GB/T 46144-2025 化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系（RTgill-W1）试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46144—2025

　　化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系(RTgill-W1)试验

　　Chemicals—Fish celllineacutetoxicity—TheRTgill-W1celllineassay

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46144—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 、缩略语 1

　　4 试验原理 2

　　5 受试物信息 2

　　6 参比物 3

　　7 试验准备 3

　　8 试验程序 3

　　9 数据分析和结果评价 9

　　10 质量保证与质量控制 9

　　11 结果报告 10

　　附录 A (规范性) 试验培养基和试剂的配制 11

　　附录 B (资料性) RTgill-W1细胞的传代和冻存 13

　　参考文献 16

　　Ⅰ

　　GB/T 46144—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 、上海市检测中心 、生态环境部南京环境科学研究所 、中国水产科学研究院珠江水产研究所 、中检科健(天津)检验检测有限责任公司 、中国化工经济技术发展中心 。

　　本文件主要起草人 :梅承 芳 、许 玉 洁 、许 玫 英 、窦 从 从 、王 蕾 、王 庆 、滕 晓 明 、王 鹏 、刘 纯 新 、陈 晓 倩 、林木青 、王英英 、余明喧 、王晓兵 、许丽红 、杨婧 、邓通初 、钟贞 、郭佳锋 、郝长富 、田升江 。

　　Ⅲ

　　GB/T 46144—2025

　　化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃

　　细胞系(RTgill-W1)试验

　　1 范围

　　本文件描述了化学品鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系(RTgill-W1)试验方法 。

　　本文件适用于测试和评价化学品对鱼类细胞系的急性毒性 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 21852 化学品 分配系数(正辛醇-水) 高效液相色谱法试验

　　GB/T 21853 化学品 分配系数(正辛醇-水) 摇瓶法试验

　　GB/T 22052 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法

　　GB/T 22228 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 1 Pa至 105 Pa范围内的测定 静态法

　　GB/T 22229 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 3 Pa至 1 Pa范围内的测定 蒸气压平衡法

　　GB/T 27860 化学品 高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数

　　GB/T 42426 化学品 蒸气压试验

　　3 术语和定义、缩略语

　　3. 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1. 1

　　细胞活力 cellviability

　　处于健康状态(即代谢活跃 ,细胞膜和细胞器完好)的细胞百分比 。

　　3. 1.2

　　效应浓度 effectconcentration;ECx

　　在给定试验周期内 ,与阴性对照或溶剂对照相比 ,引起细胞活力 x%变化的受试物的浓度 。 3. 1.3

　　L-15完全培养基 L-15 completeculturemedium

　　LeibovitzL-15培养基中添加 5%胎牛血清和可选抗生素 。

　　注 : 常用的抗生素有 0. 5%庆大霉素 。

　　3. 1.4

　　L-15/ex培养基 L-15/ex medium

　　无蛋白培养基 ,含有与 LeibovitzL-15培养基相同的盐 、半乳糖和丙酮酸 。

　　注 : 用于细胞暴露试验 。

　　1

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　　3. 1.5

　　半数致死浓度 median lethalconcentration;LC50

　　在给定试验周期内 ,导致 50%受试生物死亡的受试物浓度 。

　　3. 1.6

　　最低可观察效应浓度 lowestobserved effectconcentration;LOEC

　　在给定试验周期内 ,与对照组相比 ,在统计学意义上对受试物产生显著效应(p小于 0. 05)的最低受试物浓度 。

　　3. 1.7

　　无可观察效应浓度 no observed effectconcentration;NOEC

　　在给定试验周期内 ,与对照组相比 ,在统计学意义上对受试物未产生显著效应(p大于或等于0. 05)的最高受试物浓度 。

　　3.2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　CFDA-AM :5-羧 基 荧 光 素 二 乙 酸 乙 酰 毒 性 甲 酯 (5-carboxyfluorescein diacetate acetoxy methyl ester)

　　DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)

　　FBS:胎牛血清(FetalBovine Serum)

　　PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)

　　3,4-DCA:3,4-二氯苯胺(3,4-Dichloroaniline)

