GB/T 21771-2025 化学品 重复剂量毒性合并生殖+发育毒性筛选试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21771—2025代替 GB/T21771—2008

　　化学品 重复剂量毒性合并生殖/发育

　　毒性筛选试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofcombined repeateddosetoxicity study with

　　thereproduction/developmentaltoxicity screening

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21771—2008《化 学 品 重 复 剂 量 毒 性 合 并 生 殖/发 育 毒 性 筛 选 试 验 方 法》, 与GB/T 21771—2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 更改了试验期限(见第 4章 ,2008年版的第 3 章) ;

　　— 更改了试验方法内容 ,增加了 “发情周期 ”内容 ,筛选具有规律发情周期的雌性动物 ;增加了 “窝产仔数 ”内容 ,调整了窝仔数量及评定幼仔内分泌相关指标 ;增加了甲状腺激素水平的检测(见第 5 章 ,2008年版的第 4章) ;

　　— 更改了数据统计方法内容(见第 6章 ,2008年版的第 5 章) ;

　　— 增加了 “甲状腺激素水平”“成年雌性动物发情周期正常或异常的数量及周期时长 ”“幼仔体重数据”“所有幼仔的 AGD及 AGD测量 日 的体重”“雄性幼仔的乳头评估情况 ”(见 6. 3) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、河北医科大学 、福建宁佳竣检测技术服务有限公司 。

　　本文件主要起草人 :张荣 、庞雅贤 、刘清萍 、暴磊 、李斌 、陈宵 、边洪英 、于常艳 、林立伟 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21771—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　引 言

　　在对化学品毒作用特征进行评价过程中 , 通常在急性经口毒性试验以后 ,进行重复剂量毒性的确定 。本文件在有限时间内提供重复剂量染毒后可能产生的健康损害效应 。对于尚未批准进行 90天研究的化学品 ,本文件提供重复剂量染毒后的基本毒作用资料 ,可作为长期试验的预试验 。

　　本文件包含了生殖/发育毒性筛选试验 ,初步提供受试物可能影响雄性和雌性生殖能力(如生殖腺功能 、交配行为 、怀孕 、胎鼠和幼仔的发育情况)的资料 。本文件既适用于早期危险度评价 ,也适用于重点关注的化学品 。本文件不能提供关于生殖/发育各方面的完整信息 ,只能提供有限的手段来检测产前暴露的产后表现 ,或产后暴露期间可能诱发的影响 。 由于(除其他原因外)剂量组的动物数量相对较少 、终点的选择以及研究时间较短等原因 ,本文件不能作为判定无生殖/发育毒性的确证依据 。此外 ,若缺乏其他生殖/发育毒性测试数据 , 阳性结果可用于初步的危险度评价 ,并有助于决定是否需要其他测试及测试的时间安排 。

　　本文件提供关于内分泌相关终点不良影响的数据 ,但不足以作为测试化学品是内分泌干扰物的充分证据 。此外 ,本文件还可提供一些神经毒性的信息 。

　　在缺乏生殖/发育毒性 、内分泌毒性和神经毒性研究资料时 , 阳性结果可用于初步的危险度评价 ,有助于决定是否需要其他测试及测试的时间安排 ,用于评估现有化学品的毒性(尤其是当相关毒理学信息极少或缺失时) ,并可作为替代方案 ,避免分别开展重复剂量毒性试验和生殖/发育毒性试验两项独立试验 。此外 ,本文件还适用于探索更全面生殖/发育毒性试验的剂量范围 ,或在其他相关场景下应用 。

　　通常认为 ,怀孕动物与非怀孕动物对受试物的敏感度存在差异 。 与单独开展重复剂量毒性试验和生殖/发育毒性试验相比 ,组合试验中剂量水平的确定更为复杂 ,需兼顾一般毒性评估与生殖/发育毒性评价的需求 。此外 , 由于试验中可能未同步评估血清学指标和组织病理学指标 ,对一般毒性相关结果的解释难度可能高于独立的重复剂量毒性试验 。鉴于上述技术复杂性 ,执行此类试验需要具备丰富的毒性测试经验 。另一方面 ,除所需动物数量较少外 ,组合试验在区分生殖/发育的直接毒性效应与间接毒性效应方面可能更具优势 。

　　本文件较常规 28天重复剂量试验染毒时间长 。但与同时开展常规 28天重复剂量试验和生殖/发育毒性试验相比 ,其优势在于动物使用量更少 。

　　本文件采用经口染毒途径 。如果采用其他暴露途径 ,需进行修改 。

　　Ⅱ

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　　化学品 重复剂量毒性合并生殖/发育

　　毒性筛选试验方法

　　1 范围

　　本文件规定了化学品重复剂量毒性合并生殖/生长发育毒性筛选试验的试验基本原则 、试验方法 、试验数据和报告 。

　　本文件适用于检测化学品的重复剂量毒性及致畸性 、繁殖及生长发育毒性筛选 ,也适用于致畸试验 、一代和两代繁殖毒性的预试验 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14925 实验动物 环境及设施

