GB/T 21773-2025 化学品 体内哺乳动物红细胞微核试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21773—2025代替 GB/T21773—2008

　　化学品 体内哺乳动物红细胞

　　微核试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofinvivo mammalian erythrocytemicronucleus

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21773—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21773—2008《化学品 体内哺乳动物红细胞微核试验方法》,与 GB/T 21773— 2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 更改了 “试验基本原则 ”的内容(见第 4章 ,2008年版的第 3 章) ;

　　b) 增加了 “实验室能力验证 ”一章(见第 5 章) ;

　　c) 更改了 “动物选择”“饲养条件”“动物准备 ”和 “受试物准备 ”的内容(见 6. 1,2008年版的 4. 1) ;

　　d) 更改了 “溶剂/赋形剂 ”和 “对照 ”的内容(见 6. 2,2008年版的 4. 2) ;

　　e) 更改了 “动物的 数 量 和 性 别 ”的 内 容 (见 6. 3. 1, 2008年 版 的 4. 3. 1) 、“剂 量 水 平 ”的 内 容(见6. 3. 2, 2008年版的 4. 3. 3) 、“限量试验 ”的内容(见 6. 3. 3,2008年版的 4. 3. 4) 、“染毒途径 ”的内容(见 6. 3. 4,2008年版的 4. 3. 5)和“染毒程序 ”的内容(见 6. 3. 5,2008年版的 4. 3. 2) ;

　　f) 增加了 “观察 ”(见 6. 3. 6)和 “靶组织暴露 ”的内容(见 6. 3. 7) ;

　　g) 更改了 “骨髓/血液样本制备 ”的内容(见 6. 3. 8, 2008年版的 4. 3. 6) 和 “分析(人工分析和 自动分析) ”的内容(见 6. 3. 9,2008年版的 4. 3. 7) ;

　　h) 更改了“数据处理 ”的内容(见 7. 1,2008年版的 5. 1) ;

　　i) 增加了 “质量控制 ”的内容(见 7. 2) ;

　　j) 更改了“结果评价和解释 ”的内容(见 7. 3,2008年版的 5. 2) 和 “试验报告 ”的内容(见 7. 4,2008年版的 5. 3) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、湖南省职业病防治院 。

　　本文件主要起草人 :戴宇飞 、沈美丽 、聂云峰 、陈圆圆 、李立 、邓富昌 、顾雯 、刘帅 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21773—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

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　　引 言

　　体内哺乳动物红细胞微核试验是一种体内遗传毒性试验方法 ,通过检测动物(通常是啮齿类) 骨髓或外周血红细胞中微核的形成情况 ,评估化学品是否引起成红细胞染色体或有丝分裂器的损伤 。微核试验的目的是鉴定可引起细胞遗传损伤的化学品 ,这种损伤会导致微核的形成 ,微核中可能含有滞后染色体断片或整条染色体 。 哺乳动物体内微核试验对评估化学品的遗传毒性具有特殊意义 ,虽然可能存在物种差异 ,但该试验能反映体内代谢 、毒代动力 学 以 及 机 体 DNA 修 复 能 力 等 过 程 对 遗 传 损 伤 的 影响 。体内微核试验还可用于对体外试验检测到的遗传毒性物质开展进一步的研究 。

　　在骨髓中的成红细胞发育为特定阶段的未成熟红细胞的过程中 ,其细胞核会被排出 , 已形成的微核可能滞留于细胞质中 。 由于这些细胞无细胞核 , 因此微核更易观察或检测 。在化学品染毒的动物中 ,若未成熟红细胞的微核细胞率增加 ,表明化学品诱发了染色体结构畸变或数目畸变 。新形成的含微核的红细胞经染色处理后 ,可使用显微镜进行人工观察和计数 ,也可使用自动化分析方法 。使用自动分析系统能显著提高计数效率 ,可替代人工计数 。进行适当的校准后 , 自动化分析方法在实验室间和实验室内的重现性和灵敏度方面要优于人工计数方法 。适用于红细胞微核测定的 自动分析系统包括但不限于 :流式细胞仪 、图像分析平台和激光扫描细胞仪 。

　　在该试验中 ,染色体断片可通过多种标准与整条染色体区分 ,例如鉴定动粒或着丝粒 DNA 的存在与否 ,这两者都是完整染色体的特征 。若微核中未检测到动粒或着丝粒 DNA,说明其中仅包含染色体断片 ;若微核中检测到动粒或着丝粒 DNA,则表明发生了整条染色体丢失 。需要说明的是 ,上述区分染色体断片与整条染色体的方法 ,通常不作为测试的一部分 。本试验测试的靶组织为初成年啮齿类动物的骨髓 , 因骨髓是红细胞的主要生成场所 。若有证据表明 ,某些哺乳动物物种外周血中未成熟红细胞对检测化学品导致的染色体结构畸变或数目畸变足够敏感 ,也可将外周血中未成熟红细胞作为检测对象 。骨髓或外周血中未成熟红细胞的微核细胞率是主要检测终点 。若某哺乳动物物种脾脏对含微核细胞的清除作用较弱 ,或实验动物连续染毒的时间超过该物种的红细胞寿命(例如小鼠染毒 4周或以上) ,在这两种情况下 ,都可选择外周血中成熟红细胞的微核细胞率作为检测终点 。

