GB/T 21750-2025 化学品 毒物代谢动力学试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21750—2025代替 GB/T21750—2008

　　化学品 毒物代谢动力学试验方法

　　Chemicals—Testmethod oftoxicokineticsstudies

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21750—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21750—2008《化 学 品 毒 物 代 谢 动 力 学 试 验 方 法》, 与 GB/T 21750—2008相

　　比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 增加了 “缩略语 ”内容(见第 4章) ;

　　b) 更改了 “试验基本原则 ”内容(见第 5 章 ,2008年版的第 4章) ;

　　c) 更改了 “试验方法 ”内容(见第 6 章 ,2008年版的第 5 章) ,增加了 “预试验 ”内容和 “实验动物 ”内容(见 6. 1、6. 2) ;

　　d) 增加了 “临床观察 ”内容(见 6. 4) ;

　　e) 增加了 “补充的方法 ”内容(见 6. 5) ;

　　f) 更改了 “试验数据和报告 ”内容(见第 7章 ,2008年版的第 6章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、首都医科大学 、辽宁省疾病预防控制中心 。

　　本文件主要起草人 :李斌 、陈宵 、牛丕业 、肖经纬 、张意 、边洪英 、李晓然 、洪秀娟 、宁丽丽 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21750—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21750—2025

　　引 言

　　对化学物质的毒物代谢动力学(TK)研究是为了获得其吸收 、分布 、生物转化(即代谢) 和排泄的充分信息 , 以帮助将浓度或剂量与观察到的毒性联系起来 ,并帮助理解其毒性机制 。TK 可通过证明测试动物系统地暴露于测试物质 ,并揭示哪些是循环的分子(母体物质/代谢物)来帮助理解毒理学研究 。这些研究确定的基本 TK参数还将提供有关测试物质在组织和/或器官中潜在积累以及由于暴露于测试物质而诱导生物转化潜力的信息 。

　　TK数据有助于评估动物 毒 性 数 据 的 充 分 性 和 相 关 性 , 以 便 外 推 到 人 类 危 害 和/或 风 险 评 估 。此外 ,毒物代谢动力学研究可为确定毒性研究的剂量水平(线性与非线性动力学) 、染毒途径效应 、生物利用度以及与研究设计相关的问题提供有用信息 。某些类型的 TK数据可用于生理基础毒物代谢动力学(PBTK)模型的开发 。

　　代谢物/TK数据的重要用途包括提示可能的毒性和作用模式及其与剂量水平和暴露途径的关系 。此外 ,代谢数据可提供有助于评估测试物质外源性代谢物暴露的毒理学意义的信息 。

　　充分的毒物代谢动力学数据将有助于支持进一步接受和适用定量结构-活性关系 、类比或分组方法在物质安全评估中的应用 。动力学数据还可用于评估其他研究(例如体内/体外)的毒理学相关性 。

　　除特别说明外 ,本文件主要应用于经口暴露途径 。

　　Ⅱ

　　GB/T 21750—2025

　　化学品 毒物代谢动力学试验方法

　　1 范围

　　本文件确立了化学品毒物代谢动力学试验的试验基本原则 ,描述了试验方法 ,规定了试验数据和报告内容 。

　　本文件适用于化学品的毒物代谢动力学试验 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB 14925 实验动物 环境及设施

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　毒物代谢动力学 toxicokinetics

　　研究受试物在体内随时间的吸收 、分布 、代谢和排泄过程的科学 。

　　3.2

　　房室 compartment

　　机体 、组织或细胞中与其他部分分离的结构或生化单元 。

　　3.3

　　吸收 absorption

　　受试物原型或代谢产物进入体内或组织的过程 。

　　3.4

　　分布 distribution

　　进入体循环的受试物向机体各可分布的体液 、组织 、脏器转运的过程 。

　　3.5

　　代谢 metabolism

　　(通常为酶促的)受试物在体内被化学转化为另一种不同化学物质的过程 。

　　注 : 代谢又称为生物转化 。

　　3.6

　　排泄 excretion

　　受试物和(或)代谢产物向机体外转运的过程 。

　　3.7

　　半衰期 halflife

　　t1/2

　　1

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　　在某个房室中 ,受试物浓度降低至其初始浓度的一半所需的时间 。

　　注 : 它通常指血浆中的浓度或受试物在全身中的量 。

　　3. 8

　　蓄积 accumulation

　　生物蓄积 bioaccumulation

　　受试物随暴露时间延长而在组织中含量增加的现象 。

　　注 1: 蓄积一般见于重复染毒暴露的脂肪组织 。

　　注 2: 如果化学物进入体内大于其消除速度 ,机体就会蓄积受试物并可能达到毒性作用浓度 。

　　3.9

　　血浆毒物浓度-时间曲线下面积 area undertheplasma concentration-timecurve;AUC

　　在血浆毒物浓度随时间变化的曲线图中 , 曲线下方的面积 。

　　注 : 代表了在预定时间内被身体吸收的受试物总量 。在线性条件下 ,从时间零点到无穷大的 AUC与被身体吸收的受试物总量成正比 ,与吸收速率无关 。

　　3. 10

　　放射自显影 autoradiography

　　整体放射自显影 whole-body autoradiography

　　用于定量和/或定性检测放射性标记受试物组织分布的一种技术方法 。

　　注 : 该技术利用同位素标记的分子或片段能够发射放射线的特点,在 X胶片上或用数 字 化 成 像 技 术 显 影 成 像 。 与组织解剖相比较 ,整体放射自显影技术在评价受试物 组 织 分 布 和 估 算 同 位 素 标 记 化 合 物 在 组 织 总 回 收 率 及 分辨率方面具有独特优势 , 比如使用动物染色技术模型评价黑色素标记的受试物与靶分子结合情况 。然而 ,整体放射自显影对于高浓度低亲和力结合位点情况存在优势 ,但是在检测高分辨率和高灵敏度靶位点,如受体结合位点时均存在不足 。 当使用整体放射自显影技术测量质量平衡时 ,设立单独的试验组或单独进行试验 ,而不是与分布研究一起进行 ,其中所有排泄物(包括呼出气)和整个躯体都要匀浆后进行液闪仪计数 。

