GB/T 40193-2021 长芒苋检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40193—2021

　　长芒苋检疫鉴定方法

　　DetectionandidentificationofAmaranthuspalmeriS.watson

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

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　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国银川海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国无锡海关、中国环境科学研究院。

　　本文件主要起草人：徐晗、胡诗瑶、武扬、黄英、吴品珊、邵秀玲、徐瑛、孙昱昱、刘勇波。

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　　长芒苋检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了长芒苋的形态学和 ITS序列检疫鉴定方法。

　　本文件适用于长芒苋的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 19489—2008 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27402—2008 实验室质量控制规范 植物检疫

　　3 术语、定义和缩略语

　　3 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 . 1 . 1

　　雌雄异株 dioecious

　　在具有单性花的种子植物中，雄花和雌花分别在不同的植株上。

　　注：单性花是一朵花中只有雄蕊或只有雌蕊的花，与两性花相对。

　　3.1.2

　　胞果 utricle

　　果皮薄，含 1 枚种子，呈膀胱状膨胀的小的果实。

　　3.1.3

　　苞片 bract

　　在花或花序基部的退化的叶或叶状结构。

　　3.1.4

　　花被片 tepal

　　花冠和花萼的合称。

　　注：苋属植物的花无花冠和花萼之分。

　　3 . 2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)

　　ITS：核糖体 DNA 内转录间隔区 1 和内转录间隔区 2,以及 5.8S 核糖体基因(internal transcribed spacers 1 and 2 and the intervening 5.8S ribosomal gene)

　　m：中着丝粒染色体(metacentric chromosome)

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　　PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　sm：亚中着丝粒染色体(submetacentric chromosome)

　　st：近端着丝粒染色体(subtelocentric chromosome)

　　TAE: Tris-乙酸电泳缓冲液(Tris acetate-EDTA buffer)

　　t：端着丝粒染色体(telocentric chromosome)

　　4 长芒苋分类信息

　　4 . 1 分类信息

　　学名：AmaranthuspalmeriS.Watson

　　中文名：长芒苋

　　分类地位：植物界(Plantae), 被子植物门(Angiospermae), 双子叶植物纲(Magnoliopsida) ,石竹 目 (Caryophyllales), 苋 科 ( Amaranthaceae Jussieu), 苋 属(Amaranthus L.), 异 株 苋 亚 属[Amaranthus subgen.Acnida (L.) Aellen ex K.R.Robertson]。其他基本信息见附录 A。

