GB/T 40141-2021 榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40141—2021

　　榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法

　　Detectionandidentificationofcandidatusphytoplasmaulmi

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

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　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、内