　　3 术语、定义和缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1. 1

　　雄激素活性 androgenicity

　　一种化学物质在哺乳动物体内表现出类似天然雄激素(如睾酮)生理作用的能力 。

　　3. 1.2

　　雌激素活性 oestrogenicity

　　一种化学物质在哺乳动物体内表现出类似天然雌激素(如雌二醇 17β)的能力 。

　　3. 1.3

　　抗雌激素活性 antioestrogenicity

　　一种化学物质在哺乳动物体内抑制天然雌激素(如雌二醇 17β)作用的能力 。

　　3. 1.4

　　甲状腺活性 thyroid activity

　　一种化学物质在哺乳动物体内表现出类似天然甲状腺激素(如三碘甲腺原氨酸 ,T3)的能力 。 3. 1.5

　　抗甲状腺活性 antithyroid activity

　　一种化学物质抑制哺乳动物体内天然甲状腺激素(如 T3)作用的能力 ,影响新陈代谢及依赖甲状腺激素的其他生理过程 。

　　3. 1.6

　　发育毒性 developmentaltoxicity

　　子代在出生前 、围产期和出生以后所表现出的结构(机体缺陷)或功能异常 。

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　　3. 1.7

　　剂量 dose

　　受试物用量 。

　　3. 1. 8

　　用量 dosage

　　包括染毒剂量 、染毒次数及染毒期限在内的一般性术语 。

　　3. 1.9

　　生殖毒性 reproduction toxicity

　　对后代的有害影响或对雄性和雌性生殖功能或能力的损害 。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　AGD:从肛门到生殖器之间的距离(anogenital distance)

　　PND:通常在生物医学和发育生物学中用于描述出生后的天数(postnatal day)

　　UVBCs:组分未知或者可变的物质 、复杂反应产物或者生物材料(chemical substances of unknown or variable composition,complex reaction products and biological materials)

　　4 试验基本原则

　　4. 1 按照雌 、雄两个性别 ,设多个剂量组给予受试物 。 直至处死 ,雄性动物的染毒期至少 4 周 , 即交配前期最少染毒 2周 ,交配期和交配后期染毒约 2周 。 由于雄性动物交配前染毒时间相对较短 ,繁殖力不能作为睾丸毒性的特异性敏感指标 , 因此对睾丸进行详细的组织学检查很重要 。通过对染毒期内雄性动物的交配行为/繁殖能力的观察 , 以及随后对雄性动物生殖腺的详细组织病理学检查可检出对雄性动物繁殖力和精子形成的主要毒性作用 。

　　4.2 雌性动物在整个试验期都进行染毒 。包括交配前两周(至少包括两个完整的发情期) ,交配期 、妊娠期和分娩后至少 13天 ,直至处死的前一天都需进行染毒 。

　　4.3 在适应期结束后 ,试验持续时间取决于雌性动物的毒性表现 。试验期限约为 63天 , 即交配前至少14天 ,交配期 14天左右 ,妊娠期和哺乳期则分别 22天和 13天左右 。

　　4.4 染毒期间 ,每日观察动物的毒性表现 。对试验期间死亡或处死的动物都进行解剖检查 。试验结束时 ,所有存活动物均处死并进行解剖检查 。

　　5 试验方法

　　5. 1 动物选择

　　本文件的受试动物为大鼠 。如选用其他种属动物 ,应作适当修改 。避免选用繁殖力低和公认生长发育缺陷率高的品系 。首选健康 、刚进入性成熟期 、未经交配 ,并且未参加过任何试验的动物 。所选动物应注明种类 、品系 、性 别 、体 重 和 周 龄 。 试 验 开 始 时 , 动 物 的 体 重 相 差 不 应 超 过 同 性 别 平 均 体 重 的20% 。如果本试验是某项长期试验或完整的生殖试验的预试验 ,应确保两个试验所选试验动物的品系和来源的一致性 。

　　5.2 饲养条件

　　5.2. 1 饲养条件应符合 GB 14925要 求 。 动 物 实 验 室 的 环 境 温 度 需 为 23 ℃ ± 3 ℃ , 相 对 湿 度 至 少 为

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　　30% ,不宜超过 70% , 目标为 50% ~ 60% ,但清扫动物实验室时除外 。采用人工照明 ,保持 12 h 光照和12 h黑暗交替循 环 。 喂 饲 常 规 饲 料 , 动 物 自 由 饮 水 。 如 采 用 喂 饲 染 毒 方 式 , 为 保 证 与 受 试 物 均 匀 混合 ,可能会影响饲料的选择 。

　　5.2.2 试验动物按性别 、少量分笼群养(每笼不能超过 5 只) ,交配过程在合适的笼具中进行 。 孕鼠单笼饲养 ,并给予造窝垫料 。 哺乳期雌鼠与其幼仔分别单独放置在笼中 。

