GB/T 40348-2021 植物源产品中辣椒素类物质的测定 液相色谱-质谱+质谱法

　　ICS 07 . 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40348—2021

　　植物源产品中辣椒素类物质的测定

　　液相色谱-质谱/质谱法

　　Determinationofcapsaicinoidinplantderivedproducts—

　　Liquidchromatography-tandem massspectrometry

　　2021-08-20 发布 2022-03-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40348—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、四川大学、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳市计量质量检测研究院、上海市计量测试技术研究院、中国计量大学、四川赛纳斯分析检测有限公司、甘肃省商业科技研究所有限公司。

　　本文件主要起草人：冯德建、吴微、李怀平、李延芳、叶子弘、蓝雄、田伟、孟娇然、孙羽婕、刘琦、叶善蓉、周李华、黎燕玲、段嫚雷、张雅芬、马丽侠、刘海龙、夏文强、朱雨田、张剑、高志莹、钱滢文。

　　GB/T 40348—202 1

　　植物源产品中辣椒素类物质的测定

　　液相色谱-质谱/质谱法

　　1 范围

　　本文件规定了植物源产品中辣椒素类物质含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。

　　本文件适用于辣椒及其制品中 N-壬酸香草酰胺、辣椒素和二氢辣椒素含量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　辣椒素类物质 capsaicinoid

　　在辣椒果实中产生辣味的 N-香草基酰胺类生物碱物质的统称。

　　注：其中辣椒素、二氢辣椒素两种物质的含量约占辣椒素类物质总量的 90%,是影响辣度最主要的成分。

　　[来源：GB/T 21266—2007,3 . 3,有修改]

　　4 原理

　　试样用甲醇超声提取，提取液经过滤后进样，反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱仪测定，采用外标法定量。

　　5 试剂或材料

　　5 . 1 试剂

　　除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。

　　5. 1 . 1 无水硫酸钠(Na2 SO4)。

　　5 . 1 . 2 甲酸(CHOOH)：色谱纯。

　　5 . 1 . 3 甲醇(CH 3 OH)：色谱纯 。

　　5 . 2 标准品

　　5.2. 1 N-壬酸香草酰胺标准品：纯度 ≥98%;分子式：C17 H27 NO3 ;CAS号：2444-46-4。

　　5.2.2 辣椒素标准品：纯度 ≥99%;分子式：C18 H27 NO3 ;CAS号：404-86-4。

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　　5.2.3 二氢辣椒素标准品：纯度 ≥98%;分子式：C18 H29 NO3 ;CAS号：19408-84-5。

　　5 . 3 标准溶液

　　5 . 3 . 1 单一标准储备液：分别准确称取 N-壬酸香草酰胺、辣椒素、二氢辣椒素标准品适量(精确至0 . 1 mg),用甲醇溶解并配制成质量浓度均为 100 mg/L 的辣椒素类物质单一标准储备液，于 4 ℃下避光保存备用，有效期为 2 个月。

　　5 . 3 . 2 混合标准溶液 Ⅰ：分别准确移取适量各辣椒素类物质单一标准储备液，用甲醇稀释配制成 N-壬酸香草酰胺质量浓度为 0 . 100 mg/L, 辣椒素和二氢辣椒素质量浓度均为 1 . 00 mg/L 的混合标准溶液 Ⅰ ,现配现用。

　　5 . 3 . 3 混合标准溶液 Ⅱ：分别准确移取适量各辣椒素类物质单一标准储备液，用甲醇稀释配制成 N-壬酸香草酰胺质量浓度为 0 . 100 mg/L, 辣椒素和二氢辣椒素质量浓度均为 10 . 0 mg/L 的混合标准溶液 Ⅱ ,现配现用。

　　5 . 3 . 4 低浓度混合标准工作溶液：分别准确移取适量混合标准溶液 Ⅰ ,用甲醇稀释配制成 N-壬酸香草酰胺 质 量 浓 度 为 1. 50 ng/mL、3. 00 ng/mL、5. 00 ng/mL、10. 0 ng/mL、15. 0 ng/mL、20. 0 ng/mL、 30.0 ng/mL,辣椒素和二氢辣椒素质量浓度均为 15.0 ng/mL、30.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL、 150 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL 的低浓度混合标准工作溶液，现配现用。

　　5 . 3 . 5 高浓度混合标准工作溶液：分别准确移取适量混合标准溶液 Ⅱ ,用甲醇稀释配制成 N-壬酸香草酰胺 质 量 浓 度 为 1. 50 ng/mL、3. 00 ng/mL、5. 00 ng/mL、10. 0 ng/mL、15. 0 ng/mL、20. 0 ng/mL、 30.0 ng/mL,辣椒素和二氢辣椒素质量浓度均为 150 ng/mL、300 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、 1 500 ng/mL、2 000 ng/mL、3 000 ng/mL 的高浓度混合标准工作溶液，现配现用。

　　5 . 4 材料

　　0 . 22 μm 尼龙滤膜。

　　6 仪器设备

　　6 . 1 液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源(ESI 源)。

　　6.2 分析天平：感量 0.01 mg 和 0.000 1 g。

　　6 . 3 离心机：转速不低于 8 000 g。

　　6.4 超声波发生器：功率 250 W,工作频率 40 kHz,温度可调 20 ℃ ~80 ℃。

　　6 . 5 涡旋混匀器。

　　6 . 6 组织捣碎机。

　　6 . 7 电动粉碎机。

　　7 样品

　　7 . 1 鲜辣椒、辣椒酱及半固态辣椒制品

　　取鲜辣椒(辣椒酱或半固态辣椒制品)约 1 kg,用组织捣碎机制成匀浆，混匀，制备好的试样均分成两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标识，现制现用。