　　3. 11

　　胆汁排泄 biliary excretion

　　受试物或其代谢产物通过肝脏进入胆汁 ,通过胆管排出体外的过程 。

　　3. 12

　　生物利用度 bioavailability

　　染毒剂量进入机体全身循环的剂量分数 ,或到达生物活性部位的剂量分数 。

　　注 : 一般情况下 ,生物利用度是指母体化合物的生物 利 用 度 ,也 指 代 谢 产 物 的 生 物 利 用 度 。请 注 意 : 生 物 利 用 度 和吸收是不同的两个概念 。经口吸收是指物质进入肠 壁 和 门 脉 循 环 , 而 生 物 利 用 度 是 指 物 质 存 在 于 血 液 系 统 和组织中 。造成两者区别的原因是肠壁代谢 、肠腔外排或体循环前的肝脏代谢(肝脏首过) 等因素 。毒性成分(原型或代谢产物)的生物利用度是进行人类健康风 险 评 估 的 一 个 重 要 参 数 。人 类 健 康 风 险 评 估 需 要 进 行 高 剂 量向低剂量的外推和不同染毒途径间的外推 ,而生物利用度是将外在的无明显有害作用水平(NOAEL) 或基准计量值(BMD)推导出内在数值的一个必要的参数 。对于经口染毒存在的肝脏效 应 ,经 口 吸 收 就 能 满 足 风 险 评 估的需要 。然而 ,对于存在进入门脉以 外 的 其 他 效 应 , 生 物 利 用 度 通 常 是 比 吸 收 更 为 可 靠 的 用 于 风 险 性 评 估 的参数 。

　　3. 13

　　持续性 persistence

　　生物持久性 bio persistence

　　由于对降解和消除的耐受使得化合物在生物体内长时间存在 。

　　3. 14

　　生物转化 biotransformation

　　(通常为酶促的)在体内一种物质的化学结构转变为另一种不同结构物质的过程 。

　　注 : 与 “代谢 ”是同义词 。

　　2

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　　3. 15

　　峰浓度 maximum concentration

　　Cmax

　　染毒后血浆或血清中受试物的最高浓度 ,或受试物在尿或粪便中的最大排泄量 。

　　3. 16

　　清除率 clearancerate

　　在单位时间内 ,受试物从血液 、血浆或某组织中移除的速率 。

　　3. 17

　　解毒路径 detoxification pathways

　　受试物从体内消除的系列步骤 。

　　注 : 通过代谢转化 ,也通过排泄 。

　　3. 18

　　酶 enzymes

　　催化化学反应的蛋白质 。

　　3. 19

　　同功酶 isozymes

　　一组在功能上相同但结构上存在差异的酶 。

　　注 : 这些酶能够催化相同的化学反应 ,但它们的氨基酸序列 、蛋白质结构或来源可能不同 。

　　3.20

　　外源性 exogenously

　　从生物体或系统外部引入或产生的 。

　　3.21

　　外推 extrapolation

　　以已知或观察到的值为依据 ,推测一个或多个未知数值的过程 。

　　3.22

　　线性动力学 linearkinetics

　　受试物在房室间所有的转运速率都与受试物的浓度或量呈一定的比例关系 。

　　注 : 一级动力学 。线性动力学的消除速率 、分布体积和半衰期均为恒量 。 由于达到的浓度与剂量呈现比例关系 , 因此更容易预测蓄积性 。通过比较不同剂量或单次和 重 复 染 毒 后 的 相 关 参 数(如 AUC) 来 判 定 线 性 或 非 线 性 动力学特征 。暴露量与剂量不呈现相关性 ,表示参 与 该 化 合 物 的 代 谢 酶 出 现 了 饱 和 。重 复 多 次 染 毒 与 单 次 染 毒比较 ,AUC增加表示发生酶抑制 ,AUC降低意味酶诱导 。

　　3.23

　　质量平衡 massbalance

　　物料平衡 materialbalance

　　受试物进入和离开系统的物料平衡核算 。

　　3.24

　　毒性机制 mechanism oftoxicity

　　能够使受试物产生效应的相关生化反应 。

　　3.25

　　作用机制 mechanism ofaction

　　能够引起受试物毒性的比毒性机制更广泛的途径 。

　　3.26

　　代谢物 metabolites

　　代谢或代谢过程的产物 。

　　3

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　　3.27

　　纳米材料 nanomaterials

　　粒径在 1 nm~ 100 nm 之间的材料 。

　　注 : 其尺寸在一维 、两维或三维满足条件 ,或者其内部或表面结构满足条件 。

　　3.28

　　经口吸收 oralabsorption

　　在染毒部位(如消化道)吸收的受试物的量占染毒剂量的百分数 。

　　注 : 用于衡量受试物染毒后到达门脉系统和肝脏的量占染毒剂量的比例 。

　　3.29

　　分配系数 partition coefficient

　　衡量受试物在两种溶剂中不同溶解度的参数 。

　　注 : 也被称作分布系数(distribution coefficient) 。

　　3.30

　　血液峰水平 peak blood levels

　　染毒后血液(血浆/血清)中最大(峰)浓度 。

　　3.31

　　交叉参照 read-across

　　用一个或多个化合物终点信息来预测目标化合物终点的方法 。

　　3.32

　　受体显微放射自显影 receptormicroscopicautoradiography;receptormicroautoradiography

　　用来研究受试物与特定组织或细胞群的相互作用的一项技术 。

　　注 : 比如可用于受体结合试验和特异性作用模式研究 ,该 项 技 术 具 有 整 体 放 射 自 显 影 等 技 术 所 不 具 备 高 分 辨 率 和高灵敏度等优点 。

