GB/T 46140-2025 化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46140—2025

　　化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻

　　毒性试验

　　Chemicals—Water-sedimentmyriophyllum spicatum toxicitytest

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46140—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 试验原理 2

　　5 受试物信息 2

　　6 参比物 3

　　7 试验材料和条件 3

　　8 试验程序 4

　　9 质量保证与质量控制 7

　　10 数据统计 8

　　11 试验报告 9

　　附录 A (资料性) 穗状狐尾藻的描述 11

　　附录 B (规范性) 培养基和沉积物的配制 12

　　参考文献 13

　　Ⅰ

　　GB/T 46140—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 、科之 华 检 验 检 测(福 建) 有 限 公 司 、中 检 科 健(天 津) 检 验 检 测 有 限 责 任 公 司 、生态环境部南京环境科学研究所 、中国化工经济技术发展中心 。

　　本文件主要起草人 :许玫英 、陈桂兰 、王青柏 、窦从从 、柳燕贞 、刘晓建 、高亮 、刘纯新 、马燕 、曾绮文 、吴文铸 、王雪芬 、曾国驱 、梁嘉慧 、崔毅 、张玉玲 、邓豪健 、李贝贝 、梁银秀 、苏佩怡 、张雅静 、张春利 、安超 。

　　Ⅲ

　　GB/T 46140—2025

　　引 言

　　环境毒理学和化学学会(Society of Environmental Toxicology and Chemistry) 关于农药水生大型植物风险评估研讨会发布的指南建议 ,如果已知某些受试化学品对浮萍和藻类的作用方式不敏感或者预测化学品易分配在沉积物中并通过根系吸收产生暴露 , 可测试受试化学品对大型根系植物的毒性 。如果需要获取水下生根双子叶植物物种的毒性数据 ,穗状狐尾藻可作为首选受试物种 。本文件不能代替其他水生毒性试验 ,但可作为补充以及解决水生植物风险问题的更高层级策略 ,有助于开展更完整的水生植物危害和风险评估 。此外 ,本文件提供的试验方法也是无沉积物穗状狐尾藻试验的良好补充 。

　　在静态条件下 ,通过水柱脉冲程序将穗状狐尾藻暴露于受试化学品的水-沉积物系统的试验方法已通过实验室间比对验证 ,该测试方法也可应用于半静态或脉冲剂量情景下的加标沉积物或水相暴露 。本文件未对其他物种的测试方法进行详细阐述 ,但可修改相关测试条件 、方法设计和暴露时间 ,使其应用于其他生根 、沉水和挺水物种 ,如粉绿狐尾藻和水甜茅 。使用替代的物种 ,可能需要更多的摸索以确定适合的试验程序 。

　　本文件描述的试验方法适用于比对验证报告中已得到验证的受试物 、制剂 、商业产品或已知混合物 , 以满足由潜在受试物分配到沉积物中或因作用模式/敏感性问题而引发的新的数据要求 。开展测试的具体原因将决定试验的暴露途径(即通过水相或沉积物暴露) 。如果采用本方法对混合物开展测试并将获得的数据用于监管时 ,需考虑试验结果是否充分且有效 , 如果有法规明确规定可对混合物进行测试 ,则可直接采用本文件 。

　　Ⅳ

　　GB/T 46140—2025

　　化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻

　　毒性试验

　　1 范围

　　本文件规定了化学品水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验的试验原理 、受试物信息 、参比物 、试验材料和条件 、试验程序 、质量保证与质量控制 、数据统计和试验报告 。

　　本文件适用于评价化学品对生长在水-沉积物标准介质(水 、沉积物和营养液)中的根系水生植物穗状狐尾藻活力的影响 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 21801

　　化学品

　　快速生物降解性 呼吸计量法试验

　　GB/T 21802

　　化学品

　　快速生物降解性 改进的 MITI试验(I)

　　GB/T 21803

　　化学品

　　快速生物降解性 DOC消减试验

　　GB/T 21831

　　化学品

　　快速生物降解性 :密闭瓶法试验

　　GB/T 21845

　　化学品

　　水溶解度试验

　　GB/T 21852

　　化学品

　　分配系数(正辛醇-水) 高效液相色谱法试验

　　GB/T 21853

　　化学品

　　分配系数(正辛醇-水) 摇瓶法试验

　　GB/T 21855

　　化学品

　　与 pH 有关的水解作用试验

　　GB/T 21856

　　化学品

　　快速生物降解性 二氧化碳产生试验

　　GB/T 21857

　　化学品

　　快速生物降解性 改进的 OECD筛选试验

　　GB/T 22052 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法

　　GB/T 22228 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 1 Pa至 105 Pa范围内的测定 静态法

　　GB/T 22229 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在 10- 3 Pa至 1 Pa范围内的测定 蒸气压平衡法

　　GB/T 27850 化学品 快速生物降解性 通则

　　GB/T 42426 化学品 蒸气压试验

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　水-沉积物系统 water-sedimentsystem

