

　　六氯酚

　　Hexachlorophene

　　70-30-4

　　1. 1~ 1. 7

　　0. 00~ 0. 05

　　否

　　299 nm

　　317 nm(肩峰) , 乙醇

　　十二烷基硫酸钠

　　Sodium laurylsulfate

　　151-21-3

　　1. 0~ 1. 9

　　0. 00~ 0. 05

　　否

　　无吸收 ,水

　　9

　　GB/T 21769—2025

　　7.3.3 如果光毒性效应在最高试验浓度(特别是水溶性受试物) 时获得 ,评价受试物的危害性可能还需做进一步考虑 ,包括受试物皮肤吸收性和累积的可能性 , 或进行其他试验 ,如 ROS(活性氧) 试验 ,化学物质的体外动物皮肤 、人类皮肤或皮肤模型的检测 。

　　7.3.4 体外 3T3中性红摄取光毒性试验得到的阴性结果(PIF数值小于 2 或 MPE数值小于 0. 1) 表明受试物在试验所用的培养条件下对培养的哺乳动物细胞无光毒性 。

　　8 试验报告

　　试验报告应包含以下信息 。

　　a) 受试物 :

　　1) 识 别 资 料 , 通 用 名 称 , 国 际 纯 粹 与 应 用 化 学 联 合 会 (International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)和美国化学文摘社(ChemicalAbstracts Service, CAS)编号(如果已知) ;

　　2) 物理性质和纯度 ;

　　3) 与试验相关的理化性质 ;

　　4) UV/Vis吸收光谱 ;

　　5) 稳定性和光稳定性(如果已知) 。

　　b) 溶剂 :

　　1) 溶剂选择的理由 ;

　　2) 受试物在溶剂中的溶解性 ;

　　3) 处理培养基中溶剂的体积百分比 。

　　c) 细胞 :

　　1) 细胞类型和来源 ;

　　2) 无支原体和其他污染 ;

　　3) 细胞传代数 ;

　　4) 特定传代范围细胞的光敏感性 ,通过光毒性试验中相同的光照设备测定 。

　　d) 处理前后的孵育 :

　　1) 培养基的类型和组成 ;

　　2) 孵育条件(CO2 浓度 ,温度 ,湿度) ;

　　3) 孵育时间(处理前 ,处理后) 。

　　e) 受试物处理 :

　　1) 有光照和无光照条件下 ,选择受试物浓度的理由 ;

　　2) 受试物溶解度有限而且无细胞毒性的情况下 ,最高浓度试验的理由 ;

　　3) 处理培养基的类型和组成(平衡盐溶液) ;

　　4) 受试物处理的持续时间 。

　　f) 光照 :

　　1) 所用光源选择的理由 ;

　　2) 光源和照度计的制造商和类型 ;

　　3) 光源的发光光谱特性 ;

　　4) 所用的滤光片的透射和吸收特性 ;

　　5) 照度计的特性及其校准的详细资料 ;

　　6) 光源与试验系统的距离 ;

　　7) 在此距离内的 UVA辐照度 , 以 mW/cm2 表示 ;

　　8) 暴露于 UV/Vis下的持续时间 ;

　　9) UVA剂量(辐照度 ×时间) , 以 J/cm2 表示 ;

　　10

　　GB/T 21769—2025

　　10) 光照期间细胞培养的温度和同时放置在暗处的细胞培养温度 。

　　g) 中性红活性试验 :

　　1) 中性红处理培养基的组成 ;

　　2) 中性红孵育持续时间 ;

　　3) 孵育条件(CO2、温度 、湿度) ;

　　4) 中性红提取的条件(提取剂 、持续时间) ;

　　5) 用于读取中性红光密度值的分光光度计(酶标仪)的波长 ;

　　6) 第二波长(参考) ,如果使用 ;

　　7) 分光光度计(酶标仪)的空白值 ,如果使用 。

　　h) 结果 :

　　1) 每个受试物浓度得到的细胞活性 , 以平均活性百分率表示 , 同时测定溶剂对照 ;

　　2) 同时进行的 +Irr和 -Irr试验中获得的浓度反应曲线(受试物浓度与相对细胞活性) ;

　　3) 浓度-反应曲线的数据分析 ,可能的话 ,计算/估算 IC50 (+Irr)和 IC50 ( -Irr)的方法 ;