　　4 . 2 基本分类特征

　　4 . 2 . 1 整体形状：

　　— 斜升(inclined) ：茎或其分枝等以平缓的角度上升。

　　— 匍匐(creeping)：茎及其分枝延地表或紧靠地面生长。

　　— 卵形(ovate) ：叶、苞片、花被片等最宽的部位处于底部的 2/5 区域。

　　— 披针形(lanceolate)：长宽比在 3 ∶ 1 到 10 ∶ 1 之间的卵形叶。

　　— 倒卵形(obovate) ：叶、苞片、花被片等最宽的部位处于顶部的 2/5 区域。

　　— 倒披针形(oblanceolate)：长宽比在 3 ∶ 1 到 10 ∶ 1 之间的倒卵形叶。

　　— 椭圆形(elliptic) ：叶、苞片、花被片等最宽的部位处于中间的 1/5 区域。

　　— 长圆形(oblong) ：在叶、苞片、花被片等中间的 1/3 区域内，两条边缘近似平行。

　　— 线形(linear) ：长宽比大于或等于 10 ∶ 1 。

　　— 匙形(spatulate) ：先端圆形，向基部渐变细。

　　— 双凸透镜状(lenticular) ：种子侧面观，两面为凸起状。

　　4 . 2 . 2 边缘形状：

　　— 全缘(entire) ：无齿、缺刻或裂片。

　　— 皱波状的(crispate) ：弯曲、波状或皱褶状。

　　— 外卷的(revolute) ：先端向外反折或外翘。

　　4 . 2 . 3 顶端形状：

　　— 急尖(acute)：整个叶、苞片、花被片等靠近顶点的 3/4 区域的边缘不明显弯曲。

　　— 圆形(rounded) ：顶端边缘呈圆弧状。

　　— 渐尖(acuminate) ：顶端突然向上凸起伸出变细、变尖。

　　— 钝形(obtuse) ：两边缘在顶点处夹角介于 90°至 180°之间。

　　— 微缺(emarginate)：顶端向下呈浅凹形，下凹面积介于整个叶、苞片、花被片等靠近顶端面积的5%至 25%。

　　— 微凹(retuse)：顶端下凹，下凹面积不超过整个叶、苞片、花被片等靠近顶端面积的 5%。

　　— 小短尖(mucro)：中脉末端有一个不透明、钉状、不脱落的小短尖头。

　　— 刺状(spine) ：从表皮下发出的尖细且硬的结构，为变态的叶或托叶，貌似真刺。

　　— 芒 (aristate) ：中脉从先端伸出成芒刺状的结构。

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　　— 钻状(subulate)：锥形或锥钻状结构。

　　4 . 2 . 4 基部形状：

　　— 楔形(cuneate)：从基部发出的两个边缘近似直线。

　　— 下延(decurrent)：叶片基部沿叶柄逐渐变狭、向下延伸。

　　4 . 2 . 5 表面特征：

　　— 变无毛的(glabrescent)：从被毛到逐渐光滑。

　　— 皱纹(rugose)：皱缩的。

　　— 短柔毛(pubescent)：具短且柔软的毛。

　　— 腺毛(piloglandulose)：具分泌腺体的毛。

　　— 纵肋(rib)：从叶、花被片、苞片、胞果等结构表面隆起的纵向主脉。

　　— 洼点(punctate)：种子表面的小洼点。

　　4 . 2 . 6 质地：

　　— 肉质(succulent)：组织较厚，柔软。

　　— 革质(coriaceous)：具有皮革般的质地。

　　4 . 2 . 7 花序形状：

　　— 圆锥状(panicle)：花自基部向上依次成熟、具分枝的总状花序。

　　— 俯垂(drooping)：总花序轴直立，先端较柔软，易下垂。

　　— 念珠状(moniliform)：整个穗状花序以规则的间隔缢缩，形似串珠。

　　5 方法原理

　　植株、花序、花、胞果和种子等形态特征是鉴定该属种类的主要依据;ITS序列特征是形态学鉴定的辅助手段。

　　当植物体组织完好，且具备花、果等繁殖器官，可仅使用形态学鉴定方法。

　　当植株在幼苗期，或植物体组织仅有种子、叶片等部分组织时，需采用形态学和 ITS序列相结合的鉴定方法。

　　6 器具和试剂

　　6 . 1 仪器

　　体视显微镜、电子天平(感量 0 . 001 kg,0.001 g)、液氮罐、纯水机、水浴锅、高压灭菌器、高温干燥箱、离心机、电泳仪、PCR仪、核酸浓度检测仪、电泳槽、凝胶成像系统、高通量研磨机、涡旋震荡器等。

　　6 . 2 用具

　　电动筛或套筛、解剖刀、解剖针、放大镜、直尺、镊子、小毛笔、培养皿、指形管、广口瓶、白瓷盘、分样

　　台、分样板、样品铲、样品袋、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、可调移液器( 1 000 μL, 200 μL, 100 μL, 20 μL, 10 μL,2.5 μL)、可调移液器枪头等。