　　在依据本测试指南获取混合物的毒性评估数据 ,并将其用于预期监管目的前 ,需要评估其是否能为该目的提供符合要求的结果 , 同时分析可能影响结果适用性的原因 。若对混合物的测试有监管要求 ,则不必开展上述评估 。

　　Ⅱ

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　　化学品 体内哺乳动物红细胞

　　微核试验方法

　　1 范围

　　本文件确立了体内哺乳动物红细胞微核试验方法的试验基本原则 ,规定了实验室能力验证 、试验数据和报告的内容要求 ,描述了试验方法 。

　　本文件适用于化学品的体内哺乳动物红细胞微核试验的工作 。

　　本文件不适用于未到达拟检测靶组织的化学品或其代谢物 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14925 实验动物 环境及设施

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　着丝粒 centromere

　　染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域 。

　　3.2

　　动粒 kinetochore

　　由多种蛋白质在细胞分裂时染色体着丝粒部位形成的一种圆盘状结构 。

　　3.3

　　微核 micronuclei

　　在有丝分裂(或减数分裂)末期 , 由滞后染色体断片或整条染色体形成的 ,与细胞主核分离且独立存在的小核 。

　　3.4

　　成熟红细胞 matureerythrocyte

　　正染红细胞 normochromaticerythrocyte

　　去核后失去残留 RNA 和/或其他短期标志物的红细胞 。

　　注 : 能用选择性核糖体染料与未成熟红细胞区分 。

　　3.5

　　嗜多染红细胞 polychromaticerythrocyte

　　含有残留 RNA 的处于发育过程中的未成熟红细胞 。

　　注 : 能用选择性核糖体染料与成熟红细胞区分 。

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　　3.6

　　网织红细胞 reticulocyte

　　一种经活体染料染色后使残留 RNA 聚集成特有网状结构的未成熟红细胞 。

　　注 : 广义的未成熟红细胞包含有核阶段和无核阶段 。微核试验主要观察无细胞核的未成熟红细胞 , 即嗜多染红细胞或网织红细胞 。

　　4 试验基本原则

　　采用适当染毒途径对实验动物进行染毒 。若使用骨髓样本 ,在染毒后的适当时间 ,对动物实施人道安乐死 , 随后提取骨髓 ,并制片和染色 。若使用外周血样本 ,于染毒后的适当时间采集血液 ,进行制片和染色 。 当进行急性染毒时 ,应选择适宜的骨髓或血液样本采集时间 ,从而能检测到因染毒诱导产生的含微核未成熟红细胞 。采集外周血样本时 ,应经过充足的时间 ,保证微核出现在循环血液中 。可通过显微镜观察 、图像分析 、流式细胞术或激光扫描细胞仪 ,对制片中微核存在情况进行检测 。

　　5 实验室能力验证

　　5. 1 能力调查

　　在使用微核检测方法进行常规测试之前 ,实验室应展示出具备相应的能力 ,能重现已发表数据中的预期结果 ,包括至少使用两种阳性对照物(含低剂量阳性对照物引起的弱阳性) ,例如表 1 推荐的阳性物质 , 同时设溶剂/赋形剂对照进行试验 。试验所采用的剂量应具备可重复性和显示剂量-反应关系 ,应能证实检测方法在目标组织(骨髓或外周血)中的检测灵敏度和动态范围 , 同时应依据实验室所采用的评分方法进行分析 。此要求不适用于具有检测经验的实验室(即具备历史数据库的实验室) 。

　　5.2 历史对照数据

　　5.2. 1 在能力调查过程中 ,实验室应建立历史阳性对照范围和分布 , 以及历史阴性对照范围和分布 。

　　5.2.2 首次获取数据建立历史阴性对照分布时 ,若存在已发表的对照数据 ,则平行阴性对照应与已发表的对照数据保持一致 。若更多的试验数据纳入历史对照分布中 ,平行阴性对照数据应位于该分布的95%控制限内 。实验室的历史阴性对照数据库应具备统计稳健性 , 以确保能评估其阴性对照数据的分布特征 。实验室建立历史对照数据库的最低要求是至少应进行 10次试验并积累对应数据 ,但宜在可比试验条件下至少开展 20次试验 , 以进一步提升数据的统计显著性和可靠性 。实验室应采用质量控制方法 ,例如控制图 ,来识别数据的变异性 ,并证明该方法在实验室中处于 “受控 ”状态 。建立和使用历史数据的要求(例如历史数据中数据的纳入和排除标准 , 以及特定试验的可接受性标准)可参考相关文献 。

　　5.2.3 在能力调查期间 ,若实验室未能完成充足的试验来建立统计上稳健的阴性对照分布 ,则可在首次常规测试时建立 ,所获得的阴性对照结果应与已发表的阴性对照数据保持一致 。

