GB/T 21772-2025 化学品 哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21772—2025代替 GB/T21772—2008

　　化学品 哺乳动物骨髓染色体畸变

　　试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofmammalian bonemarrow chromosomeaberration

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21772—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 2

　　5 试验基本原则 2

　　6 试验方法 2

　　7 试验数据和报告 5

　　参考文献 8

　　Ⅰ

　　GB/T 21772—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21772—2008《化学品 哺乳动物骨髓染色体畸变试验方法》,与 GB/T 21772—2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 增加了 “有丝分裂指数 ”的术语和定义(见 3. 5) ;

　　b) 增加了 “缩略语 ”一章(见第 4章) ;

　　c) 更改了 “染色体型畸变 ”“染色单体型畸变 ”“内 复 制 ”“多 倍 体 ”和 “结 构 畸 变 ”的 定 义(见 3. 1、 3. 2、3. 3、3. 7 和 3. 8,2008年版的 2. 1、2. 2、2. 3、2. 6 和 2. 7) ;

　　d) 更改了试验动物饲养环境的温度和湿度范围(见 6. 1. 2,2008年版的 4. 1. 2) ;

　　e) 增加了动物每笼饲养只数的要求和具体的动物标记方法(见 6. 1. 2、6. 1. 3) ;

　　f) 增加了不同类型受试物的染毒途径(见 6. 1. 4. 1) ;

　　g) 增加了常见的溶剂/赋形剂具体名称可供选择(见 6. 2. 1) ;

　　h) 更改了环磷酰胺和环磷酰胺(一水合物)的名称及 CAS号(见 6. 2. 2. 3,2008年版的 4. 2. 2. 2) ,并增加了甲磺酸甲酯名称及 CAS号(见 6. 2. 2. 3) ;

　　i) 更改了灌胃及注射染毒的最大体积(见 6. 3. 4. 3,2008年版的 4. 3. 5) ;

　　j) 增加了对涂片标记的要求(见 6. 3. 8. 1) ;

　　k) 增加了 “观察 ”部分(见 6. 3. 6) ;

　　l) 增加了染色体制备的具体方法(见 6. 3. 7) ;

　　m) 更改了 “试验报告 ”,对试验报告应包括的各项内容做了更为详细的规定(见 7. 3, 2008年版的5. 3) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、青岛大学 、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 。

　　本文件主要起草人 :于典科 、许琳 、李斌 、马燕 、杨力 、陈宵 、靳远 、赵坤明 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21772—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 21772—2025

　　引 言

　　本试验用于检测和评价受试物诱发啮齿类动物骨髓染色体结构畸变作用 。染色体结构畸变可有两种形式 , 即染色体型畸变和染色单体型畸变 。多倍体增加可能表明受试物有导致染色体数目畸变的潜在作用 。大多数化学致突变物诱发的染色体畸变是染色单体型畸变 ,但染色体型畸变也可发生染色体突变及其相关事件是很多人类遗传性疾病的原因 ,并且有充分的证据表明 ,引起癌基因和肿瘤抑制基因改变的染色体畸变及其相关事件与人类和试验动物的癌症发生有关 。

　　本试验常规使用啮齿类动物 。骨髓是本试验的靶器官 , 因其富含血管 ,且有大量易于分离和处理的快速循环的细胞 。其他种属和靶器官不是本试验的对象 。

　　染色体畸变试验特别适合评价那些需要考虑体内代谢 、药物代谢动力学和 DNA-修复过程等因素导致的遗传毒性 ,尽管上述因素在不同动物种属 、不同组织之间可能存在差异 。体内试验对用于进一步研究在体外试验中检测到的遗传毒性 。

　　如果有证据表明受试物或其活性代谢产物不能到达到靶器官 ,则不适合使用本试验 。

　　Ⅳ

　　GB/T 21772—2025

　　化学品 哺乳动物骨髓染色体畸变

　　试验方法

　　1 范围

　　本文件描述了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的试验方法 。

　　本文件适用于哺乳动物骨髓染色体畸变试验 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14925—2023 实验动物 环境及设施