　　3.33

　　染毒途径 routeofadministration

　　将受试物给予机体所使用的方法 。

　　注 : 如经口灌胃 、饲料添加 、皮肤 、吸入 、静脉注射等 。

　　3.34

　　饱和 saturation

　　一个或多个动力学过程(如吸收 、代谢或清除)达到最大容量或效率的状态 。

　　3.35

　　灵敏度 sensitivity

　　检测方法或仪器对所关注的不同水平的变量的分辨能力 。

　　3.36

　　稳态血液水平 steady-stateblood levels

　　在开放系统中 ,受试物的吸收与消除速率相等 ,系统虽处于静止状态 ,但血液中的受试物浓度保持相对稳定 。

　　注 : 在这种状态下 ,尽管受试物在通过该系统 ,但是其组分的浓度是不变的 。

　　3.37

　　系统模型 systemsmodelling

　　用数学语言来描述系统行为的抽象模型 。

　　注 : 包括基于生理性的毒物代谢动力学模型 、基于药物动力学的模型 、基于生理性的药物动力学模型和基于生物学的模型等 。

　　4

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　　3.38

　　靶组织 targettissue

　　受试物的主要有害反应涉及的组织 。

　　3.39

　　组织分布 tissuedistribution

　　受试物在体内从一个部位到另一个部位的可逆性移动过程 。

　　注 : 进行组织分布研究的方法包括组织器官解剖取材 、匀浆及组织匀浆中化学物浓度测定(放射性标记物则采用燃烧及液闪仪计数) , 以及定性和/或定量整体放射 自 显 影 。前 者 方 法 可 以 对 同 一 只 动 物 的 组 织 和 剩 余 尸 体 计 算浓度含量和回收率 ,但由于不能囊括所有组织 , 回收率可能达不到理想的总体回收率(小于 90%) 。

　　3.40

　　达峰时间 time to maximum concentration

　　Tmax

　　血毒物浓度达到峰值(Cmax)的时间 。

　　3.41

　　模型确证 validation ofmodels

　　评估模型是否能够一致地描述可用的毒物代谢动力学数据的过程 。

　　注 : 模型通过统计和视觉比较模型预测值与试验值来评 估 ,这 些 比 较 通 常 以 一 个 共 同 的 独 立 变 量(例 如 时 间) 为 基准 。评估的范围根据模型的预期用途进行合理化 。

　　4 缩略语

　　ADME: 吸收 、分布 、代谢和排泄(Absorption,Distribution,Metabolism and Excretion)

　　5 试验基本原则

　　5. 1 根据试验目的 ,对一组或多组实验动物分别给予单次染毒或在规定时间内多次染毒 。 随后 ,按照试验要求 ,测定动物体液 、组织和(或)排泄物中受试物和(或)其代谢产物的量或浓度的经时变化 。在此基础上 ,选择或建立受试物在体内的适当模型及数据表达式 ,进行毒-时曲线拟合 ,计算相关的毒物代谢动力学参数 ,并探讨其毒理学意义 。

　　5.2 毒物代谢动力学研究的设计具备灵活性 ,依据化学品的特性及具体需求选择适宜的研究内容 。并非所有研究均需全面开展 ,有时仅需针对特定问题收集数据 。毒物代谢动力学数据可作为其他毒理学研究的一部分获取 ,也可能需要额外的研究以满足新的评估需求 。

　　5.3 在开展毒物代谢动力学研究之前 ,要预先全面了解受试物及其代谢产物和类似物的已有信息 , 以提高研究质量和避免不必要的实验动物使用 。 这些信息来 自实验室 , 如体内研究(in vivo) 、体外研究(in vitro)和/或计算机模拟(insilico)评价 。受试物的物理化学特性 ,如正辛醇-水的分配系数(lgPow ) 、 pKa、水溶性 、蒸气压和分子量等均有助于研究设计和结果解释 。

　　5.4 本文件不适用于某些特殊情况 ,例如怀孕或泌乳动物 、幼龄动物 , 以及可食用动物中潜在物质残留的评估 ,但可用于指导此类特殊研究的试验设计 。

　　6 试验方法

　　6. 1 预实验

　　宜在正式试验开始前开展预试验以确定正式试验的研究内容 ,例如代谢转化 、质量平衡 、剂量范围

　　5

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　　选择 、分析程序以及呼出气 CO2 检测等 ,从而为正式试验的试验设计提供科学依据 。

　　6.2 实验动物

　　6.2. 1 动物种系选择

　　可用一种或数种实验动物进行毒物代谢动力学研究 。尽量选用与其他毒性试验方法相同品系 ,并能出现受试物典型毒作用的动物 。一般首选大鼠 ,若关键毒理学研究显示其他物种存在显著毒性 ,或其毒性/毒物代谢动力学特征与人类更为相关 ,则可使用其他物种 。

　　6.2.2 年龄和品系

　　试验应使用 6周龄 ~ 12周龄的年轻健康成年动物 ,并说明选择这种动物的理由 。所有动物的年龄应相近 ,个体体重差异不得超过组平均体重的 ±20% 。应选择与建立化学物质毒理学数据库时使用的相同品系 。

　　6.2.3 数量与性别

　　通常情况下 ,应选用未生育且非妊娠的雌性动物 。每一试验组的动物数量不少于 4 只(单一性别) 。若已有证据表明不同性别动物在相关指标上存在显著差异 ,应同时使用两种性别的动物 ,雌雄各 4 只 。

　　6.2.4 动物饲养条件

　　饲养条件应符合 GB 14925要求 。实验动物房应维持温度 23 ℃ ±3 ℃ ,相对湿度 30% ~ 70% 。 动物于代谢笼中单独饲养 ,特殊情况可考虑群体饲养 。采用人工光照 ,保持 12 h 光照和 12 h 黑暗交替循环 。常规实验室饲料喂养 ,饮水不限 。非啮齿类动物可采用其他相关的饲养条件 ,饲料成分需给出 ,并考虑其对试验的影响 。

