GB/T 38170-2019 琼脂糖分离介质

　　ICS 07 . 080 A 2 1

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 38170—2019

　　琼脂糖分离介质

　　Agarose-basedchromatographicmedium

　　2019-10-18 发布 2019-10-18 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 38170—2019

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由中国标准化研究院提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限公司。

　　本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云。

　　GB/T 38170—2019

　　琼脂糖分离介质

　　1 范围

　　本标准规定了琼脂糖分离介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存。

　　本标准适用于琼脂糖分离介质的生产与检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 191 包装储运图示标志

　　GB/T 5475 离子交换树脂取样方法

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　琼脂糖分离介质 agarose-basedchromatographicmedium

　　以琼脂糖为主要原料制备的一类球形分离介质。

　　3.2

　　非特异性吸附量 amountofnon-specificadsorption

　　琼脂糖分离介质对细胞色素 C 的吸附量。

　　4 分类

　　按琼脂糖含量分为 4%琼脂糖分离介质和 6%琼脂糖分离介质。

　　5 技术要求

　　5 . 1 外观要求

　　琼脂糖分离介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。

　　5 . 2 性能要求

　　应符合表 1 中的规定。

　　GB/T 38170—2019

　　表 1 琼脂糖分离介质的主要性能要求

　　6 检测方法

　　6 . 1 外观

　　6 . 1 . 1 样品处理

　　按照 GB/T 5475 直接从产品中抽取 5 mL样品，置于 50 mL G3 型号砂芯漏斗中抽干 5 min。用符合 GB/T 6682 的三级水清洗 5 次，每次 2 min,最后用真空泵在 0.1 MPa压力下抽干 5 min。将洗净的琼脂糖分离介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证琼脂糖分离介质上应有 2 cm 的三级水。混匀后

　　得到琼脂糖分离介质与水的混合体系。

　　6 . 1 . 2 样品观测

　　用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。以视野里 80%以上面积均为琼脂

　　糖分离介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的琼脂糖分离介质，最后用盖玻片压上。 调节光学显微镜焦距，使视野中的影像清晰。 拍摄琼脂糖分离介质照片并保存。

　　6 . 2 粒径

　　6 . 2 . 1 样品处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

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　　6 . 2 . 2 样品检测

　　设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样品进行测定。

　　6 . 2 . 3 结果计算

　　6 . 2 . 3 . 1 范围粒径比

　　按式(1)计算：

　　n

　　W粒径 W k …………………………( 1 )

　　式中：

　　W粒径 — 范围粒径比，% ;

　　Wk — 粒径为 k(μm)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，% ;

　　n — 试样颗粒粒径在 45.0 μm~165.0 μm 范围内，n=165;试样颗粒粒径在 24.0 μm~44.0 μm范围内，n=44 ;

　　i — 试样颗粒粒径在 45.0 μm~165.0 μm 范围内，i=45;试样颗粒粒径在 24.0 μm~44.0 μm范围内，i= 24 。

　　6 . 2 . 3 . 2 平均粒径

　　平均粒径按式(2)计算：

　　n

　　…………………………( 2 )

　　式中：

　　-

　　d — 所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米(μm) ;

　　dk — 单个颗粒的粒径，单位为微米(μm) ;

　　N — 所统计的介质颗粒的数目。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 . 3 最高流速

　　6 . 3 . 1 样品处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

　　6 . 3 . 2 样品装柱

　　选用 φ1.60 cm×20.00 cm 的层析柱，堵住柱子出 口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为 10.00 cm±0.20 cm,柱子上端充满水。打开柱子入 口，以 0.5 mL/min 的流速连

　　续向柱中通入 10 个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

　　6 . 3 . 3 样品测定

　　将层析柱连入中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速 vx(mL/min) ,保持该流速 5 min后，记录此时柱压 px (MPa)。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。直到压力达到 0. 10 MPa 为止，此时对应流速记录为 v0.1 。

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　　6 . 3 . 4 结果计算

　　最高流速按式(3)计算：

　　F …………………………( 3 )

　　式中：

　　Fmax — 最高流速，单位为厘米每小时(cm/h) ;

　　℃0.1 — 在 0.10 MPa压力下的体积流速，单位为毫升每分(mL/min) ;

　　S — 层析柱截面积，单位为平方厘米(cm2 ) ;