　　6 . 3 试剂

　　干燥剂、防虫剂、樟脑、植物基因组提取试剂盒、PCR 反应体系常用试剂、TAE 电泳缓冲液和核酸分子量标准物质等。

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　　7 现场和实验室检疫

　　7 . 1 现场

　　7 . 1 . 1 监测

　　在检疫现场采集植株鉴定用样品，要求植株完整，形态学特征完好。 花部鉴定用样品，要求处于果实成熟期、外型完整。 种子鉴定用样品，要求发育成熟、籽粒饱满、外型完好。

　　7 . 1 . 2 植物产品检疫

　　将现场检疫抽取的送检样品充分混匀，制成平均样品。 采用四分法，视样品多少取平均样品的二分之一至四分之三(较少样品时)作为试验样品，称取其质量并记录，每份试验样品不少于 1 kg,剩余的平均样品加贴标签作为保留样品保存。 送检样品不足 1 kg 的全部检测。

　　7 . 2 实验室

　　7 . 2 . 1 准备样品

　　根据样品个体的直径确定套筛的规格，从大到小依次套上不同孔径的规格筛并加上底筛，将适量样品倒入规格筛的上层内，盖上筛盖，用回旋法过筛(或用电动筛振荡)，使样品充分分离，把过筛的筛上物和筛下物分别倒入白瓷盘内，用镊子挑取杂草籽实，放于培养皿内。 混杂于植物原粮和种子中的苋属胞果或种子，一般在孔径为 5 mm筛下物中获得。 当样品量少时，也可将全部样品放入白瓷盘中进行人工挑检。

　　7 . 2 . 2 镜检

　　在解剖镜或放大镜下镜检。 进行植株花部特征和胞果内部特征观察时，辅以解剖刀、解剖针等工具。

　　8 鉴定方法

　　8 . 1 形态学鉴定

　　8 . 1 . 1 苋属

　　一年或短时多年生草本，无毛或被短柔毛，茎直立、上升或伏卧，常分支，稀不分支。 叶互生，全缘，有叶柄;叶片菱状卵形、卵形、倒卵形、匙形、披针形、倒披针形，或圆形至线形，基部圆形至狭楔形，边常全缘，平滑、波状或起皱，先端锐尖、钝或微缺，具小短尖。 花序顶生或腋生，复合二歧聚伞花序排列呈穗状花序、聚伞圆锥花序或球状花序，顶生花序通常具退化的叶，每个二歧聚伞花序单元具苞片。 花单性，雌雄同株或异株，腋生或顶生，聚生成单一或圆锥状穗状花序;每花有 1 苞片及 2 小苞片，干膜质;花被片 0~5,大小相等或不等，绿色或着色，薄膜质，直立或向外反折，在果期直立，间或在花期后变硬或基部加厚;雄蕊 5,少数 1~4,花丝钻状或丝状，基部离生，花药 2 室;无退化雄蕊;子房具 1 直生胚珠，花柱极短或缺，柱头 2~3,钻状或条形，宿存，内面有细齿或微硬毛。 胞果球形或卵形，侧扁，膜质，不裂、周裂或不规则开裂。 种子 1 枚，双凸镜状，侧扁，黑色、深褐色、红褐色或褐色，平滑，边缘锐或钝，具光泽，有时具不明显点状或网状。 胚环形。 狓= 16 , 17。

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　　8 . 1 . 2 异株苋亚属

　　一年或短时多年生草本，茎直立。 叶具柄。 花单性，雌雄异株，顶生为主，少量腋生，聚生成单一或圆锥状穗状花序;每花有 1 苞片，干膜质;雄花花被片 5,大小相等或不等，绿色或着色，薄膜质;雄蕊 3~5;雌花花被片 0~5,大小相等或不等，直立或反折;花柱通常 2-5 分支。 胞果球形或卵形，膜质，不裂、周裂或不规则开裂。 种子双凸镜状，侧扁，黑色、深褐色、红褐色或褐色，平滑，边缘锐或钝，具光泽。 参见附录 B。