　　4 试验原理

　　采用特别设计的无蛋白培养基(L-15/ex培养基)在 24孔板中培养融合单层的 RTgill-W1细胞 ,在黑暗环境中暴露于受试物中 24h。针对同一组细胞 ,采用三种不同的荧光指示染料检测细胞活力以表明细胞毒性 。三种染料包括 :基于刃天青的染料用于评估细胞代谢活性;CFDA-AM用于评估细胞膜的完整性 ; 中性红用于评估溶酶体膜的完整性 。 通过测定上述染料在培养基中的荧光来评估细胞活力 。在暴露开始(0h)和结束(24h)时对培养板孔中的暴露培养基进行浓度分析 , 以确定受试物实测浓度的几何平均值 。结果以受试物浓度组相对未暴露的对照组中细胞活力的百分比来表示 。 由此得到的浓度-效应曲线用于确定导致细胞活力损失 50%的效应浓度 , 即 EC50值 。也可获得其他效应参数 ,如由非线性回归得到的无毒浓度 ,或由假设检验(方差分析)得到的 LOEC或 NOEC。

　　5 受试物信息

　　受试物信息包括 :

　　a) 结构式 ;

　　b) 分子量 ;

　　c) 纯度 ;

　　d) 在试验条件下的稳定性 ;

　　e) 水中解离常数(pKa) ,具体方法见参考文献[3] ;

　　f) 按照 GB/T27860测定的有机碳分配系数(Koc) ,也可用其他方法测定的结果 ,见参考文献[2] ;

　　g) 按照 GB/T 21852或 GB/T 21853方法测定的正辛醇/水分配系数(Pow ) ;

　　h) 按照 GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229、GB/T 42426方法测定的蒸气压 ,并计算亨利常

　　2

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　　数 ,预测受试物挥发可能造成的损失 ;

　　i) 分析方法及相关参数(如准确度 、精密度 、检测限 、定量限 、特异性和线性范围) 。

　　6 参比物

　　在开展常规试验之前 ,应以 3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)为参比物 ,至少独立重复 3 次全浓度范围的试验 , 以表明实验室具备相关技术能力并检查 RTgill-W1细胞系的敏感性 。

　　7 试验准备

　　7. 1 仪器设备

　　7. 1. 1 生物安全柜 。

　　7. 1.2 培养箱 。

　　7. 1.3 显微镜 。

　　7. 1.4 真空泵 。

　　7. 1.5 荧光分析仪 。

　　7. 1.6 离心机 。

　　7. 1.7 细胞计数器 。

　　7. 1. 8 细胞培养瓶 。

　　7. 1.9 24孔板 。

　　7.2 试剂

　　按照附录 A 的方法配制用于细胞培养的 L-15完全培养基和用于试验的 L-15/ex培养基 。

　　7.3 细胞系

　　7.3. 1 细胞系的培养和传代

　　RTgill-W1细胞系于 19 ℃ ±1 ℃的条件下在细胞培养瓶中贴壁生长 ,不需要提供额外的二氧化碳或蒸汽 。 当细胞达到 90% ~ 100%的融合度时 ,进行传代 。 每 10 d~ 12 d 进行一次传代 ,通常以 1 ∶ 2的比例进行 。细胞经传 150代后应被弃用 ,解冻传代数较低的新细胞进行培养 。细胞系的培养 、传代和冻存方法见附录 B。

　　7.3.2 试验细胞的准备

　　从培养瓶中收集约 1×107个 RTgill-W1细胞 ,除了无细胞对照以外 ,每孔接种 1 mL含有 3. 5×105个细胞的 L-15完全培养基 。在接种过程中 ,应注意保持细胞悬液的均匀性 ,避免细胞沉降 。铺板 24 h后 ,通过显微镜观察确认细胞在每个孔内形成融合的单层 。如果在孵育 24 h 后尚未融合 , 可以在化学暴露前继续孵育 24h~48h。

　　8 试验程序

　　8. 1 试验条件

　　试验条件如下 :

　　a) 试验周期 :24h;