　　6.3 试验条件

　　6.3. 1 受试物

　　6.3. 1. 1 应采用合适的分析方法对受试物及其纯度进行检测 。受试物的纯度( % w/w) 一般不应低于98% 。如果 采 用 放 射 性 同 位 素 标 记 的 受 试 物 , 其 放 化 纯 度 不 应 低 于 95%( % w/w) , 杂 质 应 低 于 2% ( % w/w) 。应提供受试物的纯度以及杂质的种类和含量的检测报告 。

　　6.3. 1.2 在进行质量平衡和代谢物鉴定研究时 ,应使用 14C标记的测试物质 。不过 ,如果能证明未标记的测试物质也能充分评估质量平衡和代谢物鉴定或者使用非放射性物质的分析方法在特异性和灵敏度上不低于使用放射性物质的结果 ,可不使用放射性物质 。此外 ,可选择其他放射性或稳定同位素 ,特别是当某个元素与化合物的毒性有关时 。如果可能 ,放射性标记应选择分子中代谢稳定的核心部分 ,避免会交换 、转化为 CO2 或成为生物体碳池一部分的区域 。 必要时 , 可对分子多个部位或特定区域进行标记 , 以便追踪化合物的代谢过程 。

　　6.3.2 染毒剂量

　　6.3.2. 1 预试验

　　预试验通常选择一个剂量 。一般选择无毒剂量 ,并保证在生物样品中(如血液) 有足够浓度的代谢产物便于分析鉴定 , 同时还要能够满足预试验的要求 。

　　6.3.2.2 正式试验

　　6.3.2. 2. 1 正式试验至少选择两个剂量水平 。且两个剂量水平均满足在实验动物排泄物和/或血浆中

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　　进行受试物的代谢产物鉴定 。在选择剂量时 ,可考虑现有毒性数据的信息 。如果没有信息(例如 ,从急性经口毒性研究中记录毒性的临床体征 ,或从重复剂量毒性研究中记录) , 可考虑低于 LD50 (经口和皮肤途径)或 LC50 (吸入途径)估计值或低于急性毒性范围估计值的较高剂量值 。较低剂量应为较高剂量的一定分数 。对于低毒物质 ,经口或经皮染毒考虑 1 000 mg/(kg · d) 作为高剂量的限值(吸入染毒的限值为 2 mg/L) 。

　　6.3.2.2. 2 若仅研究一个剂量水平 ,该剂量应满足在排泄物和/或血浆中进行代谢物鉴定 , 同时不产生明显的毒性 。应提供未包含第二个剂量水平的理由 。

　　6.3.2.2.3 静脉注射染毒通常选择一个剂量 。剂量水平应等于或小于血管外染毒的低剂量 。

　　6.3.2.2.4 当使用放射性同位素标记的受试物进行染毒时 , 同时考虑所用剂量的放射性强度 , 以防止放射性损伤对毒物代谢动力学特征产生影响 。

　　6.3.2.2.5 单次染毒的毒物代谢动力学和组织分布数据通常可用于判断化学物质是否存在积累或持久性风险 。然而 ,在某些情况下 ,可能需要进行多次染毒 , 以更全面地评估积累 、持久性或毒物代谢动力学的变化(例如 ,酶的诱导或抑制) 。对于重复染毒研究 ,通常低剂量的重复染毒即可满足需求 ,但有时也需要进行高剂量的重复染毒 。

　　6.3.3 染毒途径

　　6.3.3. 1 染毒途径应与人群实际接触情况相似 。根据试验目的和要求 ,可选择经口 、经皮或吸入染毒 。应优先采用与其他毒理学试验相同的染毒途径 ,并在可能的情况下使用相同的染毒方式 。

　　6.3.3.2 使用灌胃方式染毒时 ,溶解或混悬受试物的溶剂应与其他经口灌胃毒性试验相同 ,并提供溶剂选择的合理性依据 。经口染毒可采用灌胃 、吞服胶囊 、随饲料或饮水喂饲的方式进行 ,应注意这些不同方式对毒物代谢动力学的潜在影响 。采用喂饲方式染毒时 ,应核实剂量的准确性 。灌胃体积应根据动物大小 、介质类型以及染毒前是否禁食的具体情况确定 。无论是水溶性还是非水溶性溶剂 ,均以实际可操作且尽可能低的体积进行灌胃 。 啮齿类动物的灌胃体积不应超过 10mL/kg,大多数脂溶性受试物的灌胃体积可从 4 mL/kg开始 。在反复染毒时 , 由于无法每天禁食 ,可使用较小的灌胃体积 ,如 2 mL/kg~ 4 mL/kg。灌胃体积应与该受试物其他毒性试验所用灌胃体积一致 。

　　6.3.3.3 为了解受试物的毒物代谢动力学基本特征或计算生物可利用度 ,应采用静脉注射染毒 。受试物需完全溶解或混悬于合适的 溶 剂 中 , 并 选 择 适 当 的 注 射 体 积(如 1 mL/kg) 及 注 射 部 位 进 行 静 脉 染毒 。所用溶剂不应显著影响血液成分或血流 。若采用静脉输注染毒 ,每只动物的输注速度应统 一 。 当使用颈静脉或股动脉插管进行染毒或采血时 ,应对动物实施麻醉 ,并考虑麻醉方法是否对毒物代谢动力学产生影响 。动物应在完全清醒后进行染毒 。