　　7 . 2 干辣椒、辣椒粉及固态辣椒制品

　　取干辣椒(辣椒粉或固态辣椒制品)约 250 g,用电动粉碎机粉碎过 425 μm(40 目)筛，制备好的试样均分成两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标识，于 0 ℃ ~4 ℃保存。

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　　7 . 3 辣椒油等油状样品

　　取辣椒油等油状样品约 250 g,用组织捣碎机均质，制备好的试样均分成两份，装入洁净的盛样容器内，密封并标识，现制现用。

　　8 试验步骤

　　8 . 1 试样处理

　　8 . 1 . 1 鲜辣椒、辣椒酱及半固态辣椒制品

　　称取试样 10 g(精确至 0 . 001 g)于 50 mL具塞离心管中，加入 3 . 0 g无水硫酸钠和 30 mL 甲醇，涡旋混匀，于 60 ℃水浴下超声提取 15 min,然后在 8 000 g 下离心 5 min,将上清液转移至 100 mL 容量瓶中。 残渣用甲醇重复提取两次，每次 30 mL,合并三次提取液，用甲醇定容，摇匀，准确移取 1 . 0 mL 至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，过 0 . 22 μm 尼龙滤膜，待测。

　　8 . 1 . 2 干辣椒、辣椒粉、固态辣椒制品及辣椒油等油状样品

　　称取试样 2 g(精确至 0 . 001 g)于 50 mL具塞离心管中，加入 30 mL 甲醇，涡旋混匀，以后同 8 . 1 . 1 “于 60 ℃水浴下超声提取 15 min,……,待测”操作。

　　8 . 2 测定

　　8 . 2 . 1 液相色谱参考条件

　　液相色谱参考条件如下：

　　a) 色谱柱：C18 色谱柱，2.1 mm×100 mm,粒径 1.8 μm 或性能相当者;

　　b ) 流动相：A 为 0 . 1%甲酸溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序参见表 1 ;

　　c) 流量：0.2 mL/min;

　　d) 柱温：40 ℃ ;

　　e) 进样量：2 μL。

　　表 1 流动相梯度洗脱程序

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　　8 . 2 . 2 质谱参考条件

　　质谱参考条件如下：

　　a) 离子源：电喷雾离子源(ESI 源);

　　b ) 扫描方式：正离子模式;

　　c) 其他质谱参考条件参见附录 A。

　　8 . 2 . 3 定性测定

　　在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物的色谱峰保留时间和标准工作溶液中对应峰的保留时间一致(相对误差在 ±2 . 5%以内)，且样品谱图中待测物监测离子的相对丰度和浓度相当的标准品的相对丰度一致，允许偏差不超过表 2 规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。

　　表 2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

　　8 . 2 . 4 定量测定

　　在相同实验条件下，依据样品中各辣椒素类物质的含量选择合适质量浓度范围的标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析，以待测物的定量离子峰面积为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中各待测物的质量浓度在标准工作曲线质量浓度范围内，超过标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样分析。 在 8 . 2 . 1 和 8 . 2 . 2 条件下，各辣椒素类物质的参考保留时间参见附录 A 中表 A. 1,总离子流图及多反应监测图分别参见附录 B 中图 B. 1

　　和图 B.2~图 B.4。

　　8 . 3 平行试验

　　按 8 . 1 和 8 . 2 的规定对同一试样进行两次平行测定。

　　9 试验数据处理

　　试样中待测物质含量按照式(1)计算：

　　w …………………………( 1 )

　　式中：

　　w —试样中待测物质的含量，单位为毫克每千克(mg/kg) ;

　　ρ — 由标准工作曲线得到的待测物质质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ;

　　犞 —试样定容体积，单位为毫升(mL) ;

　　f —试样溶液稀释倍数;

　　m —试样称样量，单位为克(g) ;

　　计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

　　10 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。

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　　1 1 其他

　　本方法测定 N-壬酸香草酰胺、辣椒素和二氢辣椒素的检出限和定量限参见表 3 。

　　表 3 三种辣椒素类物质的检出限和定量限

　　单位为毫克每千克

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　质谱参数参考条件

　　质谱参考条件如下：

　　a) 扫描方式：正离子模式;

　　b ) 检测方式：多反应监测(MRM) ;

　　c) 干燥气温度：350 ℃ ;

　　d) 雾化气压力：207 kPa(30 psi) ;

　　e) 干燥气流量：9 L/ min;

　　f) 毛细管电压：4 000 V ;

　　g) 定性离子对、定量离子对、碰撞能量、源内碎裂电压参见表 A. 1 。

　　表 A.1 三种辣椒素类物质的参考保留时间、监测离子对、源内碎裂电压和碰撞能量

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　三种辣椒素类物质的 LC-MS/MS总离子流图和多反应监测图

　　B.1 三种辣椒素类物质的 LC-MS/MS 总离子流图见图 B. 1 。

　　标引序号说明：

　　1 —N-壬酸香草酰胺;

　　2 — 辣椒素;

　　3 — 二氢辣椒素。

　　图 B.1 三种辣椒素的总离子流图

　　B.2 三种辣椒素类物质的 LC-MS/MS 多反应监测图见图 B. 2~图 B. 4 。

　　图 B.2 N-壬酸香草酰胺的

　　MRM 图

　　图 B.3 辣椒素的 MRM 图

　　图 B.4 二氢辣椒素的 MRM 图

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　　参 考 文 献

　　[1] GB/T 21266—2017 辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法