　　5.2.3 包括非掺饲料在内的饲料需定期进行污染物分析 ,周期由实验室自行拟定 。饮食样本保留至报告完成 。

　　5.3 动物准备

　　健康成年动物随机分成对照组和染毒组 。尽量降低由于笼具放置不当对试验结果的影响 。对动物和笼具进行标记 ,并于试验开始前在笼中适应性喂养至少 5 天 。

　　5.4 样品处理

　　5.4. 1 推荐经口方式给予受试物 ,如有更合适的途径 ,也可采用其他染毒方式 。如选用经口染毒 ,一般采用灌胃方式给予 ,也可通过掺入饲料或饮用水的方式给予 。

　　5.4.2 根据试验目的将受试物溶解或混悬于适宜的赋形剂中 。尽可能选择水或悬浮液 ,如确实不能以水作为溶剂 ,再考虑选用油溶液或乳化液(如玉米油) ,然后再考虑其他赋形剂 。 当赋形剂不是水时 ,应了解赋形剂的毒性及受试物在赋形剂中的稳定性和均匀性 。

　　5.5 程序

　　5.5. 1 动物数量和性别

　　各组在试验开始时至少有 10只雄性和 12只/13只雌性 。在研究开始之前 ,雌性动物将被评估发情周期 。如果动物未表现出典型的 4 天/5天周期 ,将不包括在研究中 。 为了每组能够有 10只孕鼠 ,宜增加雌鼠数量 。为了获得足够的数据 , 以便正确评估受试物对动物的繁殖 、妊娠 、母鼠和幼仔行为 , 以及对子代从受孕到出生后第 13天的生长发育的影响 , 每组至少有 8 只孕鼠 , 除非出现明显的毒性效应 。若对试验动物进行阶段性处死 ,需增加动物数量以满足计划要求 。在对照组和最高剂量组中宜各增设一个卫星组(每性别 5 只动物) ,用于观察一般毒性效应的可逆性 、持续性和延迟性(至少持续观察至给药结束后 14天) 。卫星组动物不参与交配 , 因此不用于生殖/发育毒性评估 。

　　5.5.2 剂量设计

　　5.5.2. 1 试验至少设 3个染毒组和 1个对照组 。受试物的剂量水平应根据其急性毒性试验或多次染毒试验的结果来设定 。如果没有适宜的一般毒性资料可供参考 ,应进行预试验确定剂量水平 。对照组动物除不给予受试物外 ,其余的处理应与染毒组完全相同 。如果受试物使用赋形剂配制 ,对照组应接受所用赋形剂的最大使用量进行平行染毒 。

　　5.5.2.2 染毒剂量水平的选择需考虑受试物或相关物质已知的毒性和毒代动力学的数据 。还应注意怀孕和非怀孕动物对受试物敏感性的差异 。最高剂量组应可使亲代动物出现毒性反应 ,但又不引起动物死亡或明显的损害 ;下一个剂量水平选择可出现与剂量有关的反应 ,最低剂量组应不引起亲代及其子代动物的任何毒性反应 。组间距通常为 2 倍 ~ 4 倍 。若设第 4 个剂量组 ,剂量组间的组距则可考虑大 一些 ,例如 10倍 。

　　5.5.2.3 在观察到一般毒性(如体重减轻 ,肝脏 、心脏 、肺或肾脏的影响等) 或其他可能不是毒性反应的变化(如食物摄入减少 、肝脏增大)时 ,需谨慎解读对内分泌敏感终点的观察结果 。

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　　5.5.3 限量试验

　　如果受试物每天以 1 000 mg/(kg · d)的剂量经口给予 ,或经饲料/饮水给予相当的剂量 ,仍未观察到任何毒作用时 ,则可采用限量试验 , 即不必做有多个剂量组的完整试验 。若根据相关化合物结构资料预期不会产生毒性 ,也可采用限量试验 。但当人的接触情况表明需要采用较高剂量染毒时 ,则不能进行限量试验 。若试验采用的是其他的染毒途径 :如吸入或经皮染毒 ,染毒的最高浓度通常由受试物的理化特性来决定 。

　　5.5.4 染毒

　　5.5.4. 1 试验动物每天染毒 1 次 ,每周染毒 7 天 ,受试物一般通过灌胃给予 。使用灌胃针管或其他插管一次给予 。灌胃量取决于试验动物的大小 ,最大量不超过 10 mL/(kg · d) 。 如果受试物为水溶液 ,灌胃量则可考虑增大到 20 mL/(kg · d) 。在整个试验过程中 ,采用相同的灌胃体积 , 通过调整受试物浓度确保各剂量组的灌胃体积相同 ,尽量降低灌胃体积对试验结果的影响 。通常具有刺激性或腐蚀性的物质在浓度较高时毒作用会加重 。

