GB/T 25877-2010 淀粉胶电泳同工酶分析

　　ICS 65. 150 B 50

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 25877—2010

　　淀粉胶电泳同工酶分析

　　Starch gelelectrophoresisisozymeanalysis

　　2011-01-10发布 2011-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 25877—2010

　　前 言

　　本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D 和附录 E均为规范性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国水产标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国海洋大学 、黄海水产研究所 。

　　本标准主要起草人 :高天翔 、张岩 、韩志强 、肖永双 、张辉 。

　　Ⅰ

　　GB/T 25877—2010

　　淀粉胶电泳同工酶分析

　　1 范围

　　本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料 、仪器 、抽样 、分析步骤及结果判定 。

　　本标准适用于常见淡 、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件 ,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 18654. 1—2008 养殖鱼类种质检验 第 1部分 :检验规则

　　GB/T 18654. 2—2008 养殖鱼类种质检验 第 2部分 :抽样方法

　　3 原理

　　利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同 ,在电场作用下 ,凝胶中出现的同工酶迁移率不同 ,经催化 、染色 、扫描 ,获得各同工酶谱带 、数目及吸收强度等 ,经比较分析 ,判定鱼类的遗传特性 。

　　4 试剂和材料

　　除另有说明外 ,所有试剂均为分析纯或以上级别 ,水为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。

　　4. 1 水解马铃薯淀粉 。

　　4. 2 柠檬酸 。

　　4. 3 乳酸 。

　　4. 4 乙二胺四乙酸 。

　　4. 5 乙二胺四乙酸二钠 。

　　4. 6 苹果酸 。

　　4. 7 乳酸锂 。

　　4. 8 磷酸氢二钠 。

　　4. 9 磷酸二氢钠 。

　　4. 10 辅酶 Ⅰ 。

　　4. 11 辅酶 Ⅱ 。

　　4. 12 吩嗪甲酯硫酸盐 。

　　4. 13 氯化硝基四氮唑蓝 。

　　4. 14 异柠檬酸三钠 。

　　4. 15 6-磷酸葡萄糖酸钠 。

　　4. 16 乙醇 。

　　4. 17 丙酮 。

　　4. 18 α-萘乙酸 。

　　4. 19 α-磷酸甘油 。

　　4. 20 6-磷酸葡萄糖 。

　　4. 21 山梨糖醇 。

　　1

　　GB/T 25877—2010

　　4. 22 固蓝 RR盐 。

　　4. 23 冰乙酸 。

　　4. 24 盐酸 。

　　4. 25 氢氧化钠 。

　　4. 26 肝素 。

　　4. 27 氯化镁 。

　　4. 28 3-氨甲基-吗啡啉 。

　　4. 29 TC-7. 0制胶缓冲液 :配制方法见附录 A。

　　4. 30 TC-8. 0制胶缓冲液 :配制方法见附录 A。

　　4. 31 CAPM-6. 0制胶缓冲液 :配制方法见附录 A。

　　4. 32 CAPM-7. 0制胶缓冲液 :配制方法见附录 A。

　　4. 33 TC-7. 0 电泳缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　4. 34 TC-8. 0 电泳缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　4. 35 CAPM-6. 0 电泳缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　4. 36 CAPM-7. 0 电泳缓冲液 :配制方法见附录 B。

　　4. 37 淀粉凝胶 :配制方法见附录 C。

　　4. 38 染色缓冲液 :配制方法见附录 D。

　　4. 39 染色液 :几种常见同工酶染色液配制方法见附录 E。

　　5 仪器

　　5. 1 微量匀浆机 。

　　5. 2 高速冷冻离心机(转速 12 000 r/min) 。

　　5. 3 多用电泳仪 。

　　5. 4 真空抽气机(泵) 。

　　5. 5 电炉或微波炉 。

　　5. 6 割胶器 。

　　5. 7 多层滤纸 。

　　5. 8 激光扫描仪 。

　　5. 9 pH 计 :精度为 0. 01。

　　5. 10 制胶模具 。

　　5. 11 染色盒 。

　　5. 12 4 ℃冷藏冰箱 。

　　5. 13 低温冰箱 :冰室温度在 -20℃以下 。

　　5. 14 恒温培养箱 。

　　5. 15 分析天平 :精度为 0. 000 1 g。

　　5. 16 电子天平 :精度为 0. 1 g。

　　5. 17 摄影装置 :数码照相机 。

　　6 抽样

　　6. 1 样品的抽样

　　按 GB/T 18654. 2—2008的规定执行 。

　　6. 2 取样

　　取样品组织 1 g~ 2 g试样 , 于低温冰箱中( -25℃以下)保存 ;对于血液试样 ,加肝素抗凝 , 于 4 ℃

　　2

　　GB/T 25877—2010

　　冰箱中保存 ,备用 。

　　7 分析步骤

　　7. 1 分析样品的制备

　　电泳前取 0. 3 g左右样品放入 1. 5 mL离心管 ,加入等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨 ,研磨混合液置于冷冻离心机中 ,在 4 ℃ 、12 000 r/min的条件下离心直至上清液澄清 ,取上清液冷冻保存备电泳用 。