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　染色体型畸变 chromosome-typeaberration

　　染色单体断裂或染色单体间断裂和重接的染色体结构损伤的现象 。

　　3.2

　　染色单体型畸变 chromatid-typeaberration

　　两条染色单体在相同位点的断裂或断裂重接的染色体结构损伤的现象 。

　　3.3

　　内复制 endoreduplication

　　在 DNA复制的 S期之后 ,细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个 S期的过程 。

　　注 : 其结果是染色体有 4、8、16等倍的染色质 。

　　3.4

　　裂隙 gap

　　小于染色单体宽度的不着色的损伤 ,并伴有染色单体极小的错位 。

　　3.5

　　有丝分裂指数 mitotic index

　　有丝分裂的细胞数量与总细胞数量之比 。

　　注 : 用来衡量增殖状态细胞数量的指标 。

　　3.6

　　数目畸变 numericalaberration

　　染色体数目的改变 ,不同于所用细胞的正常染色体数目 。

　　3.7

　　多倍体 polyploidy

　　有两套以上染色体组的细胞或个体 。

　　1

　　GB/T 21772—2025

　　3. 8

　　结构畸变 structureaberration

　　细胞分裂中期的染色体结构改变现象 。

　　注 : 显微镜下可观察到结构畸变如缺失 、断裂 、内交换或者相互交换等 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　CAS:化学文摘社编号(ChemicalAbstracts Service)

　　InChI: 国际化合物标识(InternationalChemicalIdentifier)

　　IUPAC: 国际纯粹与应用化学联合会(International Union ofPure and Applied Chemistry)

　　SMILES:简化分子线性输入规范(Simplified molecular inputline entry system)

　　UVCB:组 分 未 知 或 者 可 变 的 物 质 、复 杂 反 应 产 物 或 者 生 物 材 料 ( substances of Unknown or Variable composition,Complex reaction products orBiological materials)

　　5 试验基本原则

　　试验动物通过合适的染毒途径接触受试物 ,并在染毒后适当的时间进行安乐死 。在安乐死前 ,动物用细胞中期分裂相阻断剂(如秋水仙碱或秋水仙素)处理 ,然后取骨髓细胞进行染色体制备 、染色 ,分析中期分裂相细胞的染色体畸变 。

　　6 试验方法

　　6. 1 准备

　　6. 1. 1 动物品、系选择

　　宜使用健康 、初成年的大鼠 、小鼠和中国仓鼠 ,但也可用其他合适的哺乳动物 。在试验之初 ,动物体重变异应不超过同性别平均体重的 ±20% 。

　　6. 1.2 饲养条件

　　试验动物房环境应符合 GB 14925—2023中 6. 1 的规定 。应人工照明 ,12h 明暗交替 。饲喂常规实验室饲料 ,不限饮水 。如果需要以受试物掺入饲料的方式进行染毒 ,应保证饲料与受试物适当混合 。动物应以小群饲养(每 笼 不 多 于 5 只) , 并 以 同 性 一 起 饲 养 。 应 在 有 科 学 依 据 的 情 况 下 , 进 行 动 物 单 独饲养 。

　　6. 1.3 动物的准备

　　将健康的初成年鼠(对于啮齿动物 ,宜为 6周龄 ~ 10周龄)随机分配到对照组和染毒组 。对动物进行标记应采用人道且微创的方式(如带环 、打标签 、微芯片或者生物识别 ,不包括剪耳或剪趾) 。饲养笼应随机安排 , 以使可能的饲养笼放置效应减小 。在实验室条件下适应性喂养至少 5 d。

　　6. 1.4 受试物的准备

　　6. 1.4. 1 固体受试物在染毒前应溶解于或悬浮于合适的溶剂或赋形剂中 ,或混在动物的食物或饮用水中 。液体受试物可直接给药或在给药前稀释 。对于吸入式暴露 ,受试物受理化性质影响 ,包括但不限于