　　实验室利用水相培养基和人工土建立的水-沉积物试验系统 。

　　注 : 用于模拟穗状狐尾藻在野外的生长情况 。

　　1

　　GB/T 46140—2025

　　3.2

　　测量变量 measurementvariable

　　试验过程中被测量或被记录的变量 。

　　注 : 指穗状狐尾藻整株植物的茎长 、茎鲜重和茎干重 。

　　3.3

　　平均比生长率 averagespecificgrowth rate

　　试验期间穗状狐尾藻测量变量的对数增长率 。

　　注 : 用 μ 表示 。

　　3.4

　　生物量增长量 yield

　　试验期间穗状狐尾藻茎长 、茎鲜重和干重的变化 。

　　注 : 即一定试验周期内(如 14 d)最终测量值与最初测量值之差 。

　　3.5

　　响应变量 responsevariable

　　试验中需要关注或解释的目标变量 。

　　注 : 又称因变量 , 随测量变量的变化而变化 ,指穗状狐尾藻的平均比生长率和生物量增长量 。

　　3.6

　　效应浓度 effectconcentration;ECx

　　在给定测试周期内 ,与对照组相比 ,导致 x%受试生物出现某观察效应的受试物浓度 。 3.7

　　最低可观察效应浓度 lowestobserved effectconcentration;LOEC

　　给定测试周期内 ,与对照组相比 ,在统计学意义上对受试生物产生显著效应(p小于 0. 05)的最低受试物浓度 。

　　3. 8

　　无可观察效应浓度 no observed effectconcentration;NOEC

　　给定测试周期内 ,与对照组相比 ,在统计学意义上对受试生物未产生显著效应(p不低于 0. 05)的最高受试物浓度 。

　　4 试验原理

　　将健康 、未开花的穗状狐尾藻的顶芽种植于标准化的人工沉积物中 ,待根系形成后 ,将植物移植于一系列浓度的受试物溶液或者加标沉积物中 ,在受控的环境条件下继续培养 14 d。受试物对植物生长的影响可通过测定茎长 、茎鲜重和茎干重进行评估 , 以及对黄化 、坏死或生长畸形等症状的观察来确定 。通过茎长 、茎鲜重和茎干重计算平均比生长率(r) 和生物量增长量(y) , 由平均比生长速率和增长量分别确定 ErCx (例如 ErC10、ErC20、ErC50)和 Ey Cx (例如 Ey C10、Ey C20、Ey C50) 。根据需要可通过平均比生长率和生物量增长量获得 LOEC和 NOEC。

　　5 受试物信息

　　受试物信息包括 :

　　a) 按照 GB/T 21845方法测定的水中溶解度 ;

　　b) 按照 GB/T 21852 或 GB/T 21853方 法 测 定 的 正 辛 醇-水 分 配 系 数 或 关 于 分 配 行 为 的 其 他信息 ;

　　2

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　　c) 按照 GB/T 21855方法测定的水解作用 ;

　　d) 按照 GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229、GB/T 42426方法测定的蒸气压 ;

　　e) 关于生物或非生物降解性的信息 ,如按照 GB/T 21801、GB/T 21802、GB/T 21803、GB/T 21831、 GB/T 21856、GB/T 21857、GB/T 27850测定的快速生物降解性试验结果 ;

　　f) 光稳定性或在水中/试验介质中的稳定性 ;

　　g) 解离常数 ;

　　h) 应具备已知准确度 、精密度和灵敏度的分析方法 , 明确体系中受试物的定量限 ,并提供详细的样品前处理和储存方法 。

　　6 参比物

　　定期 使 用 参 比 物 , 如 3, 5-二 氯 苯 酚 (3, 5-DCP) 检 查 试 验 程 序 的 有 效 性 。 验 证 试 验 数 据 表 明3,5-DCP 对穗状狐尾藻不同响应变量的平均 EC50值应在 4. 7 mg/L~ 6. 1 mg/L范围内 。宜每年对参比物开展 2 次试验 ,如果测试频率较低 ,可在进行正式试验的同时进行参比物试验 。

　　7 试验材料和条件

　　7. 1 仪器设备

　　除实验室常规仪器设备外 ,还需要以下设备 :

　　a) 人工气候培养箱或生长室 ,其日照长度 、光照和温度应可控 ;

　　b) 分析天平(0. 1 g) ;

　　c) pH 计(0. 1 pH) ;

　　d) 溶解氧测定仪(1%) ;

　　e) 温度记录仪 ;

　　f) 照度计 ;

　　g) 玻璃缸或玻璃烧杯(推荐规格 :2 L烧杯 ,高约 240 mm ,直径约 110 mm) ,试验容器应有足够的水深满足植物无限生长 ,并使植物在整个试验期间浸没在水中 ,其他较大的容器也可适用 ,其尺寸大小应与设计的试验体系相符合 ;

　　h) 塑料或玻璃培养钵 ,其尺寸大小应与设计的试验体系相符合(在测试疏水性物质或正辛醇-水分配系数较高的物质时宜选用玻璃材质 ,推荐体积 :约 500 mL,高约 80 mm ,直径约 90 mm) ;

　　i) 电热鼓风干燥箱 。

　　7.2 试验生物

　　7.2. 1 穗状狐尾藻植株可从野外采集 、供应商处购买或实验室繁殖获得 ,穗状狐尾藻的具体描述见附录 A。如果来源于野外或购买获得 ,应记录植物的来源 ,并核实物种的信息 。从野外采集穗状狐尾藻时 , 当采集地是与其他多叶藻杂交的地区时 ,应确保获得正确的物种 ,宜使用经过验证的已知来源的实验室培养物 ,不应使用污染过的或从已知被污染的地方收集的植物 。