　　4) 比较在有光照和无光照下获得的两个浓度反应曲线 ,通过 PIF和/或 MPE计算 ;

　　5) 试验接受标准 : 同时试验的溶剂对照 ;

　　6) 有光照和无光照条件下细胞绝对活性(NR提取物的光密度) ;

　　7) 阴性和溶剂对照的历史数据 ,平均值和标准偏差 ;

　　8) 试验接受标准 : 同时试验的阳性对照 ;

　　9) 阳性对照化学物质的 IC50 (+Irr)和 IC50 ( -Irr) ,PIF或 MPE;

　　10) 阳性对照化学物质的历史实验数据 : IC50 ( +Irr) 、IC50 ( -Irr) 、PIF和 MPE,平均值和标准偏差 。

　　i) 结果讨论 。

　　j) 结论 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　3T3NRU 光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用3T3NRU光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用 ,见图 A. 1。

　　注 : MEC>1 000 L/(mol· cm)有科学依据 ,某 些 法 规 指 南 中 存 在 使 用 了 旧 的 MEC值 的 情 况 ; 如 对 MEC值 有 疑问 ,需咨询相关监管部门 。

　　图 A. 1 3T3NRU 光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　光模拟器的谱能和细胞的光照敏感性

　　B. 1 光模拟器谱能分布

　　图 B. 1显示了一个可接受的经滤过的光模拟器的光谱能量分布 , 资料来源于 3T3 NRU 光毒性验证试验中(掺杂)金属卤化物灯 。分别显示两个不同滤光片和 96孔培养板盖的滤过效果 。 H2滤光片仅用于能耐受高剂量 UVB的试验系统(如皮肤模型试验和红细胞光溶血性试验) 。在 3T3 NRU 光毒性试验中应使用 H1滤光片 。 图 B. 1显示培养板盖的滤过作用主要见于 UVB区域 ,辐射光谱中仍残留足够量的 UVB足以激活类似胺碘酮的化学物质 ,它们在 UVB区域具有典型的光吸收作用 。

　　图 B. 1 滤过的光模拟器的光谱能量

　　B.2 细胞的光照敏感性(UVA范围内测定)

　　图 B. 2显示 BALB/c 3T3细胞对光模拟器发射光线的敏感性 , 资料来源于 3T3 NRU 光毒性验证试验 ,数据在 UVA范围内测定 。 图示在预验证研究中 7 个不同的实验室得到的数据 。 两条空心标志的曲线来自衰老的细胞(超次数传代) ,应更新细胞才能用于试验 。标记实心符号的曲线表示可按受的光照耐受水平 。从这些数据得出最高的无细胞毒性照射剂量为 5 J/cm2 (垂直虚线) ,水平虚线显示最高可接受的照射效应 ,见 6. 4. 2。

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　　图 B.2 BALB/c 3T3细胞的光照敏感性(在 UVA 范围内测定)

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　　参 考 文 献

　　[1] ISO 18909: 2006. Photography—Processed photographic colour films and paper prints— Methods for measuring image stability.

　　[2] European Union. Commission Regulation(EU) 2023/464of3 March2023. https://eur-

　　lex. eu[3(r)o]pa. OECD(eu/leg)a-1(c)981(ont)e)ntOECD Guid(/EN/TXT/)?elin(u)re(i)or(C)ETest(LEX)ing(%)3of(A)3C(20)h(2)e(3)m(R)ic(0)al(46)s(4):&U(q)iV(d)-=VIS(17)2A(94)b(7)s(1)o(0)rp(9)t(2)i(6)o(9)n(2). Spectra

　　(No. 101) . OECD, Paris.

　　[4] OECD (2019) . OECD GuidelineforTesting ofChemicals: In Vitro3T3NRU Phototoxicity Test(No. 432) . OECD, Paris.

　　[5] OECD (2005) . OECD Guidance Document: Guidance Document on the Validation and In- ternational Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment ( No. 34) . OECD, Paris.

　　[6] ICH S10 Photosafety Evaluation of Pharmaceuticals. Guidance for Industry. January 2015. https://www. fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm065007. htm.

　　[7] INVITTOX Protocol 78. 3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity Assay. ECVAM DB-ALM; 2008. https://jeodpp. jrc. ec. europa. eu/ftp/jrc-opendata/EURL-ECVAM/datasets/ DBALM/LATEST/online/dbalm. html.

　　15