　　5.2.4 在调整试验方案时 ,应评估其对试验数据的影响 ,并确保其与实验室现有历史对照数据库保持一致 。若专家确认该数据库与既往数据分布存在显著差异 ,应建立新的历史对照数据库 。在重建过程中 ,若实验室能证明其平行阴性对照值与既往数据库或相应已发表数据具有一致性 ,则不必建立完整的阴性对照数据库即可开展实际测试 。

　　5.2.5 阴性对照组数据应包含每只实验动物未成熟红细胞的微核细胞率 。平行阴性对照数据应位于实验室历史阴性对照数据库分布的 95%控制限内 。若平行阴性对照数据超出上述 95%控制限 ,但数据不属于极端异常值 、可证实检测方法处于 “受控 ”状态以及无技术或人为失误 ,这些数据就可纳入历史对

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　　照数据库 。

　　注 : 微核细胞率是含微核的未成熟(或成熟)红细胞数占计数的未成熟(或成熟)红细胞总数的比例 , 以千分率来表示 。

　　6 试验方法

　　6. 1 准备

　　6. 1. 1 动物选择

　　宜选用健康的初成年动物 ,可使用小鼠 、大鼠或其他合适的哺乳动物 。若采用外周血样本 ,应首先评估所选物种脾脏对循环血液中含微核细胞的清除作用是否影响检测结果 ,在小鼠和大鼠的外周血中已进行过相关评估 。若使用小鼠和大鼠以外的物种 ,应在报告中提供充分的科学依据 。对于非啮齿类动物 ,宜将微核试验与其他毒性测试相结合 。

　　6. 1.2 饲养条件

　　对于啮齿 类 动 物 , 实 验 动 物 房 的 温 度 应 为 23 ℃ ± 3 ℃ , 相 对 湿 度 为 30% ~ 70% 。 采 用 人 工 照明 ,12 h 明 , 12 h 暗 。选用常规饲料 ,饮水不限 。若将受试物掺入饲料中进行染毒 ,应使受试物与饲料充分且均匀地混合 。若预测动物无攻击性行为 ,应将同性别及相同处理条件下的啮齿类动物进行群体饲养 。宜采用环境丰富度较高的实底笼具 ,每笼不应超过 5 只 。若需对动物单独饲养 ,应说明理由 。

　　6. 1.3 动物准备

　　选用健康的初成年动物(啮齿类动物一般为 6周龄 ~ 10周龄) , 随机分为对照组和染毒组 。使用人道且微创的方法对每只动物进行唯一标记(例如带环 、标记 、微芯片或生物识别 ,但禁止使用剪耳法或剪趾法) 。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应 5 d。应合理安放笼具 ,减小位置因素对试验结果的影响 。试验过程中应避免阳性对照组和受试物之间的交叉污染 。在试验开始时 ,实验动物的体重变异应控制在最小范围 ,且不超过每种性别平均体重的 ±20% 。

　　6. 1.4 受试物准备

　　进行染毒前 , 固态受试物应溶解或悬浮于适宜的溶剂/赋形剂中 ,或与饲料或饮水充分混合 。液态受试物可直接染毒或适当稀释后染毒 。对于吸入暴露试验 ,应根据受试物的理化性质 ,采用气体 、蒸气或固/液气溶胶的形式进行暴露染毒 。 除已明确可以稳定储存并给出储存条件的受试物外 ,试验中所使用的受试物应现用现配 。

　　6.2 试验条件

　　6.2. 1 溶剂/赋形剂

　　溶剂/赋形剂在所使用的剂量水平下不应产生毒性作用 ,且不应与受试物发生化学反应 。常用的相容性良好的溶剂/赋形剂包括水 、生理盐水 、甲基纤维素溶液 、羧甲基纤维素钠溶液 、橄榄油和玉米油 。试验中宜首选水性溶剂/赋形剂 。使用不常用的溶剂/赋形剂时 ,应提供资料证明其适用性 ;若现有证据无法表明该溶剂/赋形剂不存在诱发微核及其他有害作用 ,应开展预试验以确定该溶剂/赋形剂是否可采用 。

　　6.2.2 对照

　　6.2.2. 1 每次试验应包含平行阳性对照组 。若检测实验室已证明具备开展微核试验的能力 ,并建立了

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　　历史阳性对照数据库 ,则不必每次试验都设置阳性对照组 。若未设置平行阳性对照组 ,则每次试验都应包含评分对照 。

　　注 : 评分对照是在试验分析过程中需纳入的符合分析标准和质量要求的参考样本 ,具体形式需结合分析方法确定 。

　　该参考样本能通过独立开展的阳性对照试验制备并保存 。

　　6.2.2.2 阳性对照物应可诱发高于本底值的微核细胞率 ,其升高的程度要达到可检出的水平 。 当使用显微镜人工镜检分析时 , 阳性对照物的剂量选择应使其阳性效应明显 ,但不使阅片者立即判断出其为阳性对照片 。 阳性对照物的染毒途径和染毒程序可与受试物不同 ,并可仅在单一时间点进行采样 。若适用 ,可选择与受试物化学类别相关的阳性对照物 。常用的阳性对照物见表 1。