　　3

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　　b) 温度 :19 ℃ ±1 ℃ ;

　　c) 光照 :试验应在黑暗中进行 。

　　8.2 试验浓度的选择

　　试验的主要步骤流程见图 1。最高试验浓度的细胞活力与阴性对照或溶剂对照相比宜为 0% 。最低试验浓度宜对细胞不产生影响 , 即与阴性对照或溶剂对照相比细胞活力为 100% 。在正式试验之前进行预试验 ,从而选择适当的浓度范围 。预试验与正式试验相似 ,但设置浓度从受试物的水溶解度开始向下进行 10倍稀释 。 除了参考水溶解度之外 ,还可根据公式(1)的定量构效关系(QSAR) 来预测 EC50 (mmol/L) , 以便在最低预期毒性浓度附近选择测试范围 。

　　logEC50 =-0. 96(±0. 09)logKow + 1. 57(± 0. 28) …………………( 1 )

　　图 1 试验的主要步骤流程图

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　　8.3 细胞接种

　　每测试一种受试物需要一块 24孔板 , 同时为每批试验的阳性对照(3,4-DCA)额外准备一块单独的测试板 。从培 养 瓶 中 收 集 约 1× 107 个 RTgill-W1细 胞 , 24孔 板 除 无 细 胞 对 照 外(见 图 2) , 每 孔 接 入1 mL含有 3. 5×105个细胞的 L-15完全培养基 。在接种过程中 ,应注意保持细胞悬液的均匀性 ,避免细胞沉降 。铺板 24h后 ,通过显微镜进行观察 ,细胞应在每个孔内形成一个融合的单层(见图 3) 。如果在孵育 24h后尚未达到融合 ,可以继续孵育 24h~48h。

　　注 : 图中 A~D,1~ 6 为 24孔板上的序号 。

　　图 2 细胞接种到 24孔板的移液方案示意图(每孔接种体积 1 mL)

　　图 3 RTgill-W1细胞的融合单层图

　　5

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　　8.4 试验溶液的制备

　　8.4. 1 阳性对照物和受试物贮备液的制备

　　8.4. 1. 1 使用 DMSO作为溶剂时 ,3,4-DCA贮备液的浓度应为最终暴露浓度的 200倍 ,使试验溶液中有机溶剂的浓度不高于 0. 05 mL/L。制备 20 g/L的 DMSO贮备液 ,并以此为起点用 DMSO 连续稀释获得各浓度的贮备液 。3,4-DCA 的最高暴露浓度为 100 mg/L, 以 2倍间隔系数设置 6 个浓度 ,使孔中的暴露浓度为 100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12. 5 mg/L、6. 25 mg/L和 3. 13 mg/L。应在试验当天制备 3,4-DCA 的系列稀释溶液 。

　　8.4. 1.2 按照与阳性对照相同的程序准备受试物的有机溶剂贮备液 。设置 6 个试验浓度 , 间隔系数不应超过 2. 5。对于难测试物质 ,采用合适的方法配制贮备液 ,见参考文献[1] 。为了降低试验操作造成的化学损失和生物污染的风险(如长时间搅拌) , 可 使 用 有 机 溶 剂(如 DMSO、甲 醇 或 乙 醇) 配 制 贮 备 液 。若不使用有机溶剂 ,受试物应在无菌条件下直接溶解于 L-15/ex培养基中 , 获得浓度合适的受试物贮备液 。

　　8.4.2 阳性对照物和受试物试验溶液的制备

　　在无菌条件下用 L-15/ex培养基稀释贮备液制备试验溶液 。使用有机溶剂制备贮备液时 ,将已经梯度稀释的贮备液以 1 ∶ 200进行稀释 。如使用 L-15/ex培养基制备贮备液 ,用 L-15/ex培养基连续稀释贮备液至设置浓度 。试验溶液应在细胞暴露前新鲜制备 。