　　5.5.4.2 如果将受试物掺入饲料或溶于水中进行染毒 ,受试物在饲料或水中的含量不应影响正常的营养成分或水的平衡 。饲料中受试物质量分数(mg/kg) 或按体重计算的剂量水平需恒定不变 ,使用其他替代方法需说明理由 ,灌胃染毒需在每天相同时间进行 ,为使染毒剂量保持一致 ,需根据体重的变化每周至少调整 1 次灌胃总体积 。本文件作为长期毒性研究或完整生殖毒性研究的预试验时 ,两项研究应使用相同类型的饲料以确保一致性 。

　　5.5.5 试验程序

　　5.5.5. 1 雄性和雌性动物经过至少 5 天的适应期后进入正式试验 ,交配前 2 周开始染毒 。试验动物在进入完全性成熟后需尽快开始交配 , 由于大鼠品系不同 ,性成熟期不同 , 因此 ,针对不同品系动物选用的交配时间存在差异 ,例如 ,斯普拉格-道利(Sprague Dawley,SD)大鼠的交配期从第 10周开始 ,而维斯塔尔(Wistar)大鼠的交配期则从第 12周开始 。孕鼠在分娩后第 13天处死 。如果采集血样需要对母鼠进行隔夜禁食 ,则不必在同一天处死母鼠和幼仔 。完成分娩过程的当天计为分娩后第 0 天 ,没有交配迹象的雌鼠在交配期结束后再过 24天 ~ 26天处死 。雄性和雌性动物在交配期内均继续染毒 。雄性动物在交配期后继续染毒 ,至少持续 28天 。根据试验设计处死雄性动物 ,或保留进行下一次交配 。

　　5.5.5.2 母鼠在 整 个 怀 孕 期 , 直 至 分 娩 后 第 13天 或 处 死 的 前 一 天 均 需 每 天 染 毒 。 如 吸 入 或 经 皮 染毒 ,染毒至少持续至怀孕的第 19天 ,并且尽快重新开始染毒 ,不应迟于出生后第 4 天 。

　　5.5.5.3 试验流程表见附录 A 的表 A. 1。

　　5.5.6 发情周期

　　为筛选具有规律发情周期的雌性动物 ,在开始染毒前监测发情周期 。 每天进行阴道涂片直至出现交配现象 。为避免开始染毒时存在急性应激反应引起发情周期改变的情况 ,可先让动物暴露 2周 ,在交配前期每天收集阴道涂片 ,监测发情周期 ,并在交配期继续监测 ,直至出现交配现象 。在获取阴道/宫颈细胞时 ,注意避免黏膜干扰 , 以防诱导假孕 。

　　5.5.7 交配方法

　　雄性和雌性动物按 1 ∶ 1(1雌鼠和 1雄鼠)形式合笼交配 。为避免雄性动物的偶然死亡对试验造成影响 ,可不采用此交配比例 。雌鼠始终与同剂量组的同一只雄鼠合笼交配直至受孕 ,合笼时间最长不超过两周 。在交配过程中 ,每天早晨对雌鼠进行检查 ,查看阴道中是否有精子或阴栓 。将检查到精子或阴栓的当天计为雌鼠妊娠的第 0 天(判为交配成功) 。若交配两周后仍未受孕 ,可将不育的雌鼠与同一剂

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　　量组内已被证实有生育功能的雄鼠重新配对 ,再次合笼交配 。

　　5.5. 8 窝产仔数

　　5.5. 8. 1 在出生后的第 4 天 ,根据所用品系的正常窝仔数量 ,通过随机选择淘汰多余幼仔 ,将每窝的幼仔数量调整为雌雄各 5 只 。从多余的幼仔中收集两份血液样本 ,合并后用于测定血清甲状腺素水平 。根据体重或 AGD将不合适的幼仔淘汰 。 当幼仔的数量无法保证雌雄各 5 只时 ,允许进行部分调整(如6 只雄性和 4 只雌性) 。 当窝产仔数低于淘汰目标值 ,则不淘汰任何幼仔 。若超出淘汰目标值的幼仔仅余 1 只 ,则只淘汰 1 只幼仔用于采血以评估血清甲状腺素水平 。

　　5.5. 8.2 如果没有调整窝产仔数 ,在出生后的第 4 天每窝处死 2 只幼仔 ,并采集血液样本以测量血清甲状腺素浓度 。处死的 2 只幼仔尽可能是雌性 ,用于进行乳头评估 。若无雌性幼仔 ,则使用雄鼠进行乳头评估 。 当窝产仔数在每窝 10只以下(取决于品系的正常窝产仔数)时 ,不淘汰任何幼仔 。 当窝产仔数在每窝 10只以上仅 1 只时 ,只淘汰 1 只幼仔用于采血以评估血清甲状腺素水平 。

　　5.5.9 观察

　　5.5.9. 1 试验期间 ,每天至少进行 1 次一般临床观察 ,若发现中毒体征 ,需增加观察次数 。 每天的观察时间需固定 ,并选择在染毒后毒性体征可能出现的高峰期 。记录动物的健康状况 。 每天至少观察两次动物发病和死亡情况 。