　　表 1 常用的阳性对照物

　　化学品

　　CAS编号

　　甲磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate)

　　62-50-0

　　甲磺酸甲酯(Methylmethanesulphonate)

　　66-27-3

　　乙基亚硝基脲(Ethylnitrosourea)

　　759-73-9

　　丝裂霉素 C(MitomycinC)

　　50-07-7

　　环磷酰胺(环磷酰胺一水合物)(Cyclophosphamide)(Cyclophosphamide monohydrate)

　　50-18-0 (6055-19-2)

　　三亚乙基蜜胺(Triethylenemelamine)

　　51-18-3

　　秋水仙碱或长春碱(Colchicine orVinblastine)

　　64-86-8或 865-21-4

　　6.2.2.3 每次试验应设置阴性对照组 ,且应在每个采样时间点进行采样 。 阴性对照组除不用受试物染毒外 ,其他处理方式应与染毒组相同 。若受试物染毒时使用了溶剂/赋形剂 , 阴性对照组也应使用该溶剂/赋形剂 。若检测实验室的历史阴性对照数据表明 ,在每个采样时间点动物个体间的变异性以及微核细胞率都较为稳定 ,则可对阴性对照组只进行一次采样 ,且该次采样时间应为试验中首次采样的时间 。

　　6.2.2.4 若使用外周血样本 ,在短期染毒试验中 , 当所得数据与实验室历史对照数据库一致时 ,可用染毒前的样本来代替平行的阴性对照 。染毒前对大鼠进行小体积(例如低于 100 μL/d)采样 ,对微核背景频率的影响很小 。

　　6.3 试验步骤

　　6.3. 1 动物的数量和性别

　　6.3. 1. 1 微核反应在雄性和雌性动物之间具有相似性 , 大多数试验可选择任一性别开展 。若有数据显示雄性和雌性动物之间存在相关差异(例如全身毒性 、代谢 、生物利用度或骨髓毒性等方面的差异 ,包括在剂量预试验中观察到的差异) ,应同时使用两种性别的动物 ,并可采用析因设计开展试验 。析因设计及数据分析的内容见附录 A。

　　6.3. 1.2 应在试验开始时确定动物数量 。若采用单一性别开展试验 ,每个剂量组至少应有 5 只可供分析的动物 ;若使用两种性别 ,则每个剂量组的每种性别至少应有 5 只动物 。若某些化学品在人群使用或接触时具有性别特异性 ,对这些化学品开展试验时应选择合适性别的动物 。

　　6.3.2 剂量水平

　　6.3.2. 1 若缺乏适用数据 ,应通过预试验来确定染毒剂量范围 。 预试验所使用的实验室 、动物物种 、品系 、性别和染毒方案应与正式试验相同 。预试验的目的是确定最大耐受剂量 。

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　　注 : 最大耐受剂量是在试验过程中 ,动物能耐受且不会因毒性反应而影响试验进行的最高剂量 。例如可能导致动物体重下降或造血系统细胞毒性 ,但不导致动物死亡或出现必须实施人道安乐死的痛苦症状 。

　　6.3.2.2 最高剂量可定义为导致骨髓毒性的剂量(例如 ,在骨髓或外周血中 ,未成熟红细胞占总红细胞的比例出现 50%以上的 降 低 , 但 该 比 例 不 应 低 于 对 照 值 的 20%) 。若 试 验 采 用 5 d 或 更 短 的 染 毒 时间 ,染毒的最高剂量可定义为导致 CD71+ 未成熟红细胞占总红细胞的比例显著降低 ,但不应低于对照值 5%的剂量 。

　　注 : 当通过流式细胞术检测外周血中 CD71+ 细胞(转铁蛋白受体阳性细胞)时 ,这类处于网织红细胞分化早期阶段的细胞群对毒性的反应速度比 RNA 阳性网织红细胞群更迅速 。 因 此 ,在 急 性 暴 露 试 验 中 , 与 基 于 RNA 含 量识别未成熟红细胞的方法相比 ,检测 CD71+ 未成熟红细胞 更 易 观 察 到 显 著 的 毒 性 效 应 ,这 也 是 短 期 染 毒 场 景下优先采用该指标定义最高剂量的原因 。