　　6.3.3.4 其他染毒途径 ,如经皮和吸入 ,可根据化学物质的理化性质以及预期的人类使用或暴露情况进行选择性应用 。

　　6.3.3.5 吸入染毒应采用口鼻式装置 , 以防止受试物经其他途径被吸收(若采用其他吸入染毒方式 ,应说明其合理性) 。暴露时间一般为 4 h~ 6 h。

　　6.3.3.6 经皮肤染毒时 ,应使用一种或多种剂量水平的受试物 。受试物(纯物质 、稀释溶液或含有受试物的配方)的测试形式应接近人类暴露情况 。剂量选择时可考虑的因素包括预期人类暴露水平和/或其他经皮毒性研究中观察到毒性效应的剂量 。受试物可溶解于合适的溶剂中 ,并以足够的体积进行涂抹以确保剂量的准确给予 。试验开始前 ,应剪去受试动物躯干背侧区域的毛发 ;若采用剃毛方法 ,应在试验前 24h进行 。剪毛或剃毛时应避免损伤皮肤 , 以免改变皮肤通透性 。受试物涂敷面积一般约占动物体表面积的 10% ;对于高毒性物质 ,涂抹面积可小于 10% ,但应多处覆盖并形成薄且均匀的膜 。各组动物的染毒面积应相同 。涂敷区域应采用适当方法覆盖加以保护 ,染毒后应将每只动物单独饲养 。

　　6.3.3.7 对皮肤染毒部位进行冲洗可用于评价皮肤表面残留量 ,并有助于确定质量平衡(需对同一剂量染毒两只动物) 。受试物至少与皮肤接触 6 h(具 有 腐 蚀 性 受 试 物 可 适 当 缩 短 接 触 时 间) 后 , 去 除 涂 敷

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　　物 ,并用中性皂液和清水对涂敷部位进行冲洗 。通过测定冲洗液中受试物的回收率来评价皮肤冲洗试验的效果 。

　　6.4 临床观察

　　6.4. 1 质量平衡

　　质量平衡通过将各排泄途径排出的受试物及其代谢产物占染毒剂量的百分比相加求得 ,包括尿液 、粪便 、呼出气体 、组织分布 、尸体残留以及笼具清洗液中的含量百分比 。通常受试物染毒量(放射量) 的总回收率应不低于 90% 。

　　6.4.2 吸收

　　6.4.2. 1 初始吸收率可通过从质量平衡测定中扣除胃肠道(GI) 和/或粪便中的剂量百分比进行估算 。若质量平衡研究无法确定经口染毒后的吸收程度(例如 ,粪便中存在超过 20%的给药剂量) ,则需开展进一步研究 。这些研究可包括 :a)经口给予受试物并测定胆汁中的受试物;b) 经口和静脉给予受试物 ,并分别测量两种途径下在尿液 、呼出气体及尸体中的受试物总量 。在上述两种研究设计中 ,放射性测量可作为受试物及其代谢产物化学特异性分析的替代方法 。

　　6.4.2.2 若进行胆汁排泄研究 ,通常采用经口染毒 ,并对至少对 4 只动物(宜包括两种性别)进行胆管插管 。染毒后 ,应监测胆汁中放射性/受试物的排泄情况 ,持续时间足以估算经此途径排泄的给药剂量百分比 ,该数据可用于直接计算经口吸收程度 。计算方法为 :

　　毒量] × 100。

　　吸收百分比= [(胆汁中的量 +尿液中的量 +呼出气体中的量 +无胃肠道内容物的尸体中的量)/染

　　对于某些化学物质 , 吸收剂量可能直接通过肠道黏膜分泌 ,在这种情况下 ,粪便中排泄的剂量并不代表未吸收的剂量 。若可能存在肠道分泌 ,应通过比较经口和静脉染毒的排泄数据来估算吸收百分比 。若需定量肠道分泌 ,可在静脉染毒后 ,通过胆管插管大鼠测量胆汁中的排泄量 。

　　6.4.3 生物利用度

　　6.4.3. 1 生物利用度可以通过经口染毒组和静脉染毒组的血浆/血液动力学数据来确定 ,通过对测试物质和/或相关代谢物进行特定化学分析 , 因此不需要使用放射性标记的测试物质 。然后按公式(1) 计算测试物质或相关代谢物的生物利用度(F) :

　　式中 :

　　AUC — 血毒物浓度-时间曲线下面积 ;

　　Doseiv — 静脉注射染毒下的染毒剂量 ;

　　Doseexp — 不同染毒途径(如经口 、经皮或吸入染毒)下的染毒剂量 。

　　F = (AUCexp/AUCiv) × (Doseiv/Doseexp) …………………………( 1 )

　　6.4.3.2 在系统效应的风险评估中 ,通常优先采用有毒成分的生物利用度 , 而非吸收百分比 ,尤其是在将动物试验中的系统浓度与工人暴露研究中的生物监测数据进行比较时 。若剂量处于非线性范围 ,则情况将更为复杂 。 因此 ,在开展毒物代谢动力学筛查时 ,确定剂量是否处于线性范围具有重要意义 。

　　6.4.4 组织分布

　　6.4.4. 1 组织分布研究的重要性在于能够确定毒性靶组织 、阐明毒作用机制 , 以及获得受试物及其代谢产物蓄积和残留可能性的相关信息 。

　　6.4.4.2 在排泄试验结束时(通常为染毒后 7 d,或根据受试物特性适当缩短) ,组织和尸体中残留的毒物量(以放射性计)通常已显著降低 ;在某些情况下 ,受试物的半衰期较短会导致其在组织中的浓度降至

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　　检测限以下 , 因此无法准确描述受试物的组织分布情况 。 针对此类情况 , 宜在受试物(和/或其代谢产物)的血浆/血液峰浓度时间(Tmax)或尿液排泄最大速率的时间段内开展组织分布研究 。此外 , 为评估组织分布的时间依赖性 、建立质量平衡 ,可在研究过程中增设组织采集时间点,以完善受试物和/或其代谢产物的组织分布研究 。