　　7.2.2 在试验前 ,植物应在与试验条件相似 但 不 一 定 完 全 相 同 的 条 件 下 培 养/驯 化 一 段 时 间(如 大 于2周) 。开花的培养植物不应用于试验 。

　　7.3 试验条件

　　试验中使用暖和/或冷白荧光灯来提供光辐照度(波段为 400 nm~ 700 nm) ,对光依赖型过氧化物除草剂进行测试时 ,所使用的实验室照明应包含与 自然阳光中相同的太阳紫外线成分 。水面光照强度

　　3

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　　为 120 μE/(m2 · s) ~ 160μE/(m2 · s) ,在实验区域内光照强度的任何偏差不应超过 ±15% 。 光周期为 16h,试验水温控制在 18 ℃ ~ 22 ℃ ,植物生长的最佳 pH 为 7. 5~ 8. 0。试验过程中对照组 pH 的增加不应超过 1. 5个单位 , 当可以证明满足规定的有效性标准时, pH 变化超过 1. 5 个单位的偏差不影响试验的有效性 。

　　8 试验程序

　　8. 1 试验浓度的设计

　　8. 1. 1 试验浓度的设计通常遵循几何级数 ,试验浓度之间的间隔系数不应超过 3. 2, 至少设置 5 个浓度组 ,每个浓度组应包含至少 4个平行 ,未经处理的对照组应包含至少 6个平行 。根据预试验的结果选择合适的浓度范围 ,最高试验浓度不应超过受试物的水溶解度 ;制剂类的受试物 ,最高试验浓度不应超过试验条件下该物质的分散性 。

　　8. 1.2 为获得确定的 ECx 值 , 可以改变试验设计 , 如增加试验浓度的数量和减少每个浓度的平行数 。试验的浓度范围应包含 ECx 值以确保适当的置信水平 。例如 ,最高试验浓度组应大于 EC50 的预估值 。如果 EC50值在试验浓度范围之外 ,相关的置信区间范围将较大 ,可能无法对模型的统计拟合进行有效性评估 ,设置更多数量的试验浓度组有利于获得高质量的 ECx 值和置信区间 。

　　8. 1.3 为获得 LOEC/NOEC(可选终点) ,最低试验浓度组应足够低 , 以确保处理组植株的生长与对照组无显著差异(p大于 0. 05) 。此外 ,最高试验浓度组应足够高 ,使浓度组植株的生长显著低于对照组(p小于 0. 05) 。设置更多的平行有利于提高方差分析的统计能力 。

　　8.2 限度试验

　　当预试验结果表明 ,受试物质量浓度高达 100 mg/L或受试物在试验培养基中达到其溶解度极限或可分散性极限的情况下对生长无不利影响时 , 可开展质量浓度为 100 mg/L或受试物溶解度极限或1 000 mg/kg干沉淀物的 1个试验浓度组和 1个对照组在内的限度试验 。宜将每个对照组和试验组的平行数量增加至不少于 6个 。对照组和试验组的植物增长可使用如 t检验比较平均值 。

　　8.3 试验体系的设计

　　8.3. 1 每个试验容器代表 1个包含 3个顶芽的平行 ,有下列方法可以确保每个容器中有 3株顶芽 :

　　a) 试验设计 A:1株顶芽/培养钵 ,3个培养钵/试验容器 ;

　　b) 试验设计 B:3株顶芽/培养钵 ,1个培养钵/试验容器 ;

　　c) 可接受每个培养钵 1株顶芽 ,每个容器 1个培养钵的试验设计 ,应对平行数进行调整以达到所需的有效性标准 。

　　8.3.2 每个试验容器应随机分配到不同的处理组 ,对试验区域中试验容器的位置进行随机设计 , 以尽量减少光照强度或温度的空间差异造成的影响 。

　　8.4 试验溶液的配制

　　8.4. 1 通过稀释贮备液的方法配制试验溶液 ,将受试物溶解或分散在斯马特-巴尔科(Smart-Barko) 培养基(见附录 B)中 ,使用蒸馏水或去离子水配制 。

　　8.4.2 对于低水溶性的受试物 ,可能需要使用有机溶剂或分散剂配制受试物贮备液以便受试物精确地添加到试验介质中并帮助其分散和溶解 ,但应尽量避免使用助溶剂或分散剂 。

　　8.4.3 使用的助溶剂 或 分 散 剂 不 应 产 生 植 物 毒 性 , 常 用 助 溶 剂 如 丙 酮 和 二 甲 基 甲 酰 胺 , 在 浓 度 高 达

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　　100 μL/L时不会引起植物毒性 。

　　8.4.4 如果使用助溶剂或分散剂 ,应报告其最终浓度并保持在最低水平(不大于 100μL/L) 。所有的浓度组和溶剂对照组应包含相同浓度的助溶剂或分散剂 ,不含助溶剂或分散剂的对照组也应纳入试验设计中 。助溶剂或分散剂的使用可参考 OECD难测试化学品水生毒性试验指南 。