　　6.3.2.3 对于表现出毒代动力学特性饱和的化学品 ,或者能诱导解毒过程可能导致长期染毒后暴露水平下降的化学品 ,应根据具体情况进行个别评估 。

　　6.3.2.4 为获得剂量-反应关系信息 ,完整的试验应包括一个阴性对照组和至少三个剂量组 ,相邻剂量间距可为 2倍 ,但不超过 4倍 。若预试验或已有数据表明受试物不引起毒性反应 ,在染毒时间 14 d及以上的试验中 ,最高剂量设定(按体重计)为 1000mg/(kg · d) ;在染毒时间少于 14d 的试验中 ,最高剂量设定(按体重计)为 2 000 mg/(kg · d) 。若受试物引起毒性反应 ,则染毒的最高剂量应为最大耐受剂量 ,所使用的剂量宜覆盖从最高剂量至几乎不产生毒性或无毒性的剂量范围 。 当在所有试验剂量水平下都观察到靶 组 织(例 如 骨 髓) 毒 性 时 , 可 在 无 毒 性 剂 量 下 进 一 步 研 究 。若 需 获 得 定 量 剂 量-反 应 关系 ,宜增加额外的剂量组 。对于某些类型的受试物(例如受特定要求约束的人用药物) ,应根据具体情况进行评估 。

　　6.3.3 限量试验

　　在证实受试物可到达靶组织(例如骨髓)的前提下 ,若预试验或相关动物品系的现有数据表明 ,使用限制剂量(如下所述)染毒未产生可观测到的毒性效应(包括未抑制骨髓增殖或无其他靶组织细胞毒性的证据) ,并且根据体外遗传毒性试验结果或结构相似化学品的数据预计受试物不会出现遗传毒性 ,则不必使用三个剂量水平进行完整试验 ;在限制剂量下进行单一剂量水平的试验即可满足要求 。若染毒时间在 14 d及以上 , 限制剂量(按体重计)为 1 000 mg/(kg · d) ;若染毒时间少于 14 d, 限制剂量(按体重计)为 2 000 mg/(kg · d) 。

　　6.3.4 染毒途径

　　在设计试验时 ,应根据预期的人体暴露途径选择适当的染毒方式 ,例如饮食 、饮水 、局部皮下注射 、静脉注射 、经口(灌胃) 、吸入 、气管内注入或植入等 。所采用的染毒途径应确保靶组织的充分暴露 。不宜使用腹腔注射 , 因为其不是预期的人体暴露途径 ,若使用应说明理由 。若将受试物掺入饲料或饮水中进行染毒 ,尤其是单次染毒时 ,从动物摄入饲料或饮水到进行样本采集之间应保留足够的时间间隔 ,从而能检测到受试物引起的毒性效应 。一次灌胃或注射染毒的最大液体体积取决于实验动物的大小 ,例如大鼠灌胃染毒每 100g体重不宜超过 1 mL,对于水溶液每 100g体重不宜超过 2 mL。若需使用超过限量的体积 ,应说明理由 。应通过调整受试物的浓度来减少染毒体积的变化 ,确保所有剂量水平均按动物体重比例 , 以恒定体积进行染毒 。但刺激性或腐蚀性受试物除外 ,其在较高浓度可增强毒性效应 。

　　6.3.5 染毒程序

　　6. 3.5. 1 宜进行 2 次或更多次的染毒 ,每次染毒间隔 24h,尤其是将本试验与其他毒性试验结合时 。若存在合理依据 ,可进行单次染毒(例如受试物可引起细胞周期阻滞) 。若染毒较大体积的溶液 ,可分次进

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　　行 , 即在 24h 内进行 2 次或多次染毒 ,染毒间隔为 2 h~ 3 h。大体积染毒或通过吸入途径染毒时 ,采样时间应根据末次染毒时间或暴露结束时间进行安排 。

　　6.3.5.2 试验可在小鼠或大鼠中通过以下三种方式之一进行 。

　　a) 单次染毒 。骨髓样本 : 至 少 采 集 两 次 , 首 次 采 样 时 间 不 早 于 染 毒 后 24 h, 末 次 不 超 过 染 毒 后48h。不同采样之间应保持适当的时间间隔 。若采样时间早于染毒后 24 h,应说明理由 。若受试物具有极长半衰期 ,可使用其他适宜的采样时间 。外周血样本 : 至少采集两次 ,首次采样时间应在染毒后 36h,后续采样间隔适当 ,末次不超过 72 h。在第一个采样时间点,应对所有剂量组进行采样和分析 ;在后续采样时间点,可仅采集最高剂量组 。若某一采样时间点检测到阳性反应 ,则不必继续采样 。若需获取定量剂量-反应关系信息 ,可进行额外采样 。

　　b) 若染毒 2 次(例如间隔 24 h染毒 2 次) ,骨髓样本应在末次染毒后 18 h~ 24 h 内采集一次 ,外周血样本应在末次染毒后 36h~48h 内采集一次 。

　　c) 若染毒 3 次或以 上(例 如 间 隔 24 h 染 毒 3 次 或 以 上) , 应 在 末 次 染 毒 后 24 h 内 采 集 骨 髓 样本 ,或在末次染毒后 40 h 内采集外周血样本 。

　　注 : a)和 b)中的采样时间是根据微核在靶组织中 出 现 与 清 除 的 动 力 学 规 律 确 定 的 。 c) 中 的 染 毒 方 案 适 合 将 彗 星试验(例如末次染毒后 2 h~ 6 h采样) 与 微 核 试 验 相 结 合 , 同 时 也 便 于 将 微 核 试 验 与 重 复 剂 量 毒 性 试 验 相 结合 。 当进行 3 次或更多次染毒时 ,能在更宽的时间范围内观察到微核 。