　　8 . 1 . 3 长芒苋

　　8 . 1 . 3 . 1 植株和茎

　　一年生草本，高(0 . 3 m~)0.5 m~1.5 m(~3 m)。茎直立，粗壮，具角，黄绿色，具绿色条纹，有时变淡红褐色，无毛或上部散生短柔毛;多分支，近轴分支常斜升。 见附录 C。

　　8 . 1 . 3 . 2 叶

　　叶无毛;叶 片 卵 形 至 菱 状 卵 形，近 轴 端 为 椭 圆 状，茎 上 部 叶 有 时 呈 披 针 形，长 1 . 5 cm~ 8 cm,

　　宽(0 . 5 cm~) 1 cm~4 cm,先端钝、急尖或微凹，常具小短尖，基部楔形，略下延，边全缘，平滑;叶柄长(0.7 cm~)4 cm~8 cm。

　　8 . 1 . 3 . 3 花序

　　穗状花序生茎和侧枝顶端，幼时直立，常俯垂，长(7 cm~) 10 cm~25 cm,宽 1 cm~1.2 cm,腋生花

　　序较短，短圆柱状或球状。 雌株花序在花果期增厚，苞片及最外侧花被片向外舒展先端变硬直。 见附录 C。

　　8 . 1 . 3 . 4 苞片

　　雌花苞片具外延中脉，4 mm~6 mm 长，长于花被片，先端渐尖或具小短尖。

　　雄花苞片长 4 mm,等长或长于外侧花被片，先端具长渐尖。

　　8 . 1 . 3 . 5 花被片

　　雌花花被片 5,稍反曲，不等长，最外侧一枚倒披针形，长 1 . 7 mm~3.8 mm,先端渐尖，具小短尖，其余花被片匙形，长 2 mm~2.5 mm,先端截形至微凹，先端边缘啮蚀状，中间具小短尖;花柱分支平展;柱头 2(-3) 。见附录 C。

　　雄花花被片 5,不等长，长圆形，先端急尖，最外侧花被片长约 5 mm, 中脉粗，伸出呈长芒尖;内侧花被片长 3 . 5 mm~4 mm,具突出外延成硬尖的中脉，先端长渐尖或小短尖;雄蕊 5,短于内侧花被片。

　　8 . 1 . 3 . 6 胞果

　　近球形，黄褐色至棕褐色，有时红棕色，长 1 . 5 mm~2 mm,短于花被片，成熟时壁薄，近光滑或不明显皱缩，周裂。

　　8 . 1 . 3 . 7 种子

　　种子近圆形至阔卵形、阔椭圆形，长 0 . 90 mm~1.12 mm,深红褐色至褐色，有光泽。 常见苋属种子形态特征见附录 C、附录 D 和附录 E。

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　　8 . 1 . 3 . 8 染色体及核型

　　2n= 34 , 2n=4m+2sm+5st+6t。见附录 C。

　　8 . 2 分子生物学鉴定

　　8 . 2 . 1 DNA提取及浓度测定

　　使用常见商品化试剂盒提取植物基因组 DNA。 用以提取核酸的植物组织用量参照所采用商品化试剂盒使用说明。 用紫外分光光度计或核酸浓度测定仪检测所提取核酸浓度，浓度以达到 8 . 2 . 2 步骤中使用的商品化 PCR试剂盒中要求的 DNA模板用量为准。

　　8 . 2 . 2 ITS序列扩增及测序

　　ITS序列扩增及测序的信息见附录 F。

　　9 结果判定

　　9 . 1 植株鉴定

　　植物体各部分组织完整，参照 8 . 1 及附录 B、附录 C、附录 D 和附录 E所述苋属植株、花序、花、胞果等形态特征，可判定为长芒苋及其近似种。

　　9 . 2 种子及部分组织鉴定

　　参照 8 . 1 及附录 B、附录 C、附录 D 和附录 E所述种子或叶片等部分组织形态特征，并与附录 G 所列 ITS参考序列一致性在 99 . 70%以上时，可判定为长芒苋。