　　8.5 预培养阶段

　　8. 5. 1 从植株上剪下健康的芽尖/顶芽 ,无侧枝 ,长度为 50 mm~ 60 mm。如果采用试验设计 A(1株顶芽/培养钵 ,3 个培养钵/试验容器) ,在每个培养钵内植入 1 株穗状狐尾藻顶芽 ; 如果采用试验设计 B (3株顶芽/培养钵 ,1个培养钵/试验容器) ,在每个培养钵内种植 4株 ~ 5 株穗状狐尾藻顶芽 。

　　8.5.2 在 8. 5. 1 的两种情况下 ,应有足量的培养钵植入多余的顶芽以备在试验开始时选择生长一致的植物 , 以及提供备用植物以便在试验开始前用于检查根系的生长发育情况 ,备用植物将在第 0 天用于茎质量和长度的测量 。

　　8.5.3 顶芽被插入到沉积物表面以下约 30 mm , 至少覆盖 2 个茎节 。将培养钵转移至试验容器中 ,置于试验暴露相同的环境条件下 ,在斯马特-巴尔科培养基中预培养 7 d, 以诱导根系发育 。

　　8.5.4 预培养 结 束 后 , 应 将 多 余 植 株 移 走 , 以 检 查 根 系 生 长 情 况 。 如 果 根 生 长 不 可 见 (即 根 尖 不 可见) ,应将预培养阶段延长 ,直至根生长可见 , 宜采取该步骤以确保植株在试验启动时处于良好的生长状态 。

　　8.5.5 对于试验设计 A(1株顶芽/培养钵 ,3个培养钵/试验容器) ,在试验开始前挑选植物生长一致的培养钵 ;对于试验设计 B(3株顶芽/培养钵 ,1 个培养钵/试验容器) , 多余的植株将被移除 , 留下 3 株大小和外观一致的植株 。

　　8.6 试验方式的选择

　　试验方式的选择因受试物而异 ,应考虑受试物在水-沉积物系统中的可能变化 , 以此来决定试验中使用的暴露途径 ,常用的受试物暴露途径包括通过水相的暴露(加标水)和通过沉积物(加标沉积物) 的暴露 。例如 ,对于易显著分配到沉积物中的受试物 ,加标沉积物的方式可能是首选 。此外 ,应根据受试物在水相或沉积物中的浓度变化情况选择静态或半静态的方式更新加标水或加标沉积物 ,如果受试物浓度在试验期间不能保持在理论浓度或初始浓度的 80% ~ 120%范围内 ,应开展半静态试验 。

　　8.7 通过水相的暴露

　　8.7. 1 可先将 相 应 量 的 受 试 物 加 入 试 验 培 养 基 中 , 也 可 将 受 试 物 直 接 加 入 装 有 培 养 基 的 试 验 容 器中 ,应注意确保受试物均匀地分布在整个试验系统中 ,且不扰动沉积物 。允许一次性配制好所有平行的受试物试验溶液 ,在测试开始时记录试验溶液的外观(如澄清 、浑浊等) 。

　　8.7.2 根据试验设计的要求 ,选择植物生长一致的培养钵放入试验容器中 ,将斯马特-巴尔科培养基添加至试验容器中 ,该操作应避免扰动沉积物 ,为此可用漏斗加入培养基(如有需要可在此过程用塑料圆盘覆盖沉积物 ,倒入培养基后立即取出) ,或者在添加培养基后 ,将培养钵置于试验容器中 。应尽量减少藻类和细菌的潜在积聚 ,如果有必要可在暴露阶段开始时使用新鲜培养基 。

　　8.7.3 在添加培养基前或添加培养基后 ,应测量沉积物上方的茎长 。

　　8. 8 通过沉积物的暴露

　　8. 8. 1 受试物溶解在去离子水中 , 向新鲜沉积物中添加受试物溶液 ,通过轧机 、搅拌机或手工搅拌 ,充分混合制备所需浓度的加标沉积物 。如果受试物难溶于水 ,可将其溶解在尽可能小体积的合适的有机

　　5

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　　溶剂中(如正己烷 、丙酮或氯仿) ,将该溶液与约 10 g 细石英砂混合 ,待溶剂挥发后 ,将沙子与每个试验容器中适量的沉积物混合 ,只有易挥发的溶剂才可用于溶解 、分散或乳化受试物 。 在最终制备沉积物时 ,应考虑掺有受试物的沙子的体积/质量(即沉积物应使用较少的沙子制备) 。应确保添加到沉积物中的受试物均匀分布 。

　　8. 8.2 从预培养阶段中取出生长一致且具备充足根系的植株植入到已装有加标沉淀物的装入培养钵中 ,将培养钵放入试验容器中 ,加入斯马特-巴尔科培养基(如使用漏斗) ,避免扰动沉积物 。