　　2

　　GB/T 21772—2025

　　以下形式 :

　　a) 气体 ;

　　b) 蒸汽 ;

　　c) 固体/液体气溶胶 。

　　6. 1.4.2 应使用新制备的受试物 ,除非有资料证明受试物贮存是稳定的 。

　　6.2 试验条件

　　6.2. 1 溶剂/赋形剂

　　溶剂/赋形剂在使用剂量下不应产生毒性作用 ,且不与受试物发生化学反应 。如使用非常规溶剂/赋形剂 ,应提供其兼容性的参考数据 。优先考虑使用水性溶剂/赋形剂 , 常见的溶剂/赋形剂包括水 、生理盐水 、甲基纤维素溶液 、羧甲基纤维素钠盐溶液 、橄榄油和玉米油 。

　　6.2.2 对照

　　6.2.2. 1 每个试验的每个性别都应包括同时进行的阳性和阴性(溶剂/赋形剂) 对照组 。 除了不被受试物染毒之外 ,对照组动物应与染毒组动物以相同的方式进行操作 。

　　6.2.2.2 阳性对照组的染毒剂量应预期在体内可检测到超过本底值的染色体结构畸变 。 阳性对照物的浓度应设计合理 ,最好是阳性结果既明显又不能使阅片者立即发现其为阳性对照组的标本片 。 阳性对照物的染毒途径可不同于受试物染毒途径 ,并且仅在一个时间点采样 。如可能 ,可考虑利用与受试物化学结构相关的阳性对照物 。

　　6.2.2.3 阳性对照物参比物质见表 1。

　　表 1 阳性对照物参比物质

　　阳性对照物

　　CAS号

　　甲磺酸乙酯

　　62-50-0

　　甲磺酸甲酯

　　66-27-3

　　乙基亚硝基脲

　　759-73-9

　　丝裂霉素 C

　　50-07-7

　　环磷酰胺

　　50-18-0

　　环磷酰胺(一水合物)

　　6055-19-2

　　三亚乙基蜜胺

　　51-18-3

　　6.2.2.4 每个采样时间点都应包括仅以溶剂/赋形剂处理的阴性对照组 ,并与染毒组进行同样的操作 ,除非动物间的变异可接受 ,且有染色体畸变细胞频率的历史对照资料 。如对阴性对照组只做单次采样 ,则最佳采样时间为首次采样时间 。在有历史性对照或文献资料证明所选用的溶剂/赋形剂无细胞毒性或无致突变作用的情况下 ,可不设置有未做处理的空白对照 。

　　6.3 试验步骤

　　6.3. 1 动物数量及性别

　　每个染毒组和对照组应至少有 10只可供分析用的动物 , 雌雄各半 。 如试验时已有资料证明同 一品 、系的两种性别动物经相同途径染毒结果无显著差别 ,可只用一种性别动物 。 当人类暴露于受试物可能存在性别差异时(如某些药物) ,应选用相应性别的动物进行试验 。

　　3

　　GB/T 21772—2025

　　6.3.2 剂量水平

　　如果因没有可供利用的合适资料而需要进行预试验来确定剂量范围时 ,应采用与正式试验相同的实验室 、相同品 、系和性别的试验动物及染毒程序 。如果存在毒性 ,对第一次采样时间应设计 3 个剂量水平 。剂量范围的设计应覆盖从最大毒性至几乎无毒性 。在之后的采样时间 ,仅需采用最高剂量 。最高剂量是指产生毒性体征的剂量 ,并且根据同样的染毒程序 , 比其更高的剂量将引起动物死亡 。对于低毒或无毒剂量时仍具有特殊生物学活性的物质(如激素和促细胞分裂剂等) 可能是例外 ,应逐例评价 。最高剂量也可定义为引起骨髓某些毒性指征的剂量(如有丝分裂指数降低 50%以上) 。