　　8.5 细胞暴露

　　铺板 24h后 ,通过显微镜对细胞进行观察 ,细胞应在每个孔内形成融合的单层 。移除 L-15完全培养基 ,用 1 mLL-15/ex培养基清洗所有孔 ,注意不要干扰细胞层 。移除 L-15/ex培养基 ,然后分别加入2. 5 mL暴露介质 :A1孔加入浓度最高的试验溶液(C1) ;A2和 A3孔只加入 L-15/ex培养基;A4~ D6孔在 3个平行孔中加入各浓度试验溶液 。使用有机溶剂时的 24孔板布局见图 4a) ,不使用有机溶剂时的 24孔板布局见图 4b) 。加入暴露介质后 ,立即从对照组和各浓度组的 3 个平行孔中转移 500 μL暴露介质到预先准备的取样瓶中 。用黏合箔或其他盖子覆盖多孔板 ,关闭盖子 , 于 19 ℃ ± 1 ℃的黑暗条件下孵育 24h。 以上操作均在无菌条件下进行 。

　　a) 使用有机溶剂时的 24孔板布局 b) 不使用有机溶剂时的 24孔板布局注 : 图中 A~D,1~ 6 为 24孔板上的序号 。

　　图 4 细胞暴露时的 24孔板布局图

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　　8.6 细胞活力测定

　　暴露结束后 ,从每孔中取 500 μL暴露介质至各取样瓶中进行化学分析 。移除剩余的暴露溶液 ,用1 mL PBS仔细清洗每个孔 ,注意不要干扰细胞层 。对细胞的损伤程度进行观察 。 图 5 中展示了暴露于阳性对照物 3, 4-DCA 中 的 细 胞 不 同 程 度 的 损 伤 。 移 除 PBS后 , 向 每 孔 中 加 入 400 μL 刃 天 青/ CFDA-AM工作溶液 。在 19 ℃ ±1 ℃黑暗中孵育 30 min后 ,用荧光分析仪读取刃天青染料的荧光(激发波长 :530 nm , 发 射 波 长 : 595 nm) , 其 后 测 定 CFDA-AM 的 荧 光 (激 发 波 长 : 493 nm , 发 射 波 长 : 541 nm)作为原始荧光单位 。移除刃天青/CFDAAM 工作溶液 , 每孔添加 400 μL的中性红工作溶液 。在19 ℃ ±1 ℃的黑暗中孵育 60 min后 ,移除中性红工作溶液 , 每孔用 400 μL 固定液洗涤 。 移除固定液 ,每孔加入 400 μL提取液 。将平板置于平板摇床上轻轻摇动 ,在室温下孵育 10 min,然后用荧光分析仪测定中性红的荧光(激发波长 :530 nm ,发射波长 :645 nm)作为原始荧光单位 。

　　7

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　　8

　　标引序号说明 :

　　a) — 阴性对照(100%代谢活性) ;

　　b) — 溶剂对照(100%代谢活性) ;

　　c) — 100 mg/L 3,4-DCA(2%代谢活性) ;

　　d) — 50 mg/L 3,4-DCA(12%代谢活性) ;

　　

　　e) — 25 mg/L 3,4-DCA(64%代谢活性) ;

　　f) — 12. 5 mg/L 3,4-DCA(81%代谢活性) ;

　　g) — 6. 25 mg/L 3,4-DCA(91%代谢活性) ;

　　h) — 3. 13 mg/L 3,4-DCA(96%代谢活性) 。

　　图 5 RTgill-W1细胞在阳性对照 3,4-DCA 中暴露 24h 后不同程度损伤的图片

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　　8.7 浓度分析

　　8.7. 1 在暴露期 开 始(0h) 和 结 束(24h) 时 对 细 胞 暴 露 介 质 进 行 取 样 , 并 对 受 试 物 浓 度 进 行 定 量 分析 , 以计算暴露浓度的几何平均值 。在特殊情况下 ,如受试物不稳定且浓度在 4 h或更短时间内急剧下降时 ,暴露时间可减少至 4 h。此时 ,在试验结束时(4h)对暴露介质进行取样 , 随后立即评估细胞活力 。

　　8.7.2 提前准备所需数量的取样瓶 ,可根据分析方案预装入有机溶剂 。每个浓度组的所有 3 个平行孔都应取样 。两个样品用于浓度分析 ,第三个样品作为备份 ,仅在意外情况下使用(如分析仪器故障或两个重复之间存在较大差异) 。也可对三个样品同时进行分析 。