　　8. 8.3 在添加培养基前或添加培养基后 ,测量沉积物上方的芽长 。

　　8.9 试验环境条件的维持和测定

　　8.9. 1 应 记 录 最 终 溶 液 体 积 , 并 在 每 个 试 验 容 器 上 标 记 水 位 。 如 果 在 测 试 过 程 中 水 分 蒸 发 超 过10% ,则应补充蒸馏水至水位 ;如有必要 ,可用透明盖子(如透明塑料盖)覆盖容器 , 以尽量减少水分蒸发和藻类的污染 。上覆水水深应高于沉积物顶部 120 mm ,并应分别记录沉积物的表面积/体积和上覆水面积/体积的比值 。

　　8.9.2 额外准备试验容器并加入培养基 ,置于相同的环境条件下 ,每天记录试验容器所在环境如培养箱 、人工气候室的温度 ,每天至少记录 1 次 ,也可用温度记录仪连续记录试验环境的温度 。

　　8.9.3 在 试 验 开 始 和 试 验 结 束 时 , 测 定 所 有 试 验 容 器 的 溶 解 氧 和 pH , 此 外 , 在 试 验 期 间 至 少 测 定1 次 , 每次测定应在当天的同一时间段进行 。如果试验开始时(0d)配制了不同浓度的试验溶液分装至不同平行容器中 ,可只测定分装前不同浓度试验溶液的溶解氧和 pH。

　　8.9.4 在试验开始或试验过程中 ,至少测定 1 次光照强度 ,应在生长箱 、培养箱或房间中与容器内水位等高的位置上测定光照强度 。光照强度的测定方法和测定值与传感器的类型相关 ,对多点光源的环境条件 ,球形传感器(对测量平面上下所有角度的光作出响应)和余弦传感器(对测量平面上方的所有角度的光作出响应)优于单向传感器 。

　　8. 10 生长指标的分析测定

　　8. 10. 1 在预培养阶段结束后至试验开始前(即第 0 天) ,从备用的植株中随机选择 5 个培养钵(3株/培养钵)或 15个培养钵(1株/培养钵) ,评估茎长 、茎鲜重和茎干重 。

　　8. 10.2 当植株植入暴露体系后 ,相关指标测定如下 :

　　a) 试验期间或至少在试验结束时(第 14天) ,测定和记录茎长 、侧枝数量和侧枝的长度 ;

　　b) 暴露过程中至少观察和记录 3 次(如 0 d、7 d、14 d)植物生长和健康状况 ;

　　c) 试验结束时(如第 14天) ,测定和记录茎的鲜重和干重 。

　　8. 10.3 可用游标卡尺测量茎长 ,如果存在侧枝 , 同时记录侧枝的数量和长度 。试验过程中观察和记录植物的外观和试验培养基的状况以对植物的健康状况进行评估 。观察结果包括 :

　　a) 黄化 、坏死或者其他变色现象 ,如与对照组植株相比过度变红 ;

　　b) 细菌或藻类污染 ;

　　c) 生长异常 ,如发育迟缓 、节间长度改变 、茎/叶扭曲 、侧芽增殖 、叶片损失 、萎缩和茎断裂 ;

　　d) 试验结束时 ,仔细清洗根部的沉积物以对根部系统的健康状况进行评估 , 与对照组相比 ,是否存在根系缺失 、减少 、根系发育适中或根系发育良好 ,与对照组相似 。

　　8. 10.4 在试验开始和结束时 ,对茎鲜重进行评估 。在沉积物水平上切割枝条 ,去除可能黏附在芽基部的沉积物颗粒 , 吸干水分后称鲜重 ,将植株放入约 60℃干燥箱中烘干至恒重 ,称量并记录干重 。测试期间所需的最低生物学评估见表 1。

　　6

　　GB/T 46140—2025

　　表 1 相关指标的观察和测定时间表

　　暴露时间/d

　　观察指标

　　茎长 、侧枝的长度和数量

　　观察评估茎的生长发育

　　茎鲜重和干重 ,评估根系的发育

　　pH 和溶解氧

　　0

　　√

　　√

　　√

　　√

　　4

　　―

　　―

　　―

　　―

　　7

　　―

　　√

　　―

　　√

　　14

　　√

　　√

　　√

　　√

　　注 1: √ 表示应开展相关指标的观察和测定 。

　　注 2: ―表示相关指标的观察和测定为可选 。

　　8. 11 受试物浓度分析

　　8. 11. 1 应通过分析受试物的暴露浓度确定受试物的正确施用量 。在试验开始后不久(浓度稳定的受试物于试验当天 ,浓度不稳定的受试物于试验开始 1 h 内) 以及试验结束时 ,采集所有试验浓度组水样进行浓度分析 。

　　8. 11.2 除非已知受试物在水中稳定(大于理论浓度的 80%) ,在试验开始和试验结束时应测定沉积物和沉积物孔隙水中的受试物浓度 ,至少测定最高试验浓度组 。如果已有在类似条件下(例如沉积物与水的比例 、使用方法 、沉积物类型)的研究已明确受试物在水-沉积物之间的分配行为 ,则无需对沉积物和孔隙水进行浓度分析 。

　　8. 11.3 整个试验过程中对沉积物取样用于试验开始 、中期(如有必要) 和试验结束时的浓度分析 ,可能会破坏试验系统或导致取样后剩余的沉积物系统量不足 ,此时应设置更多额外处理的试验容器用于分析测定 。额外试验容器的准备方式与生物试验所用的试验容器完全相同 。