　　6.3.3 限量试验

　　如剂量范围测试或相关动物品系现有数据表明 ,在最大剂量的处理条件下仍不产生可被观察到的毒性效应 ,并且根据相关化合物的结构资料推断受试物无遗传毒性 ,则不需要进行 3个剂量水平的完整试验 。对于染毒时间不超过 14 d 的试验 ,最大剂量为每天 2 000 mg/kg;对于染毒时间超过 14 d 的试验 ,最大剂量为每天 1 000 mg/kg。根据人预期的暴露水平 ,有时 可 能 需 要 采 用 更 高 剂 量 水 平 的 限 量试验 。

　　6.3.4 染毒

　　6.3.4. 1 在染毒时 ,应考虑人类暴露受试物的途径 。

　　6.3.4.2 应选择适当的暴露途径确保受试物充分暴露 ,暴露途径可选择饮食 、饮用水 、局部皮下 、静脉 、口服(灌胃) 、吸入 、气管或植入等 。

　　6.3.4.3 一次灌胃或注射的最大液体量取决于试验动物的大小 ,不宜超过 1 mL/100 g,在水溶液中可使用的最大量为 2 mL/100 g。采用更大量时 ,应提供合理证据 。

　　6.3.4.4 除在较高浓度时可显示毒效应增强的刺激性或腐蚀性物质外 ,应调整浓度确保在所有的剂量水平等容积染毒 , 以尽量减少因染毒容积不同所致的差异 。

　　6.3.5 染毒程序

　　6.3.5. 1 优先采用一次性染毒 。若给予较大容量的受试物 ,也可分次染毒 , 即在一天内染毒两次或两次以上 , 间隔不超过 2 h~ 3 h。分次染毒时 ,应根据最后一次给药或暴露结束的时间安排采样时间 。若采用其他的染毒式应提供科学的理由 。

　　6.3.5.2 染毒后 ,应分别在两个不同的时间采集样品 。 啮齿类动物第一次采样时间一般在 1. 5 个正常细胞周期 , 即于染毒后 12 h~ 18 h 采集样品 。 由于受试物吸收 、代谢需要时间以及对细胞周期动力学的作用 ,都可能影响染色体畸变检测的最佳时间 。第二次采样时间宜在第一次采样后 24 h。如染毒程序超过一天 ,应在末次染毒后 1. 5个正常细胞周期时采样 。

　　6.3.5.3 动物在处死前 ,腹腔注射适量的细胞中期分裂相阻断剂(如秋水仙素 , 于动物处死前 4 h,按照4 mg/kg体重给药) 。然后间隔适当时间取样 。小鼠约间隔 3 h~ 5 h;大鼠约间隔 2 h~ 5 h。从骨髓中采集细胞 , 固定和染色 ,并分析染色体畸变 。

　　6.3.6 观察

　　6.3.6. 1 每日应至少进行一次受试动物的一般临床表现观察并记录临床症状 ,观察时间应每 日 固定 ,且需考虑给药后预期效应的峰值时段 ,每日至少两次观察所有动物的发病及死亡情况 。

　　6.3.6.2 所有动物应于试验开始时称重 , 重复给药试验中至少每周称重一次 ,并于安乐死时进行终末称重 。

　　6.3.6.3 对于持续时间大于或等于一周的试验 ,应至少每周测定一次摄食量 。

　　4

　　GB/T 21772—2025

　　6.3.6.4 若通过 饮 水 途 径 给 予 受 试 物 , 应 于 每 次 更 换 饮 水 时 测 定 饮 水 量 , 并 且 至 少 每 周 测 定 一 次 饮水量 。