　　9 数据分析和结果评价

　　9. 1 数据分析

　　利用获得的原始荧光单位估算毒性 ,统计试验组与对照组相比细胞活力的百分比 。如果将受试物溶解在有机溶剂中 ,则使用溶剂对照作为参照 。如果受试物溶解在不含有有机溶剂的 L-15/ex培养基中 ,则使用阴性对照作为参照 。细胞活力的计算方法如下 。

　　a) 测试板每孔的荧光单位减去相应无细胞对照孔的平均荧光单位 。

　　b) 计算试验浓度组的每个平行孔与各自相应对照组的细胞活力百分比 。将对照组荧光单位的平均值设为 100%(表示 100%的细胞存活) ,细胞活力计算如公式(2)所示 。

　　V …………………………( 2 )

　　式中 :

　　V — 细胞活力 ;

　　fs — 受试物孔的荧光单位 ;

　　fc — 相应对照组荧光单位的平均值 。

　　c) 计算各试验浓度组下细胞活力的平均值和标准差 ,并利用细胞活力进行浓度-效应曲线分析 。

　　9.2 结果评价

　　9.2. 1 以受试物实测浓度的几何平均值作为各浓度组中 3 个平行孔的共同暴露浓度 。A1孔(无细胞)的浓度可作为非生物化学损失的参考 。 以受试物实测浓度的几何平均值作为 x 轴 , 细胞活力的百分比为 y 轴 ,绘制非线性回归 S型浓度-效应曲线 ,设置最低(0. 0) 和最高(100. 0) 的约束条件 。使用适当的统计方法基于浓度-效应曲线计算 EC50值 ,可通过浓度-效应曲线确定 NOEC和 LOEC。

　　9.2.2 可根据细胞活力数据预测鱼类急性毒性的 LC50 。首先应报告试验中所有 EC50值 , 以其中的最低值作为鱼的 96h-LC50值 。

　　10 质量保证与质量控制

　　在试验结束时满足以下条件 ,试验结果有效 。

　　a) 2个无细胞对照孔(一个含有 L-15/ex培养基 ,另一个含有最高浓度受试物) 的原始荧光数据的变化不应超过 20% 。

　　b) 如使用有机溶剂溶解受试物 ,溶剂对照的细胞活力降低不应超过阴性对照的 10% 。

　　c) 阳性对照的平均 EC50 (基于理论浓度) ,应在以下 EC50标准差(SD)的 2. 5倍范围内 :

　　1) 刃天青 EC50 :43. 6 mg/L ± 6. 1 mg/L(2. 5倍范围为 :28. 4 mg/L~ 58. 9 mg/L) ;

　　2) CFDA-AM EC50 :62. 5 mg/L ± 18. 9 mg/L(2. 5倍范围为 :15. 3 mg/L~ 109. 8 mg/L) ;

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　　3) 中性红 EC50 :58. 6 mg/L ± 18. 6 mg/L(2. 5倍范围为 :12. 1 mg/L~ 105. 0 mg/L) 。

　　11 结果报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物 :

　　1) 单组分物质 :物理性状 、水溶解度以及其他相关的物理化学性质 ;化学标识 ,如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)名称或 CAS名称 ,CAS号 , 简化分子线性输入规范(SMILES)码或国际化合物标识(InChI)码 ,结构式 ,纯度等信息 ,在适当情况下提供杂质的化学鉴别信息 ;

　　2) 多组分物质 、不明复杂物质(UVCB) 和混合物 :宜尽可能提供各组分的化学鉴别信息(同单组分物质) 、含量和相关的物理化学特性 ;

　　3) 储存条件和稳定性 。

　　b) 细胞系的来源 、传代数和融合水平 。

　　c) 阴性/溶剂对照 :

　　1) 化学标识 ,如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC) 名称或 CAS名称 ,CAS号 ,简化分子线性输入规范(SMILES)码或国际化合物标识(InChI)码 ,结构式 ,纯度等信息 ;

　　2) 供应商 、订单号 、批号 ;

　　3) 现有范围内的储存条件和稳定性 ;

