GB/T 38172-2019 蛋白A亲和层析介质

　　ICS 07 . 080 A 2 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 38172—2019

　　蛋白 A 亲和层析介质

　　proteinA affinitychromatographicmedium

　　2019-10-18 发布 2019-10-18 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 38172—2019

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国标准化研究院提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限公司。

　　本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云、秦佳。

　　GB/T 38172—2019

　　蛋白 A 亲和层析介质

　　1 范围

　　本标准规定了蛋白 A 亲和层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存。

　　本标准适用于蛋白 A亲和层析介质的生产与检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　GB/T 5475 离子交换树脂取样方法

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　蛋白 A亲和层析介质 proteinA affinitychromatographicmedium

　　将重组蛋白 A偶联至琼脂糖分离介质上制备的一类层析介质。

　　4 技术要求

　　4 . 1 外观要求

　　蛋白 A 亲和层析介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。

　　4 . 2 性能要求

　　应符合表 1 中的规定。

　　表 1 蛋白 A 亲和层析介质的主要性能要求

　　GB/T 38172—2019

　　表 1(续)

　　5 检测方法

　　5 . 1 外观

　　5 . 1 . 1 样品处理

　　按照 GB/T 5475 直接从产品中抽取 5 mL样品，置于 50 mL G3 型号砂芯漏斗中抽干 5 min。 用符合 GB/T 6682 的三级水清洗 5 次，每次 2 min,最后用真空泵在 0 . 1 MPa压力下抽干 5 min。 将洗净的介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证介质上应有 2 cm 的三级水。 混匀后得到蛋白 A 亲和层析介质与水的混合体系。

　　5 . 1 . 2 样品观测

　　用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。 以视野里 80%以上面积均为蛋白A亲和层析介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的蛋白 A 亲和层析介质，最后用盖玻片压上。 调节光学显微镜焦距，使视野中的影像清晰。 拍摄蛋白 A亲和层析介质照片并保存。

　　5 . 2 粒径

　　5 . 2 . 1 样品处理

　　方法同 5 . 1 . 1 。

　　5 . 2 . 2 样品检测

　　设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样品进行测定。

　　5 . 2 . 3 结果计算

　　5 . 2 . 3 . 1 范围粒径比

　　按式(1)计算：

　　165

　　W粒径 W k …………………………( 1 )

　　式中：

　　W 粒径 —范围粒径比，% ;

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　　Wk —粒径为 k(μm)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，% 。

　　5 . 2 . 3 . 2 平均粒径

　　按式(2)计算：

　　n

　　…………………………( 2 )

　　式中：

　　-

　　d —所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米(μm) ;

　　dk —单个颗粒的粒径，单位为微米(μm) ;

　　N — 所统计的介质颗粒的数目。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　5 . 3 最高流速

　　5 . 3 . 1 样品处理

　　方法同 5 . 1 . 1 。

　　5 . 3 . 2 样品装柱

　　选用 φ1.60 cm×20.00 cm 的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出 口，静置，控制介质床层高度为 10 . 00 cm±0 . 20 cm,柱子上端充满水。 打开柱子入 口，以 0 . 5 mL/ min 的流速连续向柱中通入 10 个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

　　5 . 3 . 3 样品测定

　　将层析柱连入中低压层析系统。 测定时，从零开始设定一定流速 ℃x(mL/min),保持该流速 5 min后，记录此时柱压 px ( MPa) 。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。 直到压力达到 0 . 10 MPa 为止，此时对应流速记录为 ℃0.1 。

　　5 . 3 . 4 结果计算

　　按式(3)计算：

　　F …………………………( 3 )

　　式中：

　　Fmax —最高流速，单位为厘米每小时(cm/h) ;

　　℃0.1 —在 0 . 10 MPa压力下的体积流速，单位为毫升每分(mL/min) ;

　　S —层析柱截面积，单位为平方厘米(cm2 ) ;

　　60 — 分钟转化为小时的换算系数。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　5 . 4 配基密度

