GB/T 25878-2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测 PCR法

　　ICS 65. 020. 30 B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 25878—2010

　　对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

　　(IHHNV)检测 PCR法

　　Polymerasechain reaction (PCR) method forinfectioushypodermaland

　　haematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)

　　2011-01-10发布 2011-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 25878—2010

　　前 言

　　本标准的附录 A 和附录 B为资料性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、农业部全国水产技术推广总站 。

　　本标准主要起草人 :黄倢 、杨冰 、朱泽闻 、宋晓玲 、孙喜模 、赵红萍 、刘莉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 25878—2010

　　对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

　　(IHHNV)检测 PCR法

　　警告 :使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验 ,本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施 ,并保证符合国家有关法规规定的条件。

　　1 范围

　　本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR) 检测方法的原理 、所需试剂和材料 、仪器和设备 、操作步骤和结果判定 。

　　本标准适用于对虾 、环境生物 、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的定性检测 。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件 ,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本适用于本标准 。

　　SC/T 7202. 1—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第 1部分 :压片显微镜检查法

　　SC/T 7202. 2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第 2部分 :PCR检测法

　　3 原理

　　3. 1 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征

　　传染 性 皮 下 及 造 血 组 织 坏 死 病 毒 (infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)粒子大小为 20 nm~ 22 nm ,是无囊膜二十面体 ,在氯化铯中的浮力密度为 1. 40 g/mL,含线状单链 DNA,长度为 4. 1 kb,衣壳由 4个分子质量分别为 74kD、47kD、39kD、37. 5 kD 的多肽组成 。

　　IHHNV可感染世界各地的养殖对虾 ,其感染细角滨对虾(Litopenaeusstylirostris) 会引起急性传染病和高死亡率(90%) ,稚虾受到的危害最严重 。IHHNV感染 凡 纳 滨 对 虾(Litopenaeusvannamei)会引起慢性 “矮小残缺综合症 ”(RDS) ,主要影响是患病对虾生长缓慢 , 畸形 ,受感染存活对虾终生带毒 ,通过垂直和水平传播 。

　　3. 2 技术原理

　　IHHNV 的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是以 IHHNV 的一段 389个碱基(b)长度的特异性 DNA序列作为模板 , 以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物 ,在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下 ,利用依赖 DNA 的 DNA 聚合酶的合成作用 ,经过数十次变性 、退火和延伸的反应循环 ,使模板上介于两个引物之间的 DNA 片段得到特异性地级数扩增 ,再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段 ,从而揭示微量 IHHNV DNA 的存在 。

　　4 试剂和材料

　　4. 1 所需试剂除引物 、阳性对照和阴性对照以外 ,按照 SC/T 7202. 2—2007中第 5 章的规定 。

　　4. 2 100 ng/μL引物 F:5′-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3′, -20 ℃保存 。

　　4. 3 100 ng/μL引物 R:5′-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3′, -20 ℃保存 。

　　4. 4 阳性对照为已知 IHHNV 阳性的组织样品的 DNA模板 , -20 ℃保存 。

　　1

　　GB/T 25878—2010

　　4. 5 阴性对照为已知 IHHNV 阴性的组织样品的 DNA模板 , -20 ℃保存 。

　　4. 6 空白对照以无菌双蒸水为模板 。

　　5 仪器和设备

　　所需仪器设备按照 SC/T 7202. 2—2007中第 6章的规定 。

　　6 操作步骤

　　6. 1 反应体系的准备

　　6. 1. 1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成 。

　　6. 1. 2 PCR反应可选择 25μL、50 μL或 100 μL反应体系进行 。

　　6. 1. 3 在 PCR前区按表 1 的要求 ,加入除 Taq酶以外的各项试剂 ,配制成无酶反应预混物 。保存于

　　-20 ℃ 。在临用前 ,根据所需的反应份数 ,取出无酶反应预混物 ,加入相应体积的 Taq酶 ,混匀 , 即成完全的反应预混物 。按 1份/支分装到 0. 2 mL PCR管中 。如果 PCR仪不具备热盖功能 ,再向各管内加入 50 μL液体石蜡 。暂存于 4 ℃ 。

　　表 1 100份 PCR反应预混物所需试剂组成

　　试剂

　　25 μL体系

　　50 μL体系

　　100 μL体系

　　试剂终浓度

　　10×PCR缓冲液(无 Mg2+ )