　　6.4.4.3 组织采集应涵盖肝脏 、脂肪组织 、胃肠道 、肾脏 、脾脏 、全血 、残余尸体 、靶器官组织以及在受试物的毒理学评价中具有重要意义的其他相关组织和器官 ,例如甲状腺 、红细胞 、生殖器官 、皮肤 、眼睛(尤其是在有色动物中)等 。在亚慢性或慢性毒性试验中 ,若观察到靶器官毒性 ,应相应增加检测相关组织和器官 。在同一时间点增加检测组织和器官可视为最大化利用实验动物资源 。此外 , 当使用放射性标记受试物时 ,应报告残留放射性浓度以及组织与血浆(或血液)的放射性比值 。

　　6.4.4.4 放射性标记受试物的组织分布定量测定步骤包括组织采集 、匀浆处理 、燃烧或溶解 , 随后进行液体闪烁计数(LSC) 。此外 , 尚处于不同开发阶段的其他技术 ,如定量整体放射自显影和受体显微放射自显影技术 ,也可用于受试物的组织分布研究 。

　　6.4.4. 5 对于经 口 以外的染毒暴露途径 , 应对特定的组织进行检测 , 如吸入染毒的 肺 脏 、经 皮 染 毒 的皮肤 。

　　6.4.5 代谢

　　6.4.5. 1 应对排泄物(如适用 ,还包括血浆)中的受试物原型及其代谢产物进行鉴定和测定 。通常 ,将相同剂量组中不同动物的排泄物合并 ,有助于代谢产物的鉴定 。 宜对每个时间阶段的代谢物进行描述 。然而 , 当样品量不足和/或放射性活性较低时 ,可将几个时间阶段的尿液和粪便合并进行分析 ,但不同性别或不同剂量组的样品不得合并分析 。应采用适当的定性和定量方法对采集的尿液 、粪便 、含放射性的呼气和胆汁进行分析 。

　　6.4.5.2 应对含量大于或等于 5% 给药剂量的代谢产物进行鉴定 ,并提供受试物的代谢途径图 。对于排泄物中含量大于或等于染毒剂量 5%的化合物 ,应进行鉴定 ,并参考化合物的准确结构鉴定方法 。通常 ,一种方法是通过两种不同的色谱系统 ,与代谢物标准品的色谱图进行比较以完成鉴定 ,另一种方法是采用结构解析技术 ,如质谱法或核磁共振等进行鉴定 。在使用比较色谱图进行代谢产物结构鉴定时 ,若仅流动相不同而固相(色谱柱)相同 ,则不能视为两种不同的色谱方法 。所采用的两种色谱方法应为两个独立的分析系统 ,例如反相和正相的薄层色谱法(TLC) 及高效液相色谱法(HPLC) 。 如果色谱分离提供了高质量的结果 ,则无需额外的光谱手段进行验证 。或者 ,可采用能够进行结构鉴定的技术(如液相色谱-质谱联用仪(LC-MS) 、液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS) 、气相色谱-质谱联用仪(GC- MS)或核磁共振)对代谢产物结构进行明确鉴定 。

　　6.4.5.3 如果未能对含量等于或大于 5%的代谢产物进行分析鉴定 ,应在总结报告中说明理由 。若为受试物的危害和/或风险评估需要更深入地了解其代谢途径 ,则应对一些占比小于染毒剂量 5%的代谢物进行鉴定 。

　　6.4.6 消除与排泄

　　6.4.6. 1 通过测定尿液 、粪便和呼出空气中回收的(放射性)剂量百分比 ,确定染毒剂量的排泄速率和程度 。这些数据也可用于建立质量平衡 。

　　6.4.6.2 若预试验结果显示受试物(放射活性)经呼气排泄量较低 ,则正式试验中可不采集呼出气 。

　　6.4.6.3 每只动物应单独置于代谢笼中以收集排泄物(尿液 、粪便和呼气) 。在每个收集时段 ,使用适当溶剂冲洗代谢笼(洗笼) , 以确保受试物(放射活性)的最大回收 。排泄物的收集应持续至染毒后第 7 d,或在至少 90%的受试物被排泄时终止 。

　　6.4.6.4 尿液在试验第 1 d应至少收集两次(其中一次应在染毒后 24 h) ,此后每 日 收集一次直至试验结束 。宜在第 1 d增加采样点,例如染毒后 6 h、12 h 和 24h。可根据预试验结果调整或增加采样时间

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　　点,并提供相应的样品采集时间表 。粪便的采集通常从染毒后 24h开始 ,此后每日测定一次 ,直至试验结束 。 同样可根据预试 验 结 果 合 理 调 整 或 增 加 采 集 时 间 点,并 提 供 调 整 后 的 采 集 时 间 表 。若 染 毒 后24h 内 , 呼出的 CO2 或其他挥发性物质中放射性计数低于 1% ,则应停止采集呼出气 。

　　6.4.6.5 必要时 ,应测定哺乳期授乳动物乳汁中的受试物及其代谢产物 , 以了解其经乳汁的排泄情况 。

　　6.4.7 受试物浓度的动态变化和毒物代谢动力学分析

　　6.4.7. 1 血浆/血液动力学

　　6.4.7. 1. 1 血中受试物浓度的动态变化及毒物代谢动力学分析的主要 目 的在于获取受试物的基本毒物代谢动力学参数(如峰浓度 、达峰时间 、半衰期 、曲线下面积等) ,并描述受试物的基本动力学特征 ;计算受试物的生物利用度 ,并确定清除率是否随剂量增加而出现饱和 。

　　6.4.7. 1.2 受试物(或标记同位素) 染毒后 ,应采用适当方法在不同时间点采集 每 只 动 物 的 血 液 样 品 。采血体积和采血次数应根据分析方法的灵敏度以及重复采样是否会对动物正常生理状态产生影响等因素进行限定 。来自每只动物的样品应单独进行分析 。在某些情况下(如代谢产物鉴定) ,可能需要将多个动物的样品混合 ,此时应清晰标记并说明样品混合的理由 。若使用放射性标记化合物 ,需分别测定不同部位(全血 、血浆及血细胞)的放射活性 , 以计算全血/血浆含量的比率 。在一些情况下 ,还需开展进一步研究工作 ,如对原型化合物和代谢产物进行鉴定 , 以及评价蛋白结合率等 。