　　5 . 4 . 1 溶液配制

　　5.4. 1 . 1 20 g/L硼酸溶液

　　准确称取 20 . 00 g 硼酸于 250 mL烧杯中，加入三级水溶解后定容至 1 000 mL。

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　　5 . 4 . 1 . 2 甲基红-溴甲酚绿指示剂

　　准确称取 3 mg 甲基红，1 mg溴甲酚绿于 50 mL烧杯中，加入乙醇溶解后定容至 100 mL。

　　5 . 4 . 2 样品处理

　　按照方法 5 . 1 . 1 处理介质样品。

　　接着进行硝化处理，准确称取 1 . 00 g 样品，移入干燥的 100 mL 凯氏烧瓶中，加入 50 mg 硒粉和5 mL 浓硫酸。 置于电炉上加热。 先用小火慢慢加热 2 h至液体呈透明淡绿色，然后改用大火继续加热30 min, 当液体澄清透明后停止加热，并自然冷却至室温。

　　准确称量 10.0 mg 蛋白 A,溶于 1 mL 水中。同时配制 10.00 g/mL、6.00 mg/mL、3.00 mg/mL、

　　1 . 25 mg/mL 蛋白 A标准溶液，各取 1 mL进行硝化处理。

　　5 . 4 . 3 样品测定

　　准确称取 1 mL硝化后样品，移入干燥的 100 mL 凯氏定氮瓶中。 加入 10 mL 40%的氢氧化钠溶液，蒸汽浴进行反应。 用 25 mL 20 g/L硼酸溶液(加入 5 滴 ~6 滴甲基红-溴甲酚绿指示剂，浅紫色)收集馏出液，冷凝器的出液口浸于硼酸溶液液面以下。 硼酸溶液的体积达到 45 mL 时冷凝器的出液口离开液面，用去离子水冲洗冷凝器的出液口，至最终体积为 50 mL 时停止收集。 用 0 . 05 mol/ L 的盐酸标准溶液滴定上述硼酸溶液至灰色或蓝紫色为终点，并记录消耗盐酸标准溶液的体积。

　　建立蛋白 A质量-消耗盐酸体积标准曲线。

　　同时取 1 . 00 g 空白介质进行上述操作，做空白对照。

　　5 . 4 . 4 结果计算

　　按式(4)计算：

　　…………………………( 4 )

　　式中：

　　ρ —蛋白 A亲和层析介质配基密度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　m1 —蛋白 A 亲和层析介质上测定出的蛋白 A质量，单位为毫克(mg) ;

　　m0 —空白介质上测定出的蛋白 A质量，单位为毫克(mg) ;

　　m —蛋白 A亲和层析介质质量，单位为克(g) ;

　　1 . 4— 蛋白 A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　5 . 5 动态载量

　　5 . 5 . 1 溶液配制

　　5.5. 1 . 1 缓冲液 A，PH 7.0

　　准确称取 4 . 17 g 十二水合磷酸氢二钠，1 . 27 g 二水合磷酸二氢钠和 8 . 78 g NaCl 于 500 mL 烧杯中，加入三级水溶解后，调 pH 为 7 . 0,最后定容至 1 000 mL,用 0 . 45 μm 过滤膜进行过滤。

　　5.5. 1 .2 缓冲液 B，PH 3.0

　　准确称取 7 . 51 g甘氨酸，加入三级水溶解，调 pH 至 3 . 0,最后定容至 1 000 mL,用 0 . 45 μm 过滤膜进行过滤。

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　　5.5. 1 .3 h-IgG样品(纯度>98%)

　　用缓冲液 A将h-IgG蛋白稀释，使用分光光度计在 280 nm处进行测定。 最终浓度稀释至 3. 00 mg/mL。采用吸光系数[1 . 33 mL/(mg ·cm)]计算蛋白浓度。

　　5 . 5 . 2 样品处理

　　方法同 5 . 1 . 1 。

　　5 . 5 . 3 样品装柱

　　选用 φ1.60 cm×20.00 cm 的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出 口，静置，控制介质床层高度为 5 . 00 cm±0 . 20 cm,柱子上端充满水。 打开柱子入 口，以 2 . 0 mL/ min 的流速连续向柱中通入 10 个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