　　4) 选择有机溶剂的理由 、暴露介质中的最终有机溶剂浓度以及溶剂对照与阴性对照的百分比差 。

　　d) 阳性对照 :

　　1) 供应商 、订单号 、批号 ;

　　2) 纯度 、杂质的化学特性(如可行) ;

　　3) 每种细胞活力的 EC50值 。

　　e) 试验条件 :

　　1) 试验前接种细胞的计数方法和为确保细胞数均匀分布所采取的措施 ;

　　2) 使用的荧光分析仪(如型号) ,包括参数设置 ;

　　3) 贮备液和试验溶液的制备方法 ;

　　4) 试验浓度 、试验程序和暴露时间(如不同于推荐值) ;

　　5) 受试物浓度的分析方法及相关参数(如准确度 、线性范围 、检测限和定量限) 。

　　f) 试验结果 :

　　1) 暴露开始和结束时受试物的实测浓度及其几何平均值 ;

　　2) 每个试验浓度组的细胞活力的平均值和标准偏差 ;

　　3) EC50 的计算方法 ;

　　4) 受试物和阳性对照物的 EC50值及其 95%置信区间 ;

　　5) 细胞活力的浓度-效应曲线图 ;

　　6) 试验过程中可能影响结果的事件 ;

　　7) 应报告对本文件的所有偏离及相关解释 。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　试验培养基和试剂的配制

　　A. 1 细胞培养基的配制

　　L-15完全培养基的配制方法见表 A. 1,也可在不添加抗生素的情况下配制培养基 。

　　表 A. 1 L-15完全培养基的配制方法

　　组分

　　添加量

　　LeibovitzL-15培养基

　　FBS

　　庆大霉素

　　500 mL

　　25 mL

　　2. 5 mL

　　L-15完全培养基可于 4 ℃条件下最长保存 3个月 。

　　A.2 试验培养基的配制

　　L-15/ex培养基贮备液和培养基的配制方法见表 A. 2 和表 A. 3。

　　表 A.2 L-15/ex培养基贮备液的配制方法

　　试剂

　　添加量

　　保存条件和时间

　　盐溶液 A

　　80 g NaCl

　　4. 0 g KCl

　　0. 98 gMgSO4

　　0. 94 gMgCl2

　　用去离子水定容至 600 mL

　　高温高压灭菌室温保存 6个月

　　盐溶液 B

　　1. 4 gCaCl2

　　用去离子水定容至 100 mL

　　高温高压灭菌室温保存 6个月

　　盐溶液 C

　　1. 9 g Na2 HPO4

　　0. 6 g KH2PO4

　　用去离子水定容至 300 mL

　　高温高压灭菌室温保存 6个月

　　半乳糖溶液

　　9. 0 g 半乳糖

　　用去离子水定容至 100 mL

　　过滤灭菌(0. 2 μm)

　　分装为 12 mL

　　-20 ℃保存 6个月

　　丙酮酸钠溶液

　　5. 5 g 丙酮酸钠

　　用去离子水定容至 100 mL

　　过滤灭菌(0. 2 μm)

　　分装为 12 mL

　　-20 ℃保存 6个月

　　11

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　　表 A.3 L-15/ex培养基的配制方法

　　组分

　　添加量

　　盐溶液 A

　　60 mL

　　盐溶液 B

　　10 mL

　　盐溶液 C

　　30 mL

　　半乳糖溶液

　　10 mL

　　丙酮酸钠溶液

　　10 mL

　　用已灭菌的去离子水定容至 1 000 mL,在室温下最长保存 3个月 。

　　A.3 细胞活力测定试剂的配制

　　将 5 mg的 CFDA-AM 溶于 2. 32 mL DMSO 中 , 得 到 4 mmol/L 的 CFDA-AM 贮 备 液 。 将 其 以200 μL等量分装后在 -20℃下保存 。测定细胞代谢活性和细胞膜完整性的刃天青/CFDA-AM 工作液于试验当天新鲜配制 ,配制方法见表 A. 4。