　　5.5.9.2 在第一次染毒前详细记录所有动物基本情况 , 以后每周至少记录一次 ,检查时应在笼外标准台面上 ,每日观察时间宜固定 。详细记录检查结果 ,宜采用评分系统 ,实验室应有明确的评分标准 。尽量减少实验条件的差异对检查结果的影响 , 宜进行盲法观察 。 观察体征应包括(但不限于) 以下内容 : 皮肤 、毛发 、眼睛和黏膜的变化 ,分泌物或排泄物 , 自主运动情况(如流泪 、竖毛 、瞳孔大小 、异常呼吸等) ;步态 、姿势和对染毒操作的反应等状态的改变 , 阵挛 、强直性动作 ,刻板行为(如特别的梳理毛发动作 、重复转圈等) ;分娩困难和异常行为(例如自残 、倒退行走)等 。

　　5.5.9.3 试验期间 ,每组随机选取 5 只雄性和 5 只雌性进行以下测试 :多模态感官刺激反应(听觉 、视觉和本体感觉等) ;抓握力和活动度 。在染毒结束时处死雄性动物 ,取血测定血液生化指标 。雌性动物需在生理状态相近的条件下进行上述功能测试 ,优选于哺乳期末周(如哺乳期第 6 天至第 13天)且尽量接近计划处死日完成测试 。母鼠和幼鼠的分离时间最小化 。

　　5.5.9.4 若本试验是亚慢性试验(90天) 或长期试验的预试验 ,研究结束时可不进行功能检查 ,但需在后续试验进行功能检查 。另外 ,利用本试验获得的功能检查结果 , 可为亚慢性试验(90天) 或长期试验的剂量设计提供更充分的依据 。

　　5.5.9.5 若某剂量组出现毒性症状 ,且这些毒性体征可能对功能检查造成干扰 ,则无需进行功能检查 。

　　5.5.9.6 从怀孕的第 0 天开始记录妊娠时间 。分娩后尽早检查并记录每窝的出生幼仔数 、活仔数 、死仔数 、低体重仔数 、性别以及幼仔外观有无异常和畸形 。

　　5.5.9.7 以窝为单位 ,按性别记录活幼仔出生后 24h 内(产后第 0 天或第 1 天) 、产后第 4 天和第 13天的窝重 。 除观察母鼠外 ,并记录幼仔的所有异常行为 。

　　5.5.9. 8 在出生后第 0 天到第 4 天之间的同一天测量每只幼仔的 AGD;测量 AGD 当天记录幼仔体重 ,并用其归一化 AGD, 以体重的立方根为宜 。在出生后第 12天或 13天计算雄性 幼 仔 的 乳 头/乳 晕数量 。

　　5.5. 10 体重和食物消耗量

　　5.5. 10. 1 雄性和雌性动物在染毒的第 1 天进行称重 , 以后每周至少称量一次 ,试验结束时一次 。妊娠的第 0 天 、第 7 天 、第 14天 、第 20天 、分娩后的 24h 内(产后第 0 天或第 1 天) 、产后第 4 天和第 13天称重 。记录每只试验动物的体重数据 。

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　　5.5. 10.2 交配期 、孕期和哺乳期 , 每周至少记录一次食物消耗量(交配期的食物消耗量为选测指标) 。如果受试物的溶剂为水 ,水溶液的摄入量也需按上述时间要求进行记录 。

　　5.5. 11 血液学指标

　　5.5. 11. 1 试验开始时在每组动物中随机选取 5 只雌性和 5 只雄性动物进行血液学检查 ,测定指标包括血细胞比容 、血红蛋白浓度 、红细胞计数 、网织红细胞 、白细胞总数及分类计数 、血小板计数以及凝血时间/功能等 。若受试物或 其 代 谢 物 具 有 或 疑 似 具 有 氧 化 性 质 , 则 检 测 高 铁 血 红 蛋 白 浓 度 和 亨 氏 小 体指标 。

　　5.5. 11.2 在指定部位采集血样 。雌性动物在采血时需处于相同的生理期 。 为避免怀孕时间不同造成的操作困难 ,可在交配结束时采血代替孕期采血 。雄性动物在处死前采血为宜 ,也可与雌性动物一起在交配结束时采血 。

　　5.5. 11.3 血样应在合适条件下储存 。

　　5.5. 12 临床生化

　　5.5. 12. 1 对每组随机选取的 5 只雄性和 5 只雌性动物的血液样本进行临床生化检测 , 以评估主要组织毒性效应(尤其是对肾脏和肝脏的影响) 。采血前需对动物禁食过夜 。血浆和血清的测定指标包括 :钠 、钾 、血糖 、总胆固醇 、尿素氮 、肌酐 、总蛋白 、白蛋白 、至少两种可反映肝功能的酶(如丙氨酸氨基转移酶 、天门冬氨酸氨基转移酶 、山梨醇脱氢酶)和胆汁酸 。根据受试物的毒性特征 ,可增加其他检测 。