　　5 . 5 . 4 样品测定

　　将层析柱连在层析系统中，并检测 280 nm处紫外线(UV)信号，对载量测定过程进行监控。

　　动态结合载量用 10%穿透值表示。 测量并记录样品 h-IgG 的 100% UV信号，包括不结合到介质上的 IgG 亚 类 的 紫 外 吸 收。 用 缓 冲 液 A 以 2 . 0 mL/ min 的 流 速 平 衡 层 析 柱 至 紫 外 基 线 平 衡，以2 . 0 mL/ min 的流速上样，待流穿曲线中 h-IgG 的 UV信号浓度为 10%的样品浓度时上样结束，记录上样体积。 上样结束后用缓冲液 A 以 2 . 0 mL/ min 的流速平衡紫外信号至基线;用缓冲液 B 以 2 . 0 mL/ min的流速进行洗脱。 计算动态载量。

　　非保留条件下穿透体积测定：将层析柱连在层析系统中，并检测 280 nm 处 UV 信号，上样 10 μL 1%丙酮，记录出现 UV信号时的体积。

　　5 . 5 . 5 结果计算

　　按式(5)计算：

　　Q …………………………( 5 )

　　式中：

　　Q10% —动态载量，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　C0 —蛋白起始浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　犞1 —柱出口蛋白浓度 C 达到入口蛋白浓度 C0 的 10%时流出液体积，单位为毫升(mL) ;

　　犞0 —非保留条件下穿透体积，单位为毫升(mL) ;

　　犞gel —介质体积，单位为毫升(mL) 。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　5 . 6 菌落总数

　　5 . 6 . 1 样品前处理

　　方法同 5 . 1 . 1 。

　　5 . 6 . 2 样品测定

　　参照《中华人民共和国药典》(2015 年版)(1105) 非无菌产品微生物限度检查— 微生物计数法进行 。取 1 mL抽干介质，加入 1 mL三级水，采用涡旋混合器混匀样品。 将含有 30 mL胰蛋白陈大豆琼

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　　脂培养基的锥形瓶 121 ℃灭菌 20 min,放入 40 . 0 ℃恒温箱中，待培养基冷却到 40 . 0 ℃时，用微量移液器吸取 1 mL混匀后的样品加入该锥形瓶中，混匀，把混合物倒入培养皿中，盖好上盖。 在室温下使混合物凝固。 把培养皿置于恒温箱中 35 ℃孵育 5 d。

　　5 . 6 . 3 结果计算

　　孵育期后检查培养皿。 计数菌落形成单位数(CFU) 。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过 5 CFU/mL悬浮液。

　　5 . 7 5-羟甲基糠醛脱落量

　　5 . 7 . 1 溶液配制

　　5.7. 1 . 1 10%(体积分数)甲醇水溶液

　　准确量取 100 mL色谱纯无水甲醇，与 900 mL二级水混合均匀，再用 0 . 22 μm 孔径的滤膜过滤，超声除气泡。

　　5 . 7 . 1 . 2 5-羟甲基糠醛标准储备溶液

　　准确称取适量的 5-羟甲基糠醛标准物质于 100 mL容量瓶，用 10 mL 10%甲醇水溶液溶解，定容，配成 0 . 20 mg/mL 的标准储备液。

　　5.7. 1 .3 1 mmol/L盐酸溶液，PH 3.0

　　量取 0.083 mL 浓盐酸(12 mol/L)稀释定容为 1 000 mL,调节 pH 为 3.0。

　　5.7. 1 .4 100 mmol/L氢氧化钠溶液，PH 13.0

　　称取 4 . 00 g氢氧化钠固体，溶于 100 mL三级水中，待冷却至室温后用三级水定容为 1 000 mL,调节 pH 为 13.0。

　　5 . 7 . 1 . 5 标准工作溶液

　　分别吸取 5-羟甲基糠醛标准储备溶液 5 μL、15 μL、25 μL、40 μL、50 μL、100 μL、1 mL、2 mL 至 100 mL容量瓶 中，用 10% 甲 醇 水 溶 液 稀 释 至 刻 度，配 成 0. 01 μg/mL、0. 03 μg/mL、0. 05 μg/mL、 0.08 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL标准工作溶液。现配现用。