　　表 A.4 刃天青/CFDA-AM 工作液的配制方法

　　组分

　　添加量

　　PBS

　　刃天青

　　CFDA-AM 贮备液

　　11. 4 mL

　　600 μL

　　12 μL

　　测定溶酶体膜完整性所使用的中性红工作液 、固定剂和提取液的配制方法见表 A. 5。

　　表 A.5 中性红工作液、固定剂和提取液的配制方法

　　试剂

　　组分

　　保存条件和时间

　　中性红工作液

　　11. 82 mL PBS

　　180 μL 中性红溶液

　　新鲜制备

　　固定剂

　　5 gCaCl2

　　6. 75 mL 37%甲醛

　　用去离子水定容至 1 000 mL

　　室温保存 6个月

　　提取液

　　500 mL 无水乙醇

　　10 mL 乙酸

　　用去离子水定容至 1 000 mL

　　室温保存 6个月

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　RTgill-W1细胞的传代和冻存

　　B. 1 细胞的质量保证措施

　　记录细胞的解冻 、传代 、冷冻和支原体检测 。

　　支原体检测 :永久性细胞系是支原体污染的常见目标 。支原体干扰细胞周期和细胞代谢 ,可能对细胞活性试验的敏感性产生影响 。 因此 ,宜定期(如每 3个月一次)检查支原体 。如遇可疑病例(如显微镜下异常外观或检测系统敏感性改变) ,立即对细胞进行检测 。若发现支原体污染 ,弃除受污染的细胞 ,重新解冻一批细胞 。

　　B.2 RTgill-W1细胞培养基础

　　RTgill-W1细胞贴壁生长 ,为单层培养 。 细胞系在细胞培养瓶中于 19 ℃ ± 1 ℃条件下繁殖 ,无需额外的 CO2 或蒸汽 。 当细胞达到 90% ~ 100%的融合度 , 即细胞培养瓶表面被完全覆盖时 ,可进行细胞传代 。通常按 1 ∶ 2 的比例进行传代(1个培养瓶传代 2个培养瓶) ,此时细胞可以每 10 d~ 12 d传代 一次 。在达到 150代后 ,弃除细胞 ,解冻传代数较低的新细胞 。

　　细菌 、真菌和酵母菌的污染会导致培养基浑浊和细胞死亡/脱落 。此时宜立即清除所有被污染的培养瓶和相关的培养基和溶液 ,并用消毒剂(如 70%乙醇或异丙醇)彻底清洁试验场所 。

　　B.3 RTgill-W1的形态

　　在低密度时 ,细胞呈不规则的细长形状 , 当达到融合状态时 , 细胞呈多边形形状并紧密排列 。 细胞不同时期的形态见图 B. 1。

　　标引序号说明 :

　　a) — 传代后 1 d 的细胞形态 ;

　　b)— 传代后 5 d 的细胞形态 ;

　　c) — 传代后 12 d 的细胞形态 。

　　图 B. 1 RTgill-W1细胞不同时期的形态

　　B.4 细胞培养的试剂和培养基准备

　　传代前解冻胰蛋白酶 ,将胰蛋白酶 、乙二胺四乙酸和 L-15完全培养基在培养箱中放置至少 1 h,使其温度调节至 19 ℃ ±1 ℃ 。L-15完全培养基的配制方法见表 A. 1。

　　细胞冷冻液的配制方法见表 B. 1。细胞冷冻液可于 -4℃下最长保存 3个月 ,新鲜配制时将其温度

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　　调节至 4 ℃后再使用 。

　　表 B. 1 细胞冷冻液的配制

　　组分

　　添加量

　　L-15完全培养基

　　FBS

　　DMSO

　　10 mL

　　1 mL

　　1 mL

　　B.5 RTgill-W1的传代

　　传代培养在室温下进行 , 因此宜快速进行相关操作 ,避免将细胞暴露在高温下的时间过长 。传代时室温不高于 25 ℃ 。

　　细胞传代的步骤如下 :

　　a) 在显微镜下检查细胞培养瓶中的细胞 ,如达到融合状态即可开始传代 ;

　　b) 吸出培养基 ;

　　c) 缓慢加入 1 mL乙二胺四乙酸 ,避免直接滴在细胞上 ;