　　5.5. 12.2 根据以下时间采集血液样本 :

　　a) 若幼鼠数量足够 ,则在出生后的第 4 天至少采集每窝 2 只幼鼠的血液 ;

　　b) 在第 13天终止时 ,采集所有母鼠以及每窝至少 2 只幼鼠的血液 ;

　　c) 在试验终止时 ,采集所有成年雄鼠的血液 。

　　所有血液样本在适当条件下储存 。评估第 13天幼鼠和成年雄鼠的血液样本中血清甲状腺素水平 。如有关联 ,则对母鼠和第 4 天幼鼠的血液样本的甲状腺素进行分析 。如有必要 ,可测量其他激素 。可按窝将幼鼠血液混合进行甲状腺激素分析 。 甲状腺激素(甲状腺素和促甲状腺激素)宜测定总浓度指标 。

　　5.5. 12.3 在试验最后 1周 ,每组随机选取 5 只雄性动物进行尿常规检查 : 外观 、尿量 、渗透压或比重 、 pH值 、蛋白质 、葡萄糖和潜血/血细胞 。

　　5.5. 12.4 也可检测血清中反映组织损伤的标志物 。若根据受试物的特性推测其可能对代谢产生的影响 ,可检测 :钙 、磷酸盐 、空腹甘油三酯 、空腹血糖 、特异性激素 、高铁血红蛋白 、胆碱脂酶活性等指标 ,根据具体情况可增加其他检测 。

　　5.5. 12.5 以下因素可能影响激素的变异性和绝对浓度 :

　　a) 由于昼夜变化 ,处死的时间可能影响激素测定的变异性和绝对浓度 ;

　　b) 处死方式可能通过应激影响激素浓度 ;

　　c) 由于不同测定试剂盒标准曲线不同影响激素浓度 。

　　5.5. 12.6 在一天中的相近时间采集血浆样本 。不同商用测定试剂盒在分析激素浓度时所得数据不同 。

　　5.5. 12.7 若历史对照数据有限 ,可考虑在染毒开始前测定血液学及临床生化指标 ,或在对照组中测定 。雌性动物的相关数据需来源于哺乳期个体 。

　　5.5. 13 病理

　　5.5. 13. 1 大体解剖检查

　　5.5. 13. 1. 1 对所有成年的受试动物进行全面系统的大体解剖检查 ,仔细检查体表 、所有体腔开口处 、颅腔 、胸腔 、腹腔和内部脏器 。重点观察生殖系统的组织和器官 , 同时记录着床数和黄体数 。解剖当天进

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　　行阴道涂片检查 , 以确定发情周期的阶段 ,并与雌性生殖器官的组织病理学进行相关性分析 。

　　5.5. 13. 1.2 所有成年雄性动物的睾丸 、附睾 、前列腺和精囊腺宜去除附着的组织 ,并在解剖后测量其湿重 , 以避免组织干燥 。保留所有成年动物的卵巢 、睾丸 、附属性器官以及其他有损害的器官 。

　　5.5. 13. 1.3 检查死胎和产后第 13天处死的幼仔外观有无畸形 。宜检查外生殖器是否有发育改变的现象 。第 13天时 ,每窝保留 1 只雄性和 1 只雌性幼仔的甲状腺 , 以备后续组织病理学检查 。 甲状腺重量可在固定后测定 。修剪附着组织需谨慎 ,且仅在固定完成后实施防止组织损伤 ,进而影响病理学分析结果 。血液样本在动物安乐死之前采集 ,并在适当的条件下储存 。

　　5.5. 13. 1.4 每组随机选取 5 只雌性和 5 只雄性动物 , 留取肝 、肾 、肾上腺 、胸腺 、脾 、脑和心脏等脏器 ,修剪附着组织 ,解剖后尽快称重 , 防止干燥 。选用适宜的固定液保存以下组织以便进行组织学检查 :脑(一般应包括大脑 、小脑和脑桥) 、脊髓 、胃 、小肠和大肠[包括派尔集合(Peyer氏) 淋巴结] 、肝 、肾 、肾上腺 、脾 、心脏 、胸腺 、甲状腺 、气管和肺(先以固定液灌注再浸入固定液) 、子宫 、膀胱 、淋巴结(除靠近引流淋巴结外 ,其他根据实验室经验选取) 、周围神经(坐骨神经或胫神经 ,宜选择近肌肉端) 、骨骼肌 、骨骼及骨髓(切片或新鲜骨髓穿刺涂片)以及其他有损害的器官 。

　　5.5. 13. 1. 5 常规检查睾丸和附睾时避免使用福尔马林固定 ,宜使用波恩氏液或改良戴维森氏固定液 。用针在器官的两侧轻轻刺入白膜 ,使固定剂快速渗透 。根据临床观察或其他研究结果保存有关组织 ,此外 ,潜在靶器官也需予以保存 。

　　5.5. 13. 1.6 下列组织可能为内分泌相关效应提供提示 :性腺(卵巢和睾丸) 、附属性器官(子宫和宫颈 、附睾 、精囊腺 、前列腺等) 、阴道 、垂体 、雄性乳腺和肾上腺 。雄性乳腺的变化尚未被充分记录 ,但该参数可能对具有雌激素作用的物质比较敏感 。