　　250 μL

　　500 μL

　　1 000 μL

　　1×

　　氯化镁(25 mmol/L)

　　200 μL

　　400 μL

　　800 μL

　　2. 0 mmol/L

　　dNTP(10 mmol/L)

　　100 μL

　　200 μL

　　400 μL

　　400 μmol/L

　　100 ng/μL引物 F

　　75 μL

　　150 μL

　　300 μL

　　3 ng/μL

　　100 ng/μL引物 R

　　75 μL

　　150 μL

　　300 μL

　　3 ng/μL

　　灭菌双蒸水

　　1 725 μL

　　3 450 μL

　　6 900 μL

　　—

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)

　　25 μL

　　50 μL

　　100 μL

　　0. 05 U/μL

　　100份反应总体积

　　2 450 μL

　　4 900 μL

　　9 800 μL

　　注 1: 25 μL体系模板量 0. 5 μL/反应管 。

　　注 2: 50 μL体系模板量 1 μL/反应管 。

　　注 3: 100 μL体系模板量 2 μL/反应管 。

　　6. 2 样品准备

　　6. 2. 1 样品的处理应在样品区完成 。

　　6. 2. 2 样品采集的要求按 SC/T 7202. 1—2007中附录 B 的规定执行 。

　　6. 2. 3 活体或冰冻幼体 、仔虾及体长在 3 cm 以下稚虾个体样品约 5 mg~ 100mg(去掉稚虾眼) 。活体或冰冻的虾鳃 、胃 、游泳足或步足样品约 5 mg~ 100 mg。活体或冰冻饵料生物样品约 5 mg~ 100 mg。池底表土样品约 500 mg。将上述待检样品放入灭菌 1. 5 mL微型离心管中 ,应避免各样品间的交叉污染 。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗 ,然后浸于新配制的有效氯含量为 3. 0 ×10-3 的含氯消毒剂中 5 min,经无 PCR产物污染的自来水充分清洗 ,再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品 。

　　6. 3 DNA 的提取

　　按照 SC/T 7202. 2—2007中 7. 1. 3 的规定执行 。

　　6. 4 PCR扩增

　　6. 4. 1 在 PCR前区 ,按照表 1对各反应体系所需的模板体积要求 , 向各支含有 1份反应预混物的 PCR管内加入相应体积的各样品 DNA提取液 ,并设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。

　　6. 4. 2 将上述加有样品模板的 PCR 管带入 PCR 后区 , 置于 PCR 仪中按以下程 序 进 行 扩 增 : 95 ℃

　　2

　　GB/T 25878—2010

　　5 min;95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸 7 min,最后 4 ℃保温 。 准备进行产物的电泳 。

　　6. 5 PCR产物电泳

　　按照 SC/T 7202. 2—2007中 7. 1. 5~ 7. 1. 8 的规定执行 。

　　7 结果判定

　　7. 1 阳性对照和阳性样品在 389bp处应有一条特定条带出现 ; 阴性对照和阴性样品在 389 bp处应无条带出现 ,空白对照不出现任何条带 。 阳性对照在 389 bp处无特定条带出现或阴性对照在 389 bp处有条带出现都表明 PCR失败 ,应在排除故障和清除污染后 ,重新取样检测 。对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)PCR检测产物序列参见附录 A。

　　7. 2 条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少 ,但并不对应于模板的量的多少 。

　　7. 3 阳性结果表明被检样品中存在 IHHNV DNA。对活虾和敏感宿主而言 ,提示已受 IHHNV感染 ;对冰鲜或冰冻对虾而言 ,提示曾受到 IHHNV感染 。