　　对于血液试样 ,待分离出血清后上样 。

　　7. 2 凝胶制备

　　凝胶制备见附录 C。

　　7. 3 电泳步骤

　　用手术刀在凝胶距离边缘三分之一(约 2. 5 cm)处切开 ,用适当大小的滤纸片蘸取 7. 1 制备的样品提取液(或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁)插入切 口 中 。上样完毕后 , 向电泳槽内加入电泳缓冲液 ,用滤纸搭盐桥 ,在 4 ℃条件下以恒定电流(40 mA)进行电泳 , 电泳时间依酶的种类而不同 。

　　7. 4 染色、固定

　　电泳结束后 ,用割胶弓将凝胶水平切割为 1. 3 mm 厚的薄片 ,置于染色盒中 ,将配制好的染色液倒入染色盒后置于 37 ℃的恒温箱中进行染色 。待显色充分后 ,用 7%的冰乙酸溶液终止反应 。

　　各种酶的染色液配制方法见附录 D 和附录 E。

　　7. 5 制干胶片

　　取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上 ,压制封膜 ,风干后编号保存 。

　　7. 6 摄影、扫描

　　用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相 ,或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描 。

　　7. 7 结果分析

　　7. 7. 1 酶位点与等位基因分析

　　根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征 ,确定每种同工酶的编码基因位点 、多态位点的等位基因频率 。

　　7. 7. 2 群体遗传特异性

　　多态位点比例(P) 、平均杂合度观察值(Ho) 、平均杂合度期望值(He) 分别按式(1) 、式(2) 和式(3)

　　计算 :

　　P = N1/n× 100% …………………………( 1 )

　　式中 :

　　P— 多态位点比例 ;

　　N1— 多态位点数 ;

　　n— 检测位点总数 。

　　Ho ( 2 )

　　式中 :

　　Ho— 平均杂合度观察值 ;

　　qij — 第i个位点上第j个等位基因的纯合基因型的频率 ;

　　mi— 第i个位点上的等位基因总数 ;

　　n— 检测位点总数 。

　　3

　　GB/T 25877—2010

　　He ( 3 )

　　式中 :

　　He— 平均杂合度期望值 ;

　　qij — 第i个位点上第j个等位基因的纯合基因型的频率 ;

　　mi— 第i个位点上的等位基因总数 ;

　　n— 检测位点总数 。

　　8 结果判定

　　8. 1 个体测定结果的判定

　　按 GB/T 18654. 1—2008中 6. 1 的规定执行 。

　　将所有测定结果逐一与标准对照 ,凡符合或接近标准规定的 ,判定为合格 ;凡不符合标准 ,或与标准规定有显著差异的 ,判定为不合格 。

　　8. 2 样品群体的判定

　　根据 8. 1 的判定结果 ,计算出被检样品合格品的百分比 ,用百分数表示 。

　　4

　　GB/T 25877—2010

　　附 录 A

　　(规范性附录)

　　制胶缓冲液的配制

　　A. 1 TC-7. 0 制胶缓冲液

　　三羟甲基氨基甲烷 1. 09 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　A. 2 TC-8. 0 制胶缓冲液

　　三羟甲基氨基甲烷 1. 21 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至 pH8. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　A. 3 CAPM-6. 0 制胶缓冲液

　　柠檬酸 0. 42 g,用蒸馏水溶解并用 3-氨甲基-吗啡啉调至 pH6. 2,蒸馏水定容至 1 L。

　　A. 4 CAPM-7. 0 制胶缓冲液

　　柠檬酸 0. 42 g,用蒸馏水溶解并用 3-氨甲基-吗啡啉调至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　5

　　GB/T 25877—2010

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　电泳缓冲液配制

　　B. 1 TC-7. 0 电泳缓冲液

　　三羟甲基氨基甲烷 16. 35 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　B. 2 TC-8. 0 电泳缓冲液

　　三羟甲基氨基甲烷 20 g,用蒸馏水溶解并用柠檬酸调至 pH8. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　B. 3 CAPM-6. 0 电泳缓冲液