　　10 样本保存和处理

　　标本的保存方法应符合 GB/T 27402—2008 中 4 . 5 标本的要求。 无害化处理应符合 GB 19489 — 2008 中 7 . 19 废物处置。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　长芒苋其他基本信息

　　A.1 地理分布

　　苋属在全世界约 74 种，根据花部形态及雌雄异株等特性分为苋亚属(Amaranthus subgen.Ama- ranthus)，约 13 种，白苋亚属[Amaranthussubgen.Albersia (Kunth) Gren. & Godr.], 约 52 种，和异株苋亚属[Amaranthus subgen.Acnida (L.) Aellen ex K.R.Robertson], 约 9 种。我国有 20 余种。长芒

　　苋原产北美洲墨西哥西北部、美国加利福尼亚州南部至新墨西哥州和得克萨斯州。 西印度群岛(古巴、海地和多米尼加)也可能是其原产地。 现分布于美国、加拿大、阿根廷、巴西、俄罗斯、英国、法国、德国、捷克、波兰、印度、日本、韩国、埃塞俄比亚、塞内加尔、南非等 40 多个国家(地区)。在我国，最早发现于北京大兴范庄子村荒地，后相继于天津、河北、江苏、浙江、福建等地发现。

　　A.2 经济危害

　　几乎可以为害热带、亚热带地区种植的所有重要作物。 与作物争夺生长空间和资源，导致作物严重减产。 同时，因其抗多种常用除草剂，目前已成为美国农业生产中(玉米、大豆和棉花)的主要问题，造成的经济损失难以评估。

　　A.3 生物学特性

　　一年生草本碳四高光效植物。 喜光照，喜肥沃疏松土壤、耐盐碱地，适应性强，在高温、低温等逆境条件有较好的抗逆生长。 一年四季均可开花，主要花期在夏季。 雌株每株生产种子 20 万至 60 万粒，在土壤中可存活数年。 种子在 5 ℃ ~35 ℃时均能发芽，在全光照时，生长速率可达每天 5 cm,有效地与作物争夺阳光、水、营养和空间。 此外，抗多种除草剂，难以防治。

　　A.4 传播途径

　　种子易混杂在植物及植物产品中，如大豆、玉米等，远距离传播。 还可通过农业灌溉体系和其他水流，或借助鸟类、牲畜、农机具等 自然传播。 此外，长芒苋还是风媒传粉植物，其花粉最远可传播至46 km 以外地区，可授粉远处雌株。

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　异株苋亚属分种特征检索表

　　B.1 雌株检索表

　　1 . 苞片极宽阔，边具圆齿，叶状，将花包裹在内;叶片边缘皱缩 …… 绿纹苋 Amaranthusacanthochiton

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　　[引 自 Sauer, 1955]

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　长芒苋形态特征

　　C.1 长芒苋植株

　　长芒苋植株形态特征见图 C. 1 。

　　图 C.1 长芒苋植株

　　C.2 长芒苋花序

　　长芒苋花序形态见图 C. 2 。

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　　注：左为雄株，右为雌株。

　　图 C.2 长芒苋花序

　　C.3 长芒苋花

　　长芒苋花部形态特征见图 C. 3 。

　　图 C.3 长芒苋花部形态特征

　　C.4 长芒苋种子

　　长芒苋种子形态特征见图 C. 4 和图 C. 5 。

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　　图 C.4 种子形态示意图(正面观和侧面观)

　　图 C.5 长芒苋种子

　　C.5 长芒苋染色体及核型

　　长芒苋染色体形态见图 C. 6,核型分析见图 C. 7 。

　　图 C.6 长芒苋染色体形态( 2n=34)(图中标尺为 2 μm)

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　　图 C.7 长芒苋染色体核型分析( 2n=4m+2sm+5st+6t)

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　　附 录 D

　　(资料性)