　　6.4.7.2 组织动力学

　　6.4.7.2. 1 组织中受试物浓度的动态变化及毒物代谢动力学分析的主要 目 的在于通过测定受试物在不同组织中的含量 ,从而描述与受试物毒性作用模式 、生物蓄积及残留相关的问题 。

　　6.4.7.2.2 应根据需解决的问题及受试物毒理学数据库信息 ,确定选择的组织类型及观察时间点的数量 。试验设计时应充分参考该物质的组织分布信息 ,并可采用单次染毒或重复染毒 。组织动力学试验的合理性依据应予以提供 。

　　6.4.7.2.3 开展组织动力学的理由包括 :

　　a) 受试物在血液中的半衰期延长 ,提示该物质可能在某些组织中发生蓄积 ;

　　b) 需了解受试物在特定组织中是否达到稳态 ,例如在反复染毒试验中 , 即使受试物在血液中已达到稳态 ,仍需评估该化合物在靶部位的情况 。

　　6.4. 8 酶诱导/抑制

　　6.4. 8. 1 在下列一种或多种情况下 ,应进行酶诱导/抑制试验或受试物的生物转化试验 :

　　a) 受试物的代谢过程与毒性增加存在关联的证据 ;

　　b) 毒理学数据表明受试物的剂量与代谢之间为非线性关系 ;

　　c) 受试物代谢产物 鉴 定 结 果 显 示 可 能 存 在 毒 性 代 谢 物 , 且 产 生 毒 性 代 谢 物 的 酶 可 能 被 受 试 物诱导 ;

　　d) 需解释可能与酶诱导效应相关的毒性效应 ;

　　e) 在不同物种的体内和体外试验中发现受试物因代谢转化而发生毒性改变 ,需对相关酶进行鉴别分析 ,例如参与 Ⅰ 相代谢的细胞色素 P450单氧化酶系的同工酶 , 以及 Ⅱ 相代谢的硫基转移酶和葡萄糖醛酸转移酶的同工酶 。这些研究信息可用于为物种间外推提供依据 。

　　6.4. 8.2 当毒物代谢动力学试验方案发生变化时 ,应对方案的变更进行适当的验证和修订 。例如 ,研究设计可包括 :连续重复给予非标记受试物 ,并在第 1 天 、第 7 天和第 14天单次给予同位素标记受试物进行采样以分析代谢谱 ;或者连续重复给予同位素标记化合物 ,并在第 1 天 、第 7 天和第 14天采样进行代谢谱分析 。此外 , 同位素标记受试物的重复染毒试验结果还可提供生物蓄积的相关信息 。

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　　6.5 补充的方法

　　6.5. 1 体外试验数据的应用

　　6.5. 1. 1 适宜的体外试验可用于解决受试物代谢相关问题 。新鲜制备的分离或培养肝细胞以及亚细胞组分(如微粒体或 S9 组分)可用于代谢研究 ;靶器官部位(如肺)的微粒体代谢研究有助于风险评估 。微粒体研究可用于描述性别和年龄差异 , 以及代谢酶参数(如米氏常数 Km 和最大速率 Vmax) ,从而有助于评估代谢产物与暴露水平的剂量依赖关系 。此外 ,微粒体研究可用于鉴别参与受试物代谢的酶系类型 ,并有助于不同物种间的外推 。利用受试物预处理的动物肝亚细胞组分(如肝微粒体和细胞) 、体外肝细胞诱导 , 以及能够表达相关酶的特殊细胞系可用于测定生物转化的诱导活性 。在某些情况下 ,可合理利用人组织来源的亚细胞组分研究生物转化的物种间差异 。此外 ,体外研究结果对基于生理的毒物代谢动力学模型(PBTK)的发展亦具价值 。

　　6.5. 1.2 体外皮肤吸收研究有助于阐明受试物经皮肤吸收的动力学特征 。

　　6.5. 1.3 肝原代培养细胞和新鲜肝组织薄片的应用与肝微粒体类似 。在某些情况下 ,使用特征性表达相关代谢酶的细胞系或生物工程细胞系可用于解决特定问题 ;在另一些情况下 ,体外方法可用于研究原型受试物对细胞色素 P450 同工酶(如 CYP1A1、CYP2E1、CYP1A2等) 和/或 Ⅱ 相代谢 酶 的 抑 制 和 诱导 ,从而对受试物的毒物代谢动力学研究具有重要意义 。体外试验结果也可为结构类似化学物质的研究提供参考 。

　　6.5.2 毒性试验伴随毒物代谢动力学相关数据的应用

　　6.5.2. 1 在其他毒性试验中采集血液 、组织和/或排泄物等样品进行分析测试 ,可提供生物利用度 、血浆中毒物浓度随时间变化的参数(AUC和 Cmax) 、生物蓄积倾向 、消除速率以及性别或年龄在代谢和动力学方面的差异 。

　　6.5.2.2 伴随毒物代谢动力学的试验设计方案可解决以下相关问题 :高剂量暴露下的吸收 ,生物代谢转化或排泄途径的饱和 , 以及高剂量水平下新代谢途径和毒性代谢产物的出现 。