　　60 — 分钟转化为小时的换算系数。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 . 4 固含量

　　6 . 4 . 1 样品处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

　　6 . 4 . 2 样品称量

　　将 5 mL琼脂糖分离介质与水的混合体系装入带 10 μm 孔径筛板的离心柱内，置于离心机，在2 000 r/min 下离心 5 min。取出离心管，将样品小心倒入称量瓶内，盖严。在已恒重的两个称量瓶中分别称入 1.0 g 上述分离介质精确至 0.1 mg。

　　6 . 4 . 3 样品烘干称量

　　将称量瓶开盖置于烘箱中，于 105. 0 ℃ 干燥至恒重。将称量瓶盖严，取出置于干燥器内，冷却30 min 至室温，称量。

　　6 . 4 . 4 结果计算

　　固含量按式(4)计算：

　　W …………………………( 4 )

　　式中：

　　W — 固含量，% ;

　　m1 — 干燥前称量瓶加试样质量，单位为克(g) ;

　　m2 — 干燥后称量瓶加试样质量，单位为克(g) ;

　　m0 — 称量瓶质量，单位为克(g)。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 . 5 分配系数 kav

　　6 . 5 . 1 溶液配制

　　6 . 5 . 1 . 1 1%(体积分数)丙酮溶液

　　准确量取 0 .1 mL丙酮，加水混合，定容至 10 mL。

　　6.5. 1 .2 2 mg/mL葡聚糖溶液

　　准确称取 2 mg 葡聚糖，加水混合，定容至 1 mL。

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　　6.5. 1 .3 缓冲液，PH 7.0

　　准确称取 10.93 g 十二水合磷酸氢二钠、3.04 g二水合磷酸二氢钠和 8.76 g NaCl,加水溶解，调 pH为 7 . 0,最后定容至 1 000 mL。

　　6 . 5 . 2 样品处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

　　6 . 5 . 3 样品装柱

　　选用 φ1.00 cm×30.00 cm 的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出 口，静置，控制介质床层高度为 30.00 cm±0.20 cm。打开柱子出入口，以一定流速连续向柱中通入 10 个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。对于 90 μm 介质，流速为 9.0 mL/min,对于 34 μm 介质，流速为

　　6 . 0 mL/ min。

　　6 . 5 . 4 样品测定

　　用缓冲液以 1.0 mL/min 的流速平衡层析柱至示差检测器信号基线平衡。上样 1%丙酮溶液测定丙酮的洗脱体积犞i ,上样相对分子质量 Mp =2 000 000 葡聚糖测定洗脱体积犞o 。再将不同相对分子质量的葡聚糖单独上样：对于 4%琼脂糖分离介质依次是葡聚糖 Mp =200 000,葡聚糖 Mp = 100 000,葡聚糖 Mp =20 000;对于 6%琼脂糖分离介质依次是葡聚糖 Mp = 200 000,葡聚糖 Mp = 50 000,葡聚糖 Mp = 10 000。所有葡聚糖样品浓度为 2.0 mg/mL。上样量均为 200 μL。

　　6 . 5 . 5 结果计算

　　分配系数 Kav 按式( 5 ) 计算：

　　K …………………………( 5 )

　　式中：

　　犞e — 各样品的洗脱体积，单位为毫升(mL) ;

　　犞i — 丙酮的洗脱体积，单位为毫升(mL) ;

　　犞o — 相对分子质量 Mp =2 000 000 葡聚糖洗脱体积，单位为毫升(mL)。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 . 6 非特异性吸附量

　　6 . 6 . 1 溶液配制

　　6.6. 1 . 1 缓冲液 A，PH 7.0

　　准确称取 4.37 g Na2 HPO4 ·12H2 O 和 1.22 g NaH2 PO4 ·2H2 O,加三级水溶解，调 pH 为 7.0,最后定容至 1 000 mL,用 0.45 μm 过滤膜进行过滤。

　　6.6. 1 .2 缓冲液 B，PH 7.0

　　准确称取 4.37 g Na2 HPO4 ·12H2 O 和 1.22 g NaH2 PO4 ·2H2 O 和 8.76 g NaCl,加三级水溶解，调 pH 为 7.0,最后定容至 1 000 mL,用 0.45 μm 过滤膜进行过滤。

　　6.6. 1 .3 2.0 mg/mL细胞色素 C溶液

　　准确称取 200.0 mg细胞色素 C于 100 mL容量瓶，用 10 mL缓冲液 A溶解，定容，配成 2.0 mg/mL 的

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　　标准储备液。上样前用 0.45 μm 过滤膜进行过滤。