　　8. 11.4 可通过离心获得间隙水 ,如在 4 ℃条件下 10 000g离心 30 min。如果已证明受试物不被滤膜吸附 ,也可采用过滤的方式 。如果样本量太小 ,可能无法分析孔隙水中的受试物浓度 。

　　8. 11.5 半静态试验中 ,每次更换溶液时 ,应对新配制的试验溶液和旧试验溶液进行采样和受试物浓度分析 。如果受试物的初始实测浓度不能达到理论浓度的 80% ~ 120%范围内 ,但有证据表明初始浓度是可重复且稳定的(即维持在初始浓度的 80% ~ 120%范围内) ,可只测定最低和最高的试验浓度组 。

　　8. 11.6 只需对每个浓度下的其中 1 个平行容器进行受试物浓度的测定 ,也可将每个浓度所有平行的试验溶液混合后用于浓度分析 。

　　8. 11.7 如果已有证据表明 ,在整个试验过程中 ,受试物的实测浓度能够保持在理论浓度或初始浓度的80% ~ 120%范围内 ,可基于理论浓度或初始浓度进行数据处理和毒性终点的估算 ,此时效应浓度应基于理论浓度或测定的初始浓度 。如果有证据表明受试物浓度在试验过程中出现了下降(即浓度组的实测浓度不能保持在理论浓度或初始浓度的 80% ~ 120%范围内) ,毒性效应浓度应基于暴露期间实测浓度的时间加权平均值或 受 试 物 浓 度 下 降 模 型 获 得 的 统 计 值 , 更 多 关 于 受 试 物 效 应 浓 度 的 计 算 可 参 考OECD难测试化学品水生毒性试验指南 。

　　9 质量保证与质量控制

　　试验有效性应满足以下条件 :

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　　GB/T 46140—2025

　　a) 试验期间 ,对照组的平均总茎长和茎总鲜重至少是试验开始时的 2倍 ;

　　b) 对照组植物不得出现任何黄化的症状 ,沉积物和试验培养基无明显藻类和/或细菌等其他生物的污染 ;

　　c) 从试验开始到试验结束 ,对照组平行之间植物茎鲜重生物量变异系数的平均值不超过 35% 。

　　10 数据统计

　　10. 1 响应变量

　　10. 1. 1 如果使用了助溶剂或分散剂 ,助溶剂对照组和未经处理的对照组的结果在统计学上无显著差异时 ,助溶剂对照组和未经处理的对照组的数据可合并用于统计分析 。采用平均比生长率和生物量增长量作为响应变量评估受试物对植物生长的影响 。

　　10. 1.2 平均比生长率是基于对照组和每个处理组的总茎长 、总茎鲜重和总茎干重随时间的对数变化 。对照组和处理组的每个平行均需统计 ,按照公式(1)计算每个试验容器(平行)的 3株植物的平均长度和质量以及随后每个平行的生长速率 。

　　μi-j …………………………( 1 )

　　式中 :

　　μi-j— 从 i时间 ~j 时间的平均比生长率 ;

　　Nj — 在时间 j 时处理组或对照组的测量变量 ;

　　Ni — 在时间 i时处理组或对照组的测量变量 ;

　　t — 从i~j 的时间 ,单位为天(d) 。

　　10. 1.3 应计算整个试验周期每个处理组和对照组中的生长率平均值和标准差 ,按照公式(2) 计算每个试验浓度(处理组)的生长抑制百分率(Ir) 。

　　Ir …………………………( 2 )

　　式中 :

　　Ir — 平均比生长率的抑制率 , % ;

　　μc— 空白对照组的平均比生长率 ;

　　μt— 处理组的平均比生长率 。

　　10. 1.4 基于对照组和每个处理组总茎长 、总茎鲜重和总茎干重随时间的变化 ,按照公式(3) 计算生物量增长量抑制百分率(Iy) 。

　　Iy …………………………( 3 )

　　式中 :

　　Iy — 生物量抑制百分率 , % ;

　　bc — 空白对照组最终生物量与初始生物量之差 ;

　　bt — 处理组的最终生物量与初始生物量之差 。

　　10.2 绘制浓度-效应曲线

　　10.2. 1 根据穗状狐尾藻的平均比生长率抑制率(Ir) 和生物量增长量抑制率(Iy) , 以浓度对数为横坐标 ,绘制受试物的浓度-效应曲线 。

　　10.2.2 基于总茎长 、总茎 鲜 重 和 总 茎 干 重 的 平 均 比 生 长 率(ErCx ) 和 生 物 量 增 长 量(Ey Cx ) 分 别 估 算ECx 值 。应注意的是 ,使用这两个响应变量计算获得的 ECx 值不具有可比较性 。 由于各自方法的数学

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　　基础不同 ,在遵守本文件测试条件下 ,基于平均比生长率的 ECx 值(ErCx ) 在大多数情况下高于基于生物量的 ECx 值(Ey Cx ) ,这种差异不是两个响应变量之间的敏感性差异 ,仅在数值上存在区别 。