　　d) 轻轻晃动培养瓶以浸润细胞 ;

　　e) 吸除乙二胺四乙酸上清液 ,重复步骤 c) 、d) 、e) ;

　　f) 第二次吸除乙二胺四乙酸后 ,加入 0. 7 mL胰蛋白酶 ,消化时间通常小于 1 min;

　　g) 轻轻拍打和晃动细胞培养瓶来促进细胞脱离 ;

　　h) 加入 5 mL L-15完全培养基终止消化 ;

　　i) 分散细胞团块 ,轻轻吹打以促进附着的细胞脱落 ;

　　j) 将细胞悬液转移到 15 mL离心管中 ,在 18 ℃ ~ 21 ℃离心 3 min;

　　k) 在不扰动细胞团块的情况下 ,尽量吸出上清液 ;

　　l) 将细胞团块分散到 10 mL L-15完全培养基中 ,用移液管上下吹打数次 ;

　　m) 将细胞悬液分别加入两个细胞培养瓶 ;

　　n) 加入 5 mL培养基 ,使终体积达到 10 mL;

　　o) 盖紧瓶盖 ,在 19 ℃ ±1 ℃的黑暗环境中培养细胞 。

　　宜定期(至少每 3 d) 用 显 微 镜 检 查 细 胞 的 形 态 和 微 生 物 污 染 情 况 。 5 d~ 7 d 后 更 换 培 养 基 , 每10 d~ 12 d进行一次传代 。

　　B.6 RTgill-W1的冻存和解冻

　　将多瓶细胞混合冻存 。宜将细胞重新悬浮在冷却的冷冻液中 ,并快速冷冻 , 以获得更高的解冻成功率 。新鲜制备的细胞冷冻液在使用前可置于 4 ℃ ±1 ℃环境中或置于冰上保存 。

　　细胞冻存的步骤如下 :

　　a) 细胞的消化和悬浮步骤见 B. 5;

　　b) 收集各培养瓶中的细胞悬液 ,在 18 ℃ ~ 21 ℃以 ≤875g 转速离心 3 min;

　　c) 吸出上清液 ;

　　d) 加入相应体积的冷 冻 液(每 个 培 养 瓶 1 mL) 并 分 散 细 胞 团 块 , 分 装 于 预 冷 的 冻 存 管 中(每 管1 mL) ;

　　e) 在 -80℃保存至少 24h(最长保存 6个月) ;

　　f) 在 -80℃下储存 24h后 ,转移并储存在液氮中 。

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　　细胞解冻的步骤如下 :

　　a) 准备 L-15完全培养基 ,调节温度至 19 ℃ ±1 ℃ ;

　　b) 将冻存管从液氮或 -80℃中取出 ;

　　c) 在约 20 ℃的水浴中迅速解冻细胞 ;

　　d) 将细胞转移到 15 mL离心管中 ;

　　e) 逐滴缓慢地加入 5 mL L-15完全培养基 ,并轻轻振荡 ;

　　f) 将细胞悬液转移到细胞培养瓶中(1个 75 cm2 或 2个 25 cm2 培养瓶) ,并添加培养基至 10 mL (75 cm2 培养瓶)或 5 mL(25 cm2 培养瓶) ;

　　g) 放入培养箱中于 19 ℃ ±1 ℃条件下培养 ;

　　h) 24h 内更换培养基 。

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　　参 考 文 献

　　[1] OECD No. 23 (Second Edition) Guidance Document on Aqueous-Phase Aquatic Toxicity Testing ofDifficultTestChemicals,OECD series on testing and assessment,Paris: OECD,2019.

　　[2] OECD No. 106Adsorption-Desorption Using a Batch Equilibrium Method. OECD Guidelines for the testing of chemicals,Paris: OECD,2000.

　　[3] OECD No.112Dissociation Constantsin Water.OECD Guidelines forthe testing of chemicals,Paris: OECD,1981.

　　[4] OECD No. 249 Fish CellLine Acute Toxicity:The RTgill-W1 cellline assay. OECD Guide- lines for the testing of chemicals,Paris: OECD,2021.

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