　　5.5. 13. 1.7 检查死胎和产后第 13天处死的幼仔外观有无畸形 。 宜 检 查 外 生 殖 器 是 否 有 发 育 改 变 的现象 。

　　5.5. 13.2 组织病理学检查

　　5.5. 13.2. 1 先对高剂量组和对照组动物的卵巢 、睾丸及附睾进行组织学检查(重点关注生精阶段和睾丸间质细胞结构的组织病理学变化) 。 幼鼠和成年动物的甲状腺等其他保存器官 , 可根据需要进行检查 。 甲状腺重量可在固定后测定 。修剪附着组织需谨慎 ,且仅在固定完成后实施 , 以避免组织损伤 , 因组织损伤可能影响组织病理学分析结果 。若高剂量组动物出现组织病理学改变 ,则需将检查扩展至其他剂量组动物 。

　　5.5. 13.2.2 所有肉眼可见病变均进行病理检查 。 为辅助阐明未观察到有害作用水平(no-observed-ad- verse effectlevel;NOAEL) ,需对其他剂量组靶器官(观察到 NOAEL的组别)进行重点检查 。

　　5.5. 13.2.3 若使用卫星组 ,对处理组中观察到效应的组织和器官进行病理学检查 。

　　6 试验数据和报告

　　6. 1 数据

　　6. 1. 1 采用表格记录每只动物的数据 ,表中应显示每组的实验动物数量 、试验期间死亡或出于人道原因处死的动物数量 ,死亡或人道原因处死的时间 ,具有生育能力的动物数量 、受孕雌鼠数量 、各种毒性反应及其出现动物百分数 。记录观察到的毒性体征 ,包括出现的时间 、持续时间和程度 、病理组织学改变和相关的幼仔资料 。试验结果汇总格式见附录 B 的表 B. 1。

　　6. 1.2 研究结果采用合适的统计学方法进行检验 。 多剂量组的多重比较避免使用 t检验 。 在本研究中 ,应选择合适的统计方法 。AGD 和乳头评估的统计分析以幼仔个体数据为基础 , 同时考虑窝效应 。适当时 , 以窝为分析单位 。幼仔体重的统计分析也需基于幼仔的个体数据 ,并考虑到窝产仔数 。鉴于研究规模有限 , 以 “显著性检验 ”形式开展的统计分析对多数观察指标(尤其是生殖相关指标) 价值有限 。

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　　若采用统计分析 。所选方法需适配所检测变量的分布特征 ,且需于研究试验前确定 。

　　6.2 结果评价

　　6.2. 1 受试物的毒性作用按临床观察 、大体解剖和病理组织学的检查结果进行评价 ,并根据受试物的剂量与下列异常情况及其严重程度之间是否存在剂量-反应关系进行评价(如肉眼观察到的大体损伤 、确定的靶器官 、不育 、临床表现异常 、对生殖和幼仔生存的影响 、体重变化 、对死亡率及其他毒性作用的影响) 。

　　6.2.2 由于雄性动物染毒时间较短 ,评价受试物对雄性动物生殖系统的影响时 ,不仅要考虑繁殖能力数据 ,还应对睾丸和附睾的组织病理学检查进行综合评价 。生殖/发育的历史对照数据(如窝产仔数)有助于对研究结果的解释 。

　　6.2.3 为了质量控制 ,宜收集历史对照数据 ,并计算数据变异系数 ,特别是与内分泌干扰物检测相关的参数 。

　　6.3 结果报告

　　试验报告包括以下内容 。

　　a) 受试物信息 :

　　— 来源 、批号 、使用期限(如有需注明) ;

　　— 受试物的稳定性(若已知) 。

　　b) 单一成分物质 :

　　— 物理性状 、水溶性和其他相关理化性质 ;

　　— 化学标识信息 ,包括 IUPAC或 CAS名称 、CAS编号 、SMILES或 InChI代码 、结构式 、纯度 、杂质等 。

　　c) 多成分物质 、UVBCs和混合物 :通过各组分的化学标识 、定量组成和相关理化性质进行表征 。

　　d) 赋形剂 :如果使用的赋形剂不是水 ,则需说明理由 。

　　e) 实验动物 :

　　— 动物种类 、品系 、等级 。如不是啮齿类 ,说明原因 ;

　　— 动物数量 、周龄 、性别 ;

　　— 来源 、饲养条件 、饲料等 ;

　　— 试验开始每只动物体重 。

　　f) 试验条件 :

　　— 剂量分组的理由 ;

　　— 受试物配比 、应用浓度 、稳定性和均匀性及饲料制备的详细资料 ;

　　— 受试物染毒方式的详细资料 ;

　　— 如掺入饲料或饮用水 ,饲料或饮用水中受试物的含量需换算成实际剂量[mg/(kg · d)] ;