　　6.3.6.5 对出现非致死性过度毒性指征的动物 ,应在试验周期结束前以人道方式处死 。

　　6.3.7 染色体制备

　　6.3.7. 1 将动物安乐死后 ,应立即去除动物的股骨或胫骨 ,并剪去股骨或胫骨两端 ,用注射器吸取 5 mL生理盐水 ,从股骨一端注入 ,用 10 mL离心管 ,从股骨另一端接取流出的骨髓细胞悬液 。

　　6.3.7.2 将细胞悬液以 1 000 r/min的速度离心 5 min~ 7 min,弃去上清液 。

　　6. 3.7.3 在 6. 3. 7. 2 获得的细胞沉淀中加入 7 mL 0. 075 mol/L的 KCl溶液 ,用滴管将细胞轻轻地混匀 ,

　　的速(放入)度(37)离心(℃水)5m(浴锅)i处in理,弃去上(7m)in清,液(然后)。加入 2 mL 固定液(冰醋酸 ∶ 甲醇= 1 ∶ 3) ,混匀 , 以 1 000 r/min

　　6.3.7.4 在 6. 3. 7. 3 获得的细胞沉淀中加入 7 mL 固定液 ,混匀 , 固定 7 min, 以 1 000 r/min的速度离心7 min,弃去上清液 。

　　6.3.7.5 按照本文件 6. 3. 7. 4规定的方法 ,再固定 1 次 ~2 次 ,弃去上清液 。

　　6.3.7.6 加入数滴新鲜固定液 ,混匀 。

　　6.3.7.7 用混悬液滴片 , 自然干燥后 ,用姬姆萨染液染色 。

　　6.3. 8 染色体分析

　　6.3. 8. 1 应对所有涂片包括阴性和阳性对照进行独立编码 ,并应随机分组 。

　　6.3. 8.2 对各染毒剂量组(包括阳性对照组)和阴性对照组 ,每个动物至少分析 1 000个细胞 ,测定有丝分裂指数 , 以确定细胞毒性 。

　　6.3. 8.3 每个动物应至少分析 200个中期分裂相细胞 , 以检测结构性染色体畸变 。如所见畸变率很高 ,观察的细胞数可减少 ;如果历史阴性对照频率小于 1% ,应对更多细胞评分 。考虑到制片方法常导致 一定比例中期分裂相细胞的破裂而丢失染色体 , 因此所计数细胞含着丝点的数目应不少于 2n±2(其中 n为该物种的单倍体染色体数) 。应分别记录染色单体和染色体型畸变 ,并按亚型(断裂或交换)分类 。

　　7 试验数据和报告

　　7. 1 数据处理

　　以动物为试验单位 。用表格列出每只试验动物的资料 。应评估每只动物的有丝分裂指数 、分裂中期细胞的数量 、每个中期细胞的畸变数和具有结构性染色体畸变的细胞百分比 。应列出染毒组和对照组不同类型的结构性染色体畸变的数量和频率 。裂隙应单独记录 ,但一般不计入总畸变率中 。若没有证据表明性别间有明显差异 ,雌雄动物数据可合并统计分析 ,并报告动物毒性和临床症状 。

　　7.2 结果评价

　　7.2. 1 判断阳性结果的标准为 :有染色体结构畸变的细胞数的增高呈现剂量-反应关系 ,或在某一采样时间的某一剂量组有染色体结构畸变的细胞数明显增高 。应首先考虑结果的生物学意义 。统计学方法可用于帮助评价试验结果 ,但统计学的显著性不应是确定阳性结果的唯一因素 。对于可疑的试验结果最好通过改进试验条件等方法 ,用进一步试验加以证实 。

　　7.2.2 结果不符合 7. 2. 1 的受试物 ,则认为在本试验系统中无诱发突变作用 。

　　7.2.3 多倍体的增加 ,提示受试物具有潜在诱发染色体数目畸变的作用 。 内复制的增加表明受试物具有潜在的抑制正常细胞周期进展的作用 。

　　7.2.4 大多数试验在大多数情况下都能得到明确的阳性或阴性结果 ,但在少数情况下 ,所得到的资料

　　5

　　GB/T 21772—2025

　　并不能对受试物的致突变性作明确的判断 。虽经多次重复试验 ,但结果仍可能是不确切或可疑的 。

　　7.2.5 体内染色体畸变试验的阳性结果 ,表明受试物具有诱发该种动物骨髓细胞染色体畸变作用 ; 阴性结果表明在本试验条件下 ,受试物不具有诱发该种动物骨髓细胞染色体畸变作用 。

　　7.3 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物 :

　　1) 名称 、规格型号和批号及有效期(如已知) ;

　　2) 稳定性(如已知) ;

　　3) 物理性状及纯度 ;

　　4) 受试物是单组分物质时 ,应提供水中溶解度等物理性质和其他理化性质及化学标识信息 ,如 IUPAC或 CAS名称 、CAS号 、SMILES或 InChI代码 、结构式 、纯度 、杂质的化学标识信息等 ;

　　5) 受试物为多组分物质 、UVCB及混合物时 ,应按照本文件 7. 3a) 列项的第 4 项规定提供理化性质外 ,还应提供各成分的含量及相关的理化性质 。

　　b) 溶剂/赋形剂 :

　　1) 溶剂/赋形剂选择的依据 ;

　　2) 受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性(如已知) ;

　　3) 食物 、饮用水或吸入配方的制备 ;

　　4) 对配方进行分析测定(如稳定性 、均质性和浓度) 。

　　c) 试验动物 :

　　1) 品系及使用依据 ;

　　2) 动物的数量 、年龄和性别 ;

　　3) 来源 、饲养条件和饲料等 ;

　　4) 动物的标记方法 ;

　　5) 试验期间(包括开始和结束)动物的个体体重 ,食物消耗量 ,每组动物的体重范围 、均数和标准差 。

　　d) 试验条件 :

　　1) 阳性和阴性(溶剂/赋形剂)对照 ;

　　2) 剂量设计的预试验资料(如进行) ;

　　3) 剂量水平选择的理由 ;

　　4) 受试物制备的详细资料 ;

　　5) 染毒的详细资料 ;

　　6) 染毒途径和时间的选择理由 ;

　　7) 证明受试物到达体循环或靶器官的方法(如进行) ;

　　8) 从饲料/饮用水中的受试物浓度换算成实际染毒剂量[mg/(kg · d)] ;

　　9) 饲料及饮用水质量的详细资料 ;

　　10) 安乐死方法 ;

　　11) 染毒和采样时间的详细资料 ;

　　12) 测定毒性的方法 ;

　　13) 涂片的制备方法和染色方法 ;

　　14) 取样前中期分裂相阻断剂的特性 、浓度及处理时间 ;

　　15) 分离和保存样本的程序 ;

　　6

　　GB/T 21772—2025

　　16) 评分标准 ;

　　17) 每只动物分析的细胞数 ;

　　18) 阳性 、阴性及可疑结果的判断标准 。

　　e) 结果 :

　　1) 试验前和整个试验期间动物的状况 ,包括毒性反应 ;

　　2) 有丝分裂指数 ;

　　3) 每只动物的细胞的畸变类型和畸变数量 ;

　　4) 每组畸变的平均数和标准差 ;

　　5) 倍性的变化 ,包括多倍体和/或内复制细胞的频率(如观察到) ;

　　6) 剂量-反应关系(如可能) ;

　　7) 统计学分析及方法 ;

　　8) 历史阴性和阳性资料 ,包括分布范围 、平均值和标准差 、95%控制限值 ;

　　9) 提供阴性和阳性对照的数据及范围 、平均值和标准差 。

　　f) 结果的讨论 。

　　g) 结论 。

　　7

　　GB/T 21772—2025

　　参 考 文 献

　　[1] OECD GuidelinesforThe Testing ofChemicals No. 475Mammalian BoneMarrow Chromo- somalAberration Test(2016) .

　　8