　　6.3.5.3 若适用 ,为了将微核试验和其他毒性试验相结合 ,可采用其他染毒或采样方案 。

　　6.3.6 观察

　　应对实验动物进行临床观察 ,每天至少记录一次临床体征 ,宜在每天的同一时间进行 ,并考虑染毒后预期效应的峰值时段 。染毒期间 ,所有动物每天应至少观察两次是否发病及有无死亡情况 。所有动物应在试验开始时及 安 乐 死 前 称 体 重 , 在 重 复 染 毒 期 间 每 周 至 少 称 重 一 次 。 在 为 期 至 少 一 周 的 试 验中 ,应每周至少称量一次饲料消耗量 。若通过饮水给予受试物 ,应在每次换水时测量饮水消耗量 ,每周至少测量一次 。 出现非致死性过度毒性指标的动物 ,应在试验周期结束前实施人道安乐死 。染毒引起的体温异常可能产生虚假结果 ,若适用 ,可监测动物体温 。

　　6.3.7 靶组织暴露

　　应在适当时间采集血液样本 ,检测受试物的血浆浓度获取暴露相关数据 ; 当缺乏其他可证明骨髓暴露的数据时 ,该血浆浓度检测结果可作为受试物已发生骨髓暴露的证明依据 。

　　6.3. 8 骨髓/血液样本制备

　　6.3. 8. 1 对动物实施人道安乐死后 ,立即从其股骨或胫骨采集骨髓细胞(若适用 ,可采用胸骨) 。宜使用已建立的方法采集细胞 、制片和染色 。应满足动物福利标准采集少量外周血 ,可采用能让实验动物存活的方法从尾静脉或其他适宜血管采血 ,也可在对动物实施人道安乐死时通过心脏穿刺或从大血管采血 。对于骨髓或外周血 来 源 的 红 细 胞 , 根 据 分 析 方 法 的 不 同 , 细 胞 可 立 即 进 行 体 外 活 体 染 色 或 制 片 后 染色 , 以便用于显微镜观察 ;或固定并染色后进行流式细胞术分析 。 为排除因使用非 DNA 特异性染料造成的部分假象 ,可使用 DNA特异性染料进行染色 ,例如吖啶橙(Acridine orange) 或赫斯特 33258(Ho- echst33258) 联 合 焦 宁Y(Pyronin Y) 。 也 可 使 用 常 规 染 色 , 例 如 用 于 显 微 镜 分 析 的 吉 姆 萨 染 液(Giemsa) 。其他适宜的方法也可使用 ,例如用纤维素柱清除有核细胞 。

　　6.3. 8.2 若适用 ,使用抗动粒抗体 、泛着丝粒 DNA探针进行荧光原位杂交或泛着丝粒特异性引物进行引物原位标记 ,并结合适当的 DNA复染 ,可用于鉴定微核的性质(染色体/染色体断片) , 以便判断微核形成的机制是否源于染色体断裂作用和/或非整倍体诱变作用 。也可用其他有效的方法区分染色体断

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　　裂剂和非整倍体诱变剂 。

　　6.3.9 分析(人工分析和自动分析)

　　6.3.9. 1 所有用于分析的玻片或样本 ,包括阳性对照和阴性对照 ,应在分析前进行独立编号和随机分组 , 以确保阅片者无法知晓染毒情况 ; 当使用不依赖于目视镜检且不受阅片者偏差影响的自动分析系统时 ,不必进行此类编号 。每只动物的骨髓至少应计数 500个红细胞 ,外 周 血 至 少 应 计 数 2 000个 红 细胞 ,计算未成熟红细胞占总红细胞(未成熟 +成熟) 的比例 。 每只动物至少应计数 4 000个未成熟红细胞 ,统计未成熟红细胞的微核细胞率 , 以千分率来表示 。若一个未成熟红细胞中存在多个微核 , 只按 一个含微核细胞计数 。若检测实验室的历史阴性对照数据库显示未成熟红细胞微核细胞率的背景均值低于 0. 1% ,应增加细胞计数量 。采用显微镜分析时 ,染毒动物未成熟红细胞占总红细胞的比例不应低于溶剂/赋形剂对照组相应比例的 20% ;采用流式细胞术检测 CD71+ 未成熟红细胞时 ,该比例不应低于溶剂/赋形剂对照组相应比例的 5% 。