　　6 .6 . 1 .4 细胞色素 C 标准工作溶液

　　分别取 0.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、12.50 mL、25.00 mL、40.00 mL 细胞色素 C 标准储备溶液至 100 mL 容量瓶中，用缓冲液 A 溶液稀释至刻度，配成 0. 00 mg/mL、0. 05 mg/mL、0. 10 mg/mL、 0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL标准工作溶液。

　　6 . 6 . 2 样品处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

　　6 . 6 . 3 样品装柱

　　选用 φ1.60 cm×20.00 cm 的层析柱，堵住柱子出 口，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，静置，控制介质床层高度为 5.00 cm±0.20 cm。打开柱子入口，以 1.0 mL/min 的流速连续向柱中通入 10 个

　　柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。

　　6 . 6 . 4 样品测定

　　以缓冲液 A平衡，流速为 2.0 mL/min,蛋白上样 5 mL。经缓冲液 A淋洗至淋洗液没有蛋白出现，再经缓冲液 B洗脱，收集对应洗脱峰。记录洗脱峰体积 VE(mL)。用紫外分光光度计检测标准工作溶液和洗脱峰在 280 nm 处的吸光度 A280 ,以标准工作溶液的吸光度与蛋白浓度做标准曲线，通过标准曲

　　线定量洗脱峰蛋白浓度。

　　6 . 6 . 5 结果计算

　　非特异性吸附量按式(6)计算：

　　W …………………………( 6 )

　　式中：

　　WN — 非特异性吸附量，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　CE — 洗脱峰蛋白浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ,由标准曲线计算出;

　　VE — 洗脱峰体积，单位为毫升(mL) ;

　　Vgel — 琼脂糖分离介质的体积，单位为毫升(mL)。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　6 . 7 菌落总数

　　6 . 7 . 1 样品前处理

　　方法同 6 . 1 . 1 。

　　6 . 7 . 2 样品测定

　　参照《中华人民共和国药典》(2015 年版)(1105)非无菌产品微生物限度检查— 微生物计数法进

　　行。取 1 mL抽干介质，加入 1 mL 三级水，采用涡旋混合器混匀样品。将含有 30 mL胰蛋白胨大豆琼脂培养基的锥形瓶 121.0 ℃灭菌 20 min,放入 40.0 ℃恒温箱中，待培养基冷却到 40.0 ℃时，用微量移液器吸取 1 mL混匀后的样品加入到该锥形瓶中，混匀，把混合物倒入培养皿中，盖好上盖。在室温下使混合物凝固。把培养皿置于恒温箱中 35 .0 ℃孵育 5 d。

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　　6 . 7 . 3 结果计算

　　孵育期后检查培养皿，计数菌落形成单位数(CFU) 。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过 5 CFU/mL悬浮液。

　　6 . 8 5-羟甲基糠醛脱落量

　　6 . 8 . 1 溶液配制

　　6 . 8 . 1 . 1 10%(体积分数)甲醇水溶液

　　准确量取 100 mL 色谱纯无水甲醇，与 900 mL二级水混合均匀，再用 0.22 μm 孔径的滤膜过滤，超

　　声除气泡。

　　6 . 8 . 1 . 2 5-羟甲基糠醛标准储备溶液

　　称取 20.0 mg 5-羟甲基糠醛标准物质于 100 mL 容量瓶，用 10 mL 10%甲醇水溶液溶解，定容，配成 0.20 mg/mL 的标准储备液。

　　6.8. 1 .3 1 mmol/L盐酸溶液，PH 3.0

　　量取 0.083 mL 浓盐酸(12 mol/L)稀释定容为 1 000 mL,调节 pH 为 3.0。

　　6.8. 1 .4 100 mmol/L氢氧化钠溶液，PH 13.0

　　称取 4.00 g 氢氧化钠固体，溶于 100 mL 三级水中，待冷却至室温后用三级水定容为 1 000 mL,调节 pH 为 13.0。

　　6 . 8 . 1 . 5 标准工作溶液

　　分别吸取 5-羟甲基糠醛标准储备溶液 5 μL、15 μL、25 μL、40 μL、50 μL、100 μL、1 mL、2 mL 至 100 mL容量瓶中，用 10% 甲醇水溶液稀释至刻度，配成 0. 01 μg/mL、0. 03 μg/mL、0. 05 μg/mL、 0.08 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL标准工作溶液。现配现用。