　　10.2.3 通过回归 分 析 获 得 的 浓 度-效 应 关 系 , 在 对 响 应 数 据 进 行 线 性 化 转 换 后 , 可 使 用 加 权 线 性 回归 ,例如将其转换为 Probit、Logit或 Weibull单位 ,但非线性回归是处理数据不规则和偏离平滑分布的首选方法 ,接近零抑制或完全抑制时 ,这种不规则可能会因转换放大而干扰统计分析 。Probit、Logit或Weibull转换的标准分析方法适用于不连续的数据(如死亡率或生存率) , 而更多关于如生长率或生物量之类的连续数据的 ECx 值计算方法可参考 OECD生态毒性数据统计分析方法应用指南 。

　　10.2.4 每个需要分析的响应变量 ,可通过浓度-响应关系的点估计方法计算 ECx 值 ,确定其 95%置信区间 ,并应以图形或统计的方式评估响应数据对回归模型的拟合度 。 回归分析应使用每个平行的效应值 ,而非平均值 。如果可用的回归模型/方法对数据不适用 ,也可使用线性插值方法获得 EC50值和置信区间 。

　　10.2.5 使用方差分析方法(ANOVA)对每个处理组的平均值与空白组的平均值进行比较 ,通过适当的比较方法(如 Dunnett’s或 Williams’s检验) 获得 LOEC和 NOEC。检验方差分析(ANOVA) 中的正态分布和方差齐性假设是否成立 ,可分别采用 Shapiro-Wilks检验和 Levene’s检验 ,不满足正态分布和方差齐性的假设可通过数据的对数变换来校正 。如果方差不齐和/或偏离正态分布 ,且不能通过变换加以校正 ,则应考虑采 用 Bonferroni-Welch-t检 验 、递 减 Jonkheere Terpstra检 验 、Bonferroni-Median检验等方法进行分析 。

　　11 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物 :

　　— 单组分物质 :物理性状 、水溶解性及相关的物理化学性质 ;化学标识 ,如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)名称或 CAS名称 、CAS号 、简化分子线性输入规范(SMILES) 码或国际化合物标识(InChI)码 、结构式 、纯度等信息 , 在 适 当 情 况 下 还 应 提 供 杂 质 的 化 学 鉴 别信息 ;

　　— 多组分物质 、不明复杂物质(UVCBs)(组分未知或者可变的物质 、复杂反应产物或者生物材料)和混合物 :尽可能提供各组分的化学鉴别信息 、含量和相关的物理-化学特性 。

　　b) 试验生物 :学名 、来源 。

　　c) 试验条件 :

　　— 预培养阶段的条件和周期 ;

　　— 试验方式(如静态 、半静态 、脉冲式) ;

　　— 试验开始的时间和周期 ;

　　— 试验培养基的组成 ,如沉积物和液体营养成分 ;

　　— 试验的设计 ,如植物生长的空间/实验室 、试验容器 、试验体积 、试验开始时每个试验容器植物的长度和质量 、沉积物和水的表面积比 、沉积物和水的体积比 ;

　　— 试验浓度(理论浓度和实测浓度) ,每个浓度组的平行数 ;

　　— 受试物贮备液和试验溶液的配制方法 ,使用的助溶剂或分散剂(如有) ;

　　— 试验温度 ;

　　— 光源 、光照强度 ;

　　— 试验开始和结束时的 pH ,溶液状态 ;

　　— 溶解氧 。

　　d) 分析方法 :测定长度 、鲜重和干重的方法 。

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　　e) 统计方法 :使用合适的分析方法评估数据的质量 ,检验方法 、分析的标准偏差或置信区间 。

　　f) 结果 :

　　— 根据表 1 中提供的评估时间表 ,在每次观察和分析时每个处理组和对照组容器中植物的茎长和茎鲜重以及其他测量变量 ;

　　— 每个测量变量的平均值和标准差 ;

　　— 每个处理组的生长曲线 ;

　　— 对照组中茎长和鲜重的倍增时间/生长率 ,包括生物鲜重增长量的变异系数 ;

　　— 计算每个处理组响应变量 ,包括不同平行之间的平均值和变异系数 ;

　　— 浓度-效应关系图 ;

　　— 估算响应变量(如 EC50)的毒性终点和相关置信区间 ,如果计算 LOEC和/或 NOEC,提供统计方法 ;

　　— 如果使用了方差分析 ,应明确效应的大小(例如最小显著差异) ;

　　— 处理组可观察到的任何生长刺激效应 ;

　　— 任何可见的植物毒性症状以及对试验溶液的观察 ;

　　— 讨论结果 ,包括偏离本文件对测试结果的任何影响 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　穗状狐尾藻的描述

　　A. 1 本文件中描述的方法主要针对穗状狐尾藻 ,也可用于测试一系列水生植物物种 。穗状狐尾藻属于双子叶植物纲 ,小二仙草科 ,是一种多年生沉水植物 。穗状狐尾藻为世界广泛分布 ,产于全球的淡水水域 ,可以耐受各种条件 ,在静态和流动的水体中均可生长 。