　　柠檬酸 8. 4 g,用蒸馏水溶解并用 3-氨甲基-吗啡啉调至 pH6. 2,蒸馏水定容至 1 L。

　　B. 4 CAPM-7. 0 电泳缓冲液

　　柠檬酸 8. 4 g,用蒸馏水溶解并用 3-氨甲基-吗啡啉调至 pH7. 0,蒸馏水定容至 1 L。

　　6

　　GB/T 25877—2010

　　附 录 C

　　(规范性附录)淀粉凝胶的配制

　　加淀粉 30g 和制胶缓冲液 254mL,在锥形烧瓶内混匀 ,加水定容至 1 L,加热至沸腾 、完全溶解 ,抽气后注入制胶模具(见图 C. 1)中 ,冷却后 ,保鲜膜密封保存备用 。

　　图 C. 1 制胶模具示意图

　　7

　　GB/T 25877—2010

　　附 录 D

　　(规范性附录)

　　染色缓冲液配制

　　D. 1 0. 2 mol/L Tris-HCl,pH8. 0

　　三羟甲基氨基甲烷 24. 22 g,用蒸馏水溶解并用盐酸调至 pH8. 0,蒸馏水稀释至 1 L。

　　D. 2 0. 2 mol/L Tris-HCl,pH8. 5

　　三羟甲基氨基甲烷 24. 22 g,用蒸馏水溶解并用盐酸调至 pH8. 5,蒸馏水稀释至 1 L。

　　D. 3 0. 2 mol/L Tris-HCl,pH9. 5

　　三羟甲基氨基甲烷 24. 22 g,用蒸馏水溶解并用盐酸调至 pH9. 5,蒸馏水稀释至 1 L。

　　D. 4 0. 1 mol/L磷酸缓冲液,pH7. 0

　　磷酸氢二钠 17. 91 g 和磷酸二氢钠 8. 05 g,蒸馏水溶解定容至 1 L。

　　8

　　GB/T 25877—2010

　　附 录 E

　　(规范性附录)

　　常见同工酶的染色液配制方法

　　常见同工酶的染色液配制方法见表 E. 1。

　　表 E. 1 常见同工酶的染色液

　　同工酶

　　英文名和缩写

　　试 剂

　　浓 度

　　用 量

　　乙醇脱氢酶

　　alcoholdehydroenase;

　　ADH

　　乙醇(99%)

　　99%

　　1 mL~ 2 mL

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 5

　　25 mL

　　NAD基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　甘油醛-3-

　　磷酸脱氢酶

　　glyceraldehyde-3-phosphate

　　dehydrogenase;

　　G3PDH

　　α-甘油磷酸

　　200 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 5

　　25 mL

　　NAD基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　苹果酸脱氢酶

　　malate dehydrogenate;

　　MDH

　　苹果酸

　　250 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH9. 5

　　25 mL

　　NAD基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　乳酸脱氢酶

　　lactate dehydrogenase;

　　LDH

　　乳酸锂

　　0. 6 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 5

　　25 mL

　　NAD基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　异柠檬酸脱氢酶

　　isocitrate dehydrogenase;

　　IDHP

　　异柠檬酸三钠

　　25 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 0

　　25 mL

　　NADP基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　氯化镁

　　1 mol/L

　　1. 2 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　超氧化物歧化酶

　　superoxide dismutase;

　　SOD

　　氯化硝基四氮唑蓝

　　10 mg

　　乙二胺四乙酸二钠盐

　　100 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH9. 5

　　25 mL

　　乙醇

　　2. 5 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　蒸馏水

　　20 mL

　　磷酸葡萄糖变位酶

　　phosphoglucomutase;

　　PGM

　　6-磷酸葡萄糖酸钠

　　50 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 0

　　25 mL

　　氯化镁

　　1 mol/L

　　0. 4 mL

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　　GB/T 25877—2010

　　表 E. 1 (续)

　　同工酶

　　英文名和缩写

　　试 剂

　　浓 度

　　用 量

　　磷酸葡萄糖变位酶

　　phosphoglucomutase;

　　PGM

　　NADP基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

　　25 U

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　酯酶

　　esterase;

　　EST

　　丙酮

　　1 mL

　　固牢 RR盐

　　32 mg

　　磷酸缓冲液

　　0. 1 mol/L,pH7. 0

　　20 mL

　　乙醇

　　2 mL

　　α-萘乙酸

　　1%

　　20 mL

　　苹果酸酶

　　malic enzyme;

　　ME

　　苹果酸

　　250 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 5

　　25 mL

　　氯化镁

　　1 mol/L

　　1 mL

　　NADP基本保存溶液

　　0. 25%

　　25 mL

　　PMS基本保存溶液

　　0. 5%

　　0. 5 mL

　　山梨醇脱氢酶

　　sorbitoldehydrogenase;

　　SDH

　　山梨糖醇

　　125 mg

　　Tris-HCl

　　0. 2 mol/L,pH8. 0

　　25 mL

　　NAD基本保存溶液

　　0. 25%