　　6 . 8 . 2 样品处理

　　清洗方法同 6. 1. 1。然后取若干份 1. 00 g 抽干琼脂糖分离介质置于带盖玻璃试管内。分别取10 mL pH 3.0、pH 13.0 的溶液置于各试管内，样品管在 40.0 ℃条件下培养。7 d 后，将上层清液转移

　　到干净的试管内。

　　上层清液经旋转蒸发(60.0 ℃ , 50 r/min) ,定容至 2 mL,加入等体积 12 mol/L 盐酸，100.0 ℃水解1 h。定容至 5 mL。用 0.45 μm 的滤膜过滤，得到样品待测液。

　　6 . 8 . 3 样品测定

　　高效液相色谱条件：色谱柱选择 C18 , 5 μm, 250 mm× 4.6 mm(内径);流动相是 10%甲醇水溶液;流速 1.0 mL/min;检测波长 285 nm;柱温 30.0 ℃;进样量 10 μL。

　　以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测。 记录标准工作溶液的保留时间以及峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。 以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性，并记录下该保留时间处峰的面积，用标准工作曲线对样品进行定量。

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　　6 . 8 . 4 结果计算

　　5-羟甲基糠醛脱落量按式(7)计算：

　　犆犞

　　犡 …………………………( 7 )

　　式中：

　　犡 — 介质中 5-羟甲基糠醛的脱落量，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　犆 — 从工作曲线求得的试样溶液中 5-羟甲基糠醛的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL) ;

　　犞 — 试样经盐酸水解后最终的定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　犿 — 称取的琼脂糖分离介质的质量，单位为克(g) ;

　　1 . 4 — 琼脂糖分离介质质量转化为体积的换算系数。

　　在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

　　7 检验规则

　　7 . 1 组批

　　同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批。

　　7 . 2 抽样

　　按 GB/T 5475 的规定进行。

　　7 . 3 出厂检验

　　每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。 出厂检验项目为第 5 章中规定的粒径、最高流速、分配系数和菌落总数。

　　7 . 4 型式检验

　　7 . 4 . 1 正常生产时，每半年应进行一次型式检验，有下列情况之一时应进行型式检验：

　　a) 新产品试制鉴定时;

　　b) 正常生产后，如原料、工艺、设备有较大变化，可能影响产品性能时;

　　c) 产品停产半年以上恢复生产时;

　　d) 出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时;

　　e) 监督机构提出要求时。

　　7 . 4 . 2 型式检验项目为第 5 章中规定的所有项 目 。

　　7 . 5 判定规则

　　7 . 5 . 1 出厂检验判定和复检

　　7 . 5 . 1 . 1 出厂检验项目符合 7 . 3 中项目要求，判定本批为合格品。

　　7.5. 1 .2 出厂检验项 目 1~2 项不符合要求，应复检，复检后如仍有 1 项不符合要求，则判定该批为不合格品。

　　7 . 5 . 1 . 3 出厂检验项 目超过 2 项不符合要求，判定该批产品为不合格品。

　　7 . 5 . 2 型式检验判定和复检

　　7 . 5 . 2 . 1 型式检验项目符合 7 . 4 中项目要求，判为合格品。

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　　7.5.2.2 型式检验项 目 1~3 项(含 3 项)不符合要求，应复检，复检后如仍有 1 项不符合要求，则判定该

　　批为不合格品。

　　7 . 5 . 2 . 3 型式检验项 目超过 3 项不符合要求，判定该批产品为不合格品。

　　8 标签、标志、包装、运输和贮存

　　8 . 1 标签

　　应至少包括以下内容：

　　a) 产品名称;

　　b ) 型号 ;

　　c) 体积;

　　d) 生产批号;

　　e) 生产组织;

　　f) 生产 日期;

　　g) 有效期;

　　h ) 注意事项。

　　8 . 2 标志

　　包装储运标识应符合 GB/T 191 的规定。

　　8 . 3 包装

　　宜选用塑料瓶包装，包装材料应确保产品在运输、贮存时不被污染和泄漏。

　　8 . 4 运输

　　应在常温环境下运输，避免过冷或过热，且采取措施防止产品失水。

　　8 . 5 贮存

　　应在 4 ℃ ~8 ℃环境下贮存，有效期为五年，超过有效期可按本标准规定进行复验，若复验结果符

　　合标准要求，仍可使用。