　　5 . 7 . 2 样品处理

　　清洗方法同 5 . 1 . 1 。 取若干份 1 . 00 g 抽干蛋白 A 亲和层析介质置于带盖玻璃试管内。 分别取10 mL pH 3 . 0、pH 13 . 0 的溶液置于各试管内，样品管在 40 . 0 ℃条件下培养。 7 d 后，将上层清液转移到干净的试管内。

　　上层清液经旋转蒸发(60 ℃ , 50 r/min),定容至 2 mL,加入等体积 12 mol/L盐酸，100 ℃水解 1 h。定容至 5 mL。 用 0 . 45 μm 的滤膜过滤，得到样品待测液。

　　5 . 7 . 3 样品测定

　　高效液相色谱条件：色谱柱选择 C18 , 5 μm, 250 mm×4 . 6 mm(内径)。流动相是 10%甲醇水溶液。流速 1.0 mL/min。检测波长 285 nm。柱温 30 ℃。进样量 10 μL。

　　以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测。 记录标准工作溶液的保留时间以及峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。 以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性，并

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　　记录下该保留时间处峰的面积，用标准工作曲线对样品进行定量。

　　5 . 7 . 4 结果计算

　　按式(6)计算：

　　犆犞

　　犡 …………………………( 6 )

　　式中：

　　犡 —每毫升介质中 5-羟甲基糠醛的脱落量，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　犆 —从工作曲线求得的试样溶液中 5-羟甲基糠醛的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　犞 —试样经盐酸水解后最终的定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　犿 —称取的蛋白 A亲和层析介质的质量，单位为克(g) ;

　　1 . 4— 蛋白 A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 检验规则

　　6 . 1 组批

　　同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批。

　　6 . 2 抽样

　　按 GB/T 5475 的规定进行。

　　6 . 3 出厂检验

　　每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。 出厂检验项目为第 4 章中规定的粒径、最高流速、配基密度、动态载量和菌落总数。

　　6 . 4 型式检验

　　6 . 4 . 1 正常生产时，每半年应进行一次型式检验，有下列情况之一时应进行型式检验：

　　a) 新产品试制鉴定时;

　　b ) 正常生产后，如原料、工艺、设备有较大变化，可能影响产品性能时;

　　c) 产品停产半年以上恢复生产时;

　　d) 出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时;

　　e) 监督机构提出要求时。

　　6 . 4 . 2 型式检验项目为第 4 章中规定的所有项 目 。

　　6 . 5 判定规则

　　6 . 5 . 1 出厂检验判定和复检

　　6 . 5 . 1 . 1 出厂检验项目符合 6 . 3 中项目要求，判定本批为合格品。

　　6 . 5 . 1 . 2 出厂检验项 目 1~2 项不符合要求，应复检，复检后如仍有 1 项不符合要求，则判定该批为不合格品。

　　6 . 5 . 1 . 3 出厂检验项目超过 2 项不符合要求，判定该批产品为不合格品。

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　　6 . 5 . 2 型式检验判定和复检

　　6 . 5 . 2 . 1 型式检验项目符合 6 . 4 中项目要求，判为合格品。

　　6 . 5 . 2 . 2 型式检验项目 1~3 项(含 3 项)不符合要求，应复检，复检后如仍有 1 项不符合要求，则判定该批为不合格品。

　　6 . 5 . 2 . 3 型式检验项目超过 3 项不符合要求，判定该批产品为不合格品。

　　7 标签、标志、包装、运输和贮存

　　7 . 1 标签

　　应至少包括以下内容：

　　a) 产品名称;

　　b ) 型号 ;

　　c) 体积 ;

　　d) 生产批号;

　　e) 生产组织;

　　f) 生产日期;

　　g) 有效期;

　　h) 注意事项。

　　7 . 2 标志

　　包装储运标识应符合 GB/T 191 的规定。

　　7 . 3 包装

　　宜选用塑料瓶包装，包装材料应确保产品在运输、贮存时不被污染和泄漏。

　　7 . 4 运输

　　应在常温环境下运输，避免过冷或过热，且采取措施防止产品失水。

　　7 . 5 贮存

　　应在 4 ℃ ~8 ℃环境下贮存，有效期为五年，超过有效期可按本标准规定进行复验，若复验结果符合标准要求，仍可使用。