　　— 饲料和饮用水质量的详细资料 ;

　　— 详细说明选择幼仔进行剔除(如果被剔除)的随机程序 。

　　g) 试验结果 :

　　— 体重/体重变化 ;

　　— 摄食量及摄水量(若需要) ;

　　— 按性别和剂量组分别记录的毒性反应 ,包括繁殖力 、妊娠和其他的毒性症状 ;

　　— 孕期时间 ;

　　— 对生殖功能 、子代和出生后生长情况等毒性及其他效应 ;

　　— 临床观察结果 、严重程度和持续时间(是否可逆) ;

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　　— 感觉 、抓力和活动度评价 ;

　　— 血液学指标检测结果(包括相关基线值) ;

　　— 临床生化指标检测结果(包括相关基线值) ;

　　— 活仔数和着床后的丢失数 ;

　　— 肉眼可见畸形 、外生殖器大体评估结果 、发育迟缓幼仔数 ;

　　— 试验中动物死亡时间或存活至试验结束的动物数 ;

　　— 着床数 、窝产仔数及记录时的窝重 ;

　　— 甲状腺激素水平(第 13天幼仔 、成年雄性 、母鼠及第 4 天幼仔) ;

　　— 亲代动物处死时体重和脏器重量 ;

　　— 大体解剖检查结果 ;

　　— 组织学检查结果 ;

　　— 吸收胎数据(如可得如有需注明) ;

　　— 成年雌性动物发情周期正常或异常的数量及周期时长 ;

　　— 幼仔体重数据 ;

　　— 所有幼仔的 AGD及 AGD测量 日 的体重 ;

　　— 雄性幼仔的乳头评估情况 ;

　　— 统计学结果 。

　　h) 结果讨论 。

　　i) 结论 。

　　6.4 结果解释

　　本试验可评价动物在多次接触某一受试物后所引起的生殖/发育的毒性作用 。本试验同时涵盖 一般毒性和生殖/发育毒性终点,其结果包括以下两种情况 : 1)未伴随一般毒性的生殖/发育毒性;2) 仅在母体动物出现毒性效应时表现出生殖/发育毒性 。可为判定是否需要进一步试验提供依据 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　最长试验周期(交配期为 14天)的交配流程图

　　重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验交配日程图见图 A. 1。

　　雄鼠 雄鼠

　　雄鼠 +雌鼠 雄鼠(可选暴露) 孕鼠 母鼠 仔鼠 雌鼠 雌鼠 非孕雌鼠 暴露前(14天) 交配前(14天) 交配

　　(最多 14天) 妊娠

　　(约 22天) 哺乳期(13天) 0 7 14 21 28 35 42 49 56 64 77

　　图 A. 1 重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验交配日程图

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验结果汇总表重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验结果汇总表见表 B. 1。

　　表 B. 1 重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验结果汇总表

　　观察指标 值 组别(单位) 对照组 剂量 1 剂量 2 剂量 3 … … 起始交配对数(N) 发情周期(至少不规则周期的平均长度和频率) 有交配迹象的雌鼠数量 成功怀孕的雌鼠数量 交配第 1 天 ~第 5 天内受孕雌鼠数量 交配 6 天到交配最后一天受孕雌鼠数量 妊娠天数<21天的雌鼠数量 妊娠天数= 21天的雌鼠数量 妊娠天数 >21天的雌鼠数量 产下活仔的母鼠数量 活仔存活 4 天的雌鼠数量 母鼠的平均着床数 分娩时每只母鼠的平均活仔数 分娩 4 天后每只母鼠的平均活仔数 出生时仔鼠的平均性别比(雄性/雌性) 出生后第 4 天仔鼠的平均性别比(雄性/雌性) 出生时每窝仔鼠的平均体重 出生后第 4 天每窝仔鼠的平均体重 出生时仔鼠的平均体重 测量 AGD时雄性 、雌性平均体重 出生后第 4 天雄性 、雌性仔鼠平均 AGD 出生后第 4 天仔鼠的平均体重 出生后第 13天雄性仔鼠乳头保留数量 出生后第 13天仔鼠的平均体重

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　　表 B. 1 重复剂量毒性合并生殖发育毒性筛选试验结果汇总表 (续)

　　观察指标 值 组别(单位) 对照组 剂量 1 剂量 2 剂量 3 … 异常的仔鼠 未产下仔鼠的母鼠数量 产下 1 只仔鼠的母鼠数量 产下 ≥2只仔鼠的母鼠数量 子代的丢失 产前/着床后(着床减去活产) 没有吸收胎的母鼠数量 吸收胎为 1个的母鼠数量 吸收胎有 2个的母鼠数量 吸收胎 ≥3个的母鼠数量 产后(活产减去产后第 13天的活产) 出生后 13天仔鼠全部存活的雌鼠数量 出生后 13天仔鼠死亡 1 只的雌鼠数量 出生后 13天仔鼠死亡 2 只的雌鼠数量 出生后 13天死亡 ≥3只的雌鼠数量