　　6.3.9.2 大鼠脾脏可选择性清除含微核的红细胞 ,在分析大鼠外周血时 , 为保持检测的高灵敏度 ,宜分析新生的未成熟红细胞 。

　　注 : 采用自动化分析方法时 ,新生的未成熟红细胞能通过其高 RNA含量或表面高表达的 CD71进行识别 。多种染色方法(包括吖啶橙染色法)均能符合分析标准 。

　　7 试验数据和报告

　　7. 1 数据处理

　　应以表格的形式列出每只动物的资料 ,统计检验以动物为试验单位 。对每只被分析的动物应分别列出以下数据 :未成熟红细胞数 ,含微核的未成熟红细胞数 , 以及未成熟红细胞占总红细胞的比例 。 当小鼠连续染毒 4周或以上时 ,若收集到含微核成熟红细胞的数量及所占比例 ,也应列出 。此外 ,还应报告动物毒性数据和临床症状 。

　　7.2 质量控制

　　以下为试验的可接受性标准 :

　　a) 平行阴性对照数据经判定可纳入本实验室历史对照数据库 ;

　　b) 平行阳性对照或评分对照所诱导的反应与历史阳性对照数据库一致 ,且与平行阴性对照相比在统计学上显著增加 ;

　　c) 已分析了符合试验数量要求的剂量组和细胞 ;

　　d) 最高剂量的选择标准符合 6. 3. 2 的要求 。

　　7.3 结果评价和解释

　　7.3. 1 在符合 7. 2 中所有可接受性标准的前提下 ,若还符合以下条件 ,则受试物被判定为阳性 :

　　a) 与平行阴性对照 组 相 比 , 至 少 有 一 个 剂 量 组 未 成 熟 红 细 胞 的 微 核 细 胞 率 出 现 统 计 学 显 著 性增加 ;

　　b) 经适当的趋势检验评估 ,微核细胞率的增加至少在某一采样时间点呈现剂量-反应关系 ;

　　c) 上述任一结果超出历史阴性对照数据分布范围(例如泊松分布 95%控制限) 。

　　注 : 若在某特定采样时间仅检测最高剂量组 , 当受试物与平行阴性对照组相比出现统计学显著性增加 ,且结果超出历史阴性对照数据的分布范围(例如泊松分布的 95%控制限)时 ,则判定受试物呈阳性 。在进行剂量-反应分析

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　　时 ,至少包含三个剂量组 。微核试验的阳性结果表明 ,受试物能诱导产生微核 ,这些微核是实验动 物 成 红 细 胞(骨髓内生成红细胞的前体细胞 ,含细胞核)染色体损伤或有丝分裂器损伤的结果 。在检测微核内着丝 粒 的 试验中 ,若受试物能诱导产生含着丝粒的微核(着 丝 粒 DNA 或 动 粒 , 提 示 整 条 染 色 体 丢 失) ,则 证 明 该 受 试 物 是非整倍体诱变剂 。

　　7.3.2 在符合 7. 2 中所有可接受性标准的前提下 ,若还符合以下条件 ,则受试物被判定为阴性 :

　　a) 与平行阴性对照组相比 ,所有剂量组未成熟红细胞的微核细胞率均无统计学显著性增加 ;

　　b) 经适当的趋势检验评估 ,在任何采样时间点均无剂量-反应关系 ;

　　c) 所有结果均位于历史阴性对照数据分布范围内(例如泊松分布 95%控制限) ;

　　d) 受试物已发生骨髓暴露 。

　　注 : 骨髓暴露于受试物的证据可能包括未成熟红细胞与成熟红细胞的比值降低 , 或检测受试物在血浆或血液中的浓度 。若为静脉注射 ,不必提供暴露证据 。此外 ,使用相同暴露途径和动物物种单独开展一项试验 , 获 得 吸 收(Absorption) 、分布(Distribution) 、代谢(Metabolism)和排泄(Excretion) 的数据也 能 证 明 骨 髓 暴 露 。 阴 性 结 果表明在本试验条件下 ,受试物不会诱导实验动物的未成熟红细胞形成微核 。

　　7.3.3 对明确阳性或阴性的受试物不必验证 。

　　7.3.4 若结果不是明确阳性或阴性 , 为确定结果(例如微弱增加或临界增加) 的生物相关性 ,应通过专家判断和/或进一步调查已完成的试验来评估数据 。若适用 ,可增加细胞分析数量或改变试验条件进一步试验 。

　　7.3.5 在极少数情况下 ,经过进一步调查 ,数据也无法得出受试物是阳性或阴性的结论 ,试验应被判定为结果不明确 。

　　7.4 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物信息 :

　　1) 名称 、来源 、批号和使用限制 日期(如适用) ;

　　2) 受试物的稳定性(如已知) ;

　　3) 单组分物质 : 提 供 物 理 性 状 、水 溶 性 、其 他 相 关 理 化 性 质 和 化 学 标 识 信 息 。 化 学 标 识 信息 ,包括国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)或化学文摘社(CAS)名称 、CAS编号 、简化分子线性输入规范(SMILES)或国际化学品标识符(InChI)代码 、结构式 、纯度 , 以及杂质的化学鉴定信息(若适用)等 ;

　　4) 多组分物质 ,未知或可变组分 、复杂反应产物或生物材料(UVCBs) 以及混合物 :通过各组分的化学标识信息 、含量以及相关理化性质进行表征 。

　　b) 受试物准备 :