　　7. 4 电泳结果的分析和问题排除方法参见附录 B。

　　3

　　GB/T 25878—2010

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式反应(PCR)检测产物序列

　　1 GAGGAGAGAG CTGTAGTAGC GGAACACAAC CCGACTTTAT TGAAGGGACT CCCAACGGAC F

　　61 CGGACGAAAT GGACGGAAGG CGACTGGAAG AGAGTGAGAT TGATAAACAA GTGGAAAGTA

　　121 CAACATGGTA CACCTTCGTC ATCAGAGAAA AACCACAACC AAGAAGACTC TCCGGACGAA

　　181 CGCCAAACTT CACCATTACA GATCATGGTG ACCACTGGCA CATCACATAC TCCGGACACC

　　241 CAACCAATAA GACCAGACAT AGAGCTACAA TCCTCGCCTA TTTGGGAGTT ACCTTTGCTG

　　301 CCAGAGCCGA AGCTGAAGCG ACTACGGTAC TTGTTAGAAA TATCAAGAGA TGGATACTCT

　　361 ATCTTATCAG ATACGGTATT GAACGGCTTT CGTATTTTGG TCTTGGCCAC GCCATTTTTA R

　　图 A. 1 对虾 IHHNV PCR检测产物序列

　　4

　　GB/T 25878—2010

　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)聚合酶链式

　　反应(PCR)检测电泳结果分析和问题排除方法

　　表 B. 1 对虾 IHHNV PCR检测电泳结果分析和问题排除方法

　　试验结果

　　结果判读及原因分析

　　问题排除

　　对虾样品

　　阳性 对 照 和 阳 性 样 品在 389bp处有条带 , 阴性对照 和 空 白 对 照 无 389 bp条带

　　1. PCR反应正常 ,结果有效

　　阳 性 对 照 有 条 带 , 但 分子质量标准没有影像

　　1. 分 子 质 量 标 准 失 效 或 加 样 量太少

　　更换分子质量标准或增加其加样量

　　分子 质 量 标 准 有 影 像 ,但阳性对照无条带

　　1. PCR反应失败

　　检查并更换 PCR反应所用试剂以及 PCR程序是否正确

　　2. 阳性对照失效

　　更换阳性对照 ,重新实验

　　阴性对照或空白对照在 389bp处有条带出现

　　1. 微量移液器污染

　　清洗微量移液器 ,只能用 PCR后区的微量移液器取反应产物

　　2. 试剂污染

　　更换试剂

　　3. 环境污染

　　清洁实验室及所用仪器设备 ,见 SC/T 7202. 2— 2007中的附录 B

　　4. 操作污染

　　禁止从 PCR 后 区 到 PCR 前 区 的 交 流 , 加 强 操作隔离

　　阳性对照和阴性对照组正常 ,但 已 知 带 毒 样 品 无条带

　　1. DNA提取失败或降解

　　检查提取 DNA所用试剂情 况 ,重 新 试 验 ,确 认样品新鲜程度

　　2. DNA浓度过高

　　将样品稀释 10倍以上

　　3. PCR抑制物介入

　　稀释样品 10倍以上 ,或重新提取 DNA

　　分 子 质 量 标 准 正 常 , 但阳性对照 、阴 性 对 照 和 样 品出现 较 多 杂 带 或 明 显 的 弥散区

　　1. 未 注 意 热 启动 操 作 , 使 PCR出现非特异性扩增

　　做好热启动操作 。样品先要加到 PCR管盖上 ,反应 预 混 物 预 热 后 , 短 暂 离 心(1 s~ 2 s) 以 混 入 样品,迅速放回预热 PCR仪中

　　2. 酶 活 性 、dNTP 浓 度 或 Mg2+浓度差异

　　确认预 混 物 制 备 的 准 确 性 、试 剂 质 量 , 对 不 同批次的酶重新测定最佳 Mg2+ 离子浓度

　　3. 温度控制异常

　　检查 PCR仪是否复性温度过低

　　凝 胶 上 无 任 何 影 像 , 包括 DNA分子质量标准

　　1. 紫外观察仪故障

　　检查紫外观察仪

　　2. 背景发红太亮

　　减少溴化乙锭(EB) a 用 量 , 将 琼 脂 糖 凝 胶 置 于清水中 30 min后再观察结果

　　5

　　GB/T 25878—2010

　　表 B. 1 (续)

　　试验结果

　　结果判读及原因分析

　　问题排除

　　凝 胶 上 无 任 何 影 像 , 包括 DNA分子质量标准

　　3. 凝胶太厚

　　重新制作琼脂糖凝胶片

　　4. 电极颠倒或电泳时间过长

　　改正电极方向 ,重新加样电泳

　　5. 溴化乙锭(EB)分解失效

　　重新配制溴化乙锭(EB)

　　a 溴化乙锭(EB)有毒 ,试剂的操作和废弃物的处理按 SC/T 7202. 2—2007中附录 B 的规定执行 。

　　6