　　口岸常见苋属种子形态特征比对

　　口岸常见苋属种子形态特征比对见表 D. 1 。

　　表 D.1 口岸常见苋属种子形态特征比对表

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　　附 录 E

　　(资料性)

　　常见苋属种子特征图

　　常见苋属种子特征见图 E. 1 。

　　a)长芒苋 Amaranthuspalmeris.watson b)糙果苋 A.tuberculatus(Moq.)J.D.sauer

　　c) 白苋 A.albus L. d) 凹头苋 A.blitum L.

　　e)布氏苋 A.bouchoniThell. f)绿穗苋 A.hybridusL.图 E.1 常见苋属种子

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　　g)刺苋 A.spinosusL.

　　i)反枝苋 A.retroflexusL.

　　k)合被苋 A.polygonoidesL.

　　h)假刺苋 A.dubius Mart.exThell.

　　j)苋 A.tricolor L.

　　l)菱叶苋 A.standleyanusL.

　　图 E.1 常见苋属种子(续)

　　m)皱果苋 A.viridis L.

　　o)南非苋 A.capensis Thell.

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　　n)地中海苋 A.graecizans L.

　　p)北美苋 A.blitoidess.watson

　　图 E.1 常见苋属种子(续)

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　　附 录 F

　　(资料性)

　　ITS序列扩增及测序信息

　　F.1 引物序列

　　ITS 4 : 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG-3′

　　ITS 5 : 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′

　　注：该引物为通用引物，每次扩增需做空白对照，以确认是否污染。

　　F.2 扩增体系及程序

　　25 μL或 50 μL体系，采用商品化的 PCR试剂盒进行扩增。 反应体系中引物初始浓度为 10 μmol/L,模板 DNA含量约 20 ng或以所采用的商品化 PCR试剂盒说明书为准。

　　扩增程序中，ITS序列退火温度推荐为 52 ℃ ~55 ℃ 。其余参数参照所采用商品化 PCR试剂盒说明书。

　　F.3 电泳及测序

　　ITS序列扩增产物电泳条件：5 μL PCR产物，1 . 0%琼脂糖，1×TAE缓冲液。 以 DNA分子量标记作为对照，ITS序列扩增产物约 700 bp。

　　ITS序列测序引物为 ITS 4 及 ITS 5 。

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　　附 录 G

　　(资料性)

　　长芒苋 ITS参考序列

　　以下给出了长芒苋 ITS参考序列 GenBank登录号。

　　KY 968865 . 1

　　KY 968864 . 1 MT 811923 . 1

　　MT 811920 . 1 LT 999801 . 1 KF 493784 . 1 MT 622754 . 1 KF 385438 . 1

　　KF 493786 . 1 KP 318856 . 1 KC 747433 . 1 KM 438065 . 1

　　KM 438064 . 1

　　KM 438063 . 1

　　KM 438062 . 1

　　KM 438061 . 1

　　KM 438060 . 1 KF 493788 . 1

　　KF 493782 . 1

　　KF 493803 . 1

　　KF 493835 . 1

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　　参 考 文 献

　　[1] 李振宇.长芒苋 — 中国苋属一新归化种[J] . 植物学通报，2003,20(6) : 734-735 .

　　[2] 徐晗.中国苋属植物的研究[D] . 北京：中国科学院植物研究所，2010 .

　　[3] 徐晗，等.基于 ITS 序列的中国外来苋属植物系统关系分析[J] . 广西植物，2017 , 37 (2) : 139-144 .

　　[4] Aellen P. Amaranthus L. In: Hegi G (ed) Illustrierte Flora von Mitteleuropa, 2nd edn. , vol 3 , Part 2 [M].Munchen: Carl Hanser Verlag, 1959 : 465-516.

　　[5] Sauer , J. D. Revision of the dioecious amaranths. Madroo , 1955 , 13 : 5-46 .