　　6.5.2.3 伴随毒物代谢动力学数据可为化学物危害鉴定的以下内容提供支持 :

　　a) 血-脑屏障状态 、肾脏和/或解毒能力的差异导致的年龄相关敏感性 ;

　　b) 生物转化能力和毒物代谢动力学的差异导致的部分人群敏感性 ;

　　c) 化合物通过胎盘或乳汁对胎儿或新生儿暴露的程度 。

　　6.5.3 毒物代谢动力学模型的应用

　　毒物代谢动力学模型可用在化学物危害鉴定和风险评估的各个方面 , 比如预测全身暴露和组织内剂量 。此外 ,毒物代谢动力学模型可解决毒作用模式的一些特殊问题 ,还能够为不同物种 、不同暴露途径和不同染毒方式之间的外推和人类风险评估提供依据 。生理毒物代谢动力学模型(PBTK)评价化合物在不同物种中有价值的试验数据包括 :分配系数 ;生化常数和生理参数 ;与染毒途径相关的吸收参数 ;体内动力学参数用于模型评价 , 如重要排泄 途 径(大 于 10%) 的 清 除 率 参 数 , 代 谢 转 化 的 Km 和 Vmax。用于动力学模型的试验数据必须来自科学合理的方法 ,模拟的结果要进行验证 。化学和物种特异性参数(如吸收速率 、血-组织分配比例和代谢速率常数等)有助于非房室模型或生理性模型的开发 。

　　7 试验数据和报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 目录 。

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　　b) 摘要 。

　　摘要内容包括研究设计和方法学 。重点描述质量平衡 、代谢产物性质和丰度 、组织残留 、清除率 、生物蓄积倾向 、性别差异等主要发现 ,并列举足够细节对发现进行评价 。

　　c) 引言 。

　　引言部分内容包括研究目的 、原理和设计及参考文献和研究背景 。

　　d) 材料和方法 。

　　这部分内容包括 :

　　1) 受试物 :

　　— 鉴别信息 :化学名称 、分子结构 、化学组成的定性和定量检测 、化学纯度 、杂质鉴别和含量 ;

　　— 理化性质 :性状 、颜色 、溶解性 、分配系数 、稳定性 ,如可能可提供腐蚀性 ,如果存在异构体应提供相关信息 ,如是同位素标记化合物 ,应注明放射性同位素的类型 、标记的部位 、标记物的比活性以及放射性纯度进行说明 ;

　　— 注明介质的类型 ,如稀释液 、混悬剂 、乳化剂或其他在染毒过程中涉及的物质 。

　　2) 动物 :实验动物信息包括物种的选择 、品系 、试验开始时的年龄 、性别 、体重 、健康状态和饲养情况 。

　　3) 方法学 :对试验设计和方法进行详细描述 。方法学内容如下 :

　　— 染毒途径和染毒条件的选择依据 ;

　　— 剂量水平的选择依据 ;

　　— 预试验结果的描述 ;

　　— 受试物的配制方法和所用的溶剂或介质的类型 ;

　　— 动物组数及每组的动物数 ;

　　— 染毒剂量水平和体积(放射性同位素标记化合物的放射活性) ;

　　— 染毒途径和方法 ;

　　— 染毒次数 ;

　　— 禁食周期 ;

　　— 每只动物的总的放射活性 ;

　　— 动物处理 ;

　　— 样品收集和处理 ;

　　— 对各种代谢物进行定性和定量的分析方法 ;

　　— 所用分析方法的检测限 ;

　　— 其他试验内容和过程的描述(包括对代谢产物进行分析的方法的验证) 。

　　4) 分析统计 : 当使用统计分析方法对试验结果进行处理时 ,需要充分提供统计分析方法和计

　　算机程序的信息 ,便于独立审稿人或统计学家对分析结果重新进行评价和分析 。

　　e) 试验结果 。

　　试验结果部分应综合所有的试验数据 ,用合适的统计表格表示 。放射性计数数据汇总并用合适单位表示 ,通常使用的单位是微克或毫克当量/质量样品 。要给出典型的色谱及光谱图 ,代谢产物的鉴定结果及代谢通路(包括代谢产物的分子结构) 。结果中还应包含下列内容 :

　　1) 说明尿液 、粪便 、呼出气和代谢笼冲洗液中放射活性的回收量及所占百分比 。经皮染毒试验 ,应说明皮肤 、皮肤冲洗液 、皮肤覆盖物和代谢笼具残留的放射活性的回收率以及皮肤洗消的试验结果 ;经吸入染毒 ,测定肺组织和鼻腔受试物的回收率 。

　　2) 组织分布应说明各组织脏器中毒物量占受试物染毒剂量的百分比和浓度(用 μg/g组织表示) ,组织/全血比率或组织/血浆比率 ;

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　　3) 组织分布和排泄数据为质量平衡试验提供数据支持 ;

　　4) 经相关的途径染毒后 ,血浆中的毒物浓度及其毒物代谢动力学参数 :生物利用度 、血浆毒物浓度-时间曲线下面积 、峰浓度 、达峰时间 、清除率和半衰期等 ;

　　5) 经相关的途径染毒后 ,受试物的吸收速率和程度 ;

　　6) 排泄物中受试物及其代谢产物的量(占染毒剂量的百分比) ;

　　7) 附件中应列出每只动物的个体数据 ,如染毒剂量 、回收率 、浓度和毒物代谢动力学参数等 ;

　　8) 可能的代谢途径示意图和代谢产物的分子结构式 。

　　f) 讨论和结论 。

　　这部分内容包括 :

　　1) 根据受试物代谢和配置的研究结果 ,说明其代谢途径 ;

　　2) 根据代谢转化结果 ,讨论受试物是否有物种和性别差异 ;

　　3) 对代谢产物的鉴定 、机体清除率 、潜在的生物蓄积性 、原型和/或代谢产物的组织残留量 ,以及毒物代谢动力学参数的剂量依赖性改变等问题进行合理讨论 ;

　　4) 对毒性试验期间获得相关毒物代谢动力学数据进行整合汇总 ;

　　5) 根据研究发现 ,简明地提出试验的结论 ;

　　6) 根据研究的需要适当增加内容 。

　　g) 附加内容 。

　　附加内容包括支持性资料 、表格 、图 、附件等 。

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　　参 考 文 献

　　[1] OECD Guidelines for The Testing ofChemicals No. 417Toxicokinetics(2010)

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