　　A.2 冬天枝叶枯萎 ,根部埋在沉积物中 ,来年春天再次发芽生长 。穗状狐尾藻植株通常能自由开花和结果 ,从自然脱落的断枝或根状茎进行无性繁殖 ,是穗状狐尾藻繁殖的主要方法 。

　　A.3 冬季不容易获得穗状狐尾藻的地区 ,可能需要在温室或实验室条件下长期贮备培养 。虽然可通过降低光照强度和 温 度 以 减 少 培 养 液 更 新 的 频 率 (例 如 当 一 段 时 间内 没 有 计 划 进 行 穗 状 狐 尾 藻 试 验时) ,但贮备培养物应保持在与试验相似的条件下 ,宜使用比试验中更大的水族箱或培养钵 , 以留出足够繁殖空间 。沉积物和水介质的组成应与试验中使用的相同 ,也可使用其他沉积物施肥的方法(例如使用商业缓释肥料配方) 。

　　A.4 贮备培养物应不受到任何其他生物体的污染 ,如蜗牛 、丝状藻类 、真菌和昆虫 ,应尽量减少单细胞藻类和细菌的污染 , 当藻类或细菌污染成为问题时 ,对贮备培养系统进行通气可能起到效果 ,必要时应用淡水冲洗植物和进行移植 , 以避免藻类和细菌污染的进一步发展 。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　培养基和沉积物的配制

　　B. 1 斯马特-巴尔科培养基

　　宜使用斯马特-巴尔科培养基培养穗状狐尾藻和进行毒性试验 , 用去离子水或蒸馏水配制斯马特-巴尔科培养基 ,具体组成成分见表 B. 1。试验开始时 ,培养基(水相) 的 pH 应在 7. 5~ 8. 0 之间 , 以获得最佳的植物生长条件 。

　　表 B. 1 斯马特-巴尔科培养基组成成分

　　化学成分

　　质量浓度/(mg/L)

　　CaCl2 · 2H2 O

　　91. 7

　　MgSO4 · 7H2 O

　　69. 0

　　NaHCO3

　　58. 4

　　KHCO3

　　15. 4

　　pH(空气平衡)

　　7. 9

　　B.2 沉积物的配制

　　B.2. 1 人工沉积物的具体组成见表 B. 2。

　　表 B.2 沉积物组成和相关要求

　　成分

　　试剂用量

　　要求

　　泥炭

　　4% ~ 5%(干重)

　　有机碳含量为 1. 5% ~ 2. 5%, pH 尽量接近 5. 5~ 6. 0,应使用风干过的粉末状 的泥炭 ,细磨后颗粒尺寸小于 1 mm

　　高岭土

　　20%(干重)

　　高岭土含量宜超过 30%

　　石英砂

　　75% ~ 76%(干重)

　　细砂为主 ,在 50 μm~ 200 μm 之间的颗粒占 50%以上

　　水分含量

　　30% ~ 50%

　　添加营 养 液 , 使 得 最 终 干 沉 淀 物 含 有 200 mg/kg氯 化 铵 和 200 mg/kg磷 酸钠 ,且最终混合物的水分含量在 30% ~ 50%范围内

　　pH

　　6. 5~ 7. 5

　　加入化学分析纯级别的碳酸钙 ,调整最终沉淀物的 pH

　　B.2.2 应记录和了解泥炭 、高岭土和石英砂的来源 ,如果来源不明或可能对试验结果产生一定程度的毒性影响 ,则应检查相应成分是否存在化学污染(例如重金属 、有机氯化合物和有机磷化合物等) 。

　　B.2.3 应将沉积物各干燥组分均匀混合后再添加营养液 , 至少提前两天准备好湿润的沉积物 ,使泥炭充分浸泡 ,并防止在沉淀物上覆盖介质时疏水性泥炭颗粒漂浮到液面 ,使用前湿润的沉积物可置于暗处存放 。

　　B.2.4 沉积物被转移到合适尺寸的容器中 ,例如直径适合的玻璃培养钵 ,沉积物应覆盖 70%或更多的容器表面积 。如果容器 底 部 有 孔 , 在 容 器 底 部 铺 一 张 滤 纸 可 防 止 沉 积 物 漏 出 。 在 培 养 钵 内 填 满 沉 积物 ,使沉淀 物 表 面 平 整 , 用 一 层 薄 薄 的(约 2 mm ~ 3 mm) 惰 性 物 质 覆 盖 , 如 沙 子 、园 艺 砂 砾(或 碎 珊瑚) , 以使沉积物更加稳定 。

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　　参 考 文 献

　　[1] OECD Series on testing and assessment No. 23 (Second Edition) Guidance Document on Aqueous-Phase Aquatic Toxicity Testing ofDifficultTestChemicals (2019)

　　[2] OECD Serieson Testing and AssessmentNo. 54CurrentApproachesin the StatisticalAnal- ysis ofEcotoxicityData: A Guidance to Application (2006)

　　[3] OECD Series on testing and assessment No. 206 Myriophyllum Toxicity Test Results of Ring TestUsing M. aquaticum and M. spicatum in a Sediment—WaterSystem-ring TestReport(2014)

　　[4] OECD GuidelinesforThe Testing ofChemicals No. 239Water-SedimentMyriophyllum Spi- catum Toxicity Test(2014)

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