　　1) 溶剂/赋形剂的选择依据 ;

　　2) 受试物在溶剂/赋形剂中的溶解度和稳定性(如已知) ;

　　3) 饮食 、饮水或吸入制剂的制备情况 ;

　　4) 制剂的分析测定情况(例如稳定性 、均一性和标称浓度)(如已进行) 。

　　c) 实验动物 :

　　1) 动物物种/品系及选用依据 ;

　　2) 动物数量 、周龄和性别 ;

　　3) 动物来源 、饲养条件和饲料等 ;

　　4) 实验动物的唯一标识方法 ;

　　5) 短期研究 :每只动物试验开始和结束时的体重 ;超过一周的研究 :试验期间每只动物的体

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　　重和食物消耗量 。应包括每组动物的体重范围 、平均值和标准差 。

　　d) 试验条件 :

　　1) 阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照数据 ;

　　2) 剂量预试验的资料(如有) ;

　　3) 剂量水平的选择依据 ;

　　4) 受试物制备的详细资料 ;

　　5) 受试物染毒方式的详细资料 ;

　　6) 染毒途径和持续时间的依据 ;

　　7) 证明受试物到达体循环或靶组织的方法 ;

　　8) 根据饲料/饮水中的受试物浓度和消耗量计算的实际剂量(按体重计)[(mg/(kg · d)](如适用) ;

　　9) 饲料和饮水质量的详细资料 ;

　　10) 安乐死的方法 ;

　　11) 镇痛的方法(如使用) ;

　　12) 详细说明染毒程序和采样的时间安排及选择依据 ;

　　13) 制备玻片的方法 ;

　　14) 样本分离和保存程序 ;

　　15) 毒性测定的方法 ;

　　16) 含微核未成熟红细胞的评分标准 ;

　　17) 每只动物所分析的细胞数 ;

　　18) 试验的可接受性标准 ;

　　19) 说明微核是否包含完整染色体或染色体断片的方法(如适用) 。

　　e) 结果 :

　　1) 试验前及整个试验期间动物的状态 ,包括毒性体征 ;

　　2) 未成熟红细胞占总红细胞的比例 ;

　　3) 每只动物分别列出含微核未成熟红细胞的数量 ;

　　4) 每组动物含微核未成熟红细胞的平均值和标准差 ;

　　5) 剂量-反应关系(如有) ;

　　6) 应用的统计分析及方法 ;

　　7) 平行阴性对照和阳性对照数据 ,包括范围 、平均值和标准差 ;

　　8) 历史阴性对照和阳性对照数据 ,包括范围 、平均值 、标准差和分布的 95%控制限 , 以及涵盖的时间范围和数据点数量 ;

　　9) 证实骨髓暴露的数据 ;

　　10) 说明微核中含有完整染色体或染色体断片的特征数据(如适用) ;

　　11) 符合阳性或阴性的判定标准 。

　　f) 结果讨论 。

　　g) 结论 。

　　h) 参考文献 。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　鉴别体内微核试验性别差异的析因设计

　　A. 1 在析因设计中 ,每个浓度水平至少检测 5 只雄性动物和 5 只雌性动物 ,为满足设计要求 ,需至少使用 40只动物(20只雄性和 20只雌性 ,含相关的阳性对照组) 。

　　A.2 鉴别体内微核试验性别差异的析因设计等效于以性别和浓度水平为主效应的双因素方差分析 。数据可使用标准统计软件进行分析 。

　　A.3 将数据集中的变异分解为性别主效应变异 、浓度主效应变异和性别 ×浓度交互效应变异 。上述各项变异均通过与组内误差变异的估计值进行统计检验 ,该误差变异源于相同性别-相同浓度处理组中重复动物间的随机变异 。详细方法可参考统计学教材及统计软件的 “帮助 ”文档 。

　　A.4 首先通过方差分析表评估性别 ×浓度交互项的显著性 。若交互作用无统计学显著性 ,则利用合并组内误差均方 ,对跨性别或跨浓度合并数据的主效应进行有效的统计检验 。

　　A.5 浓度效应变异可进一步通过正交多项式对比分解为线性趋势和二次趋势 。 当存在显著交互作用时 ,需扩展分析至性别 ×线性交互项(检验剂量 -反应斜率差异)和性别 ×二次交互项(检验剂量 -反应曲线形态差异) 。此类检验能评估两种性别在浓度响应上是否平行 ,或是否存在性别间的差异反应 。

　　A.6 合并组内变异的估计值可用于对均值差异进行成对检验 。 比较可在两种性别的均值间和不同浓度水平的均值间(例如与阴性对照组比较)进行 。 当交互作用显著时 ,可在同性别内不同浓度的均值间或同浓度下不同性别的均值间进行比较 。

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　　参 考 文 献

　　[1] HayashiM , Dearfield K , Kasper P, LovellD, Martus HJ, Thybaud V. Compilation and use ofgenetic toxicity historical control data[J] . MutatRes. , 2011, 723(2) :87-90.

　　[2] OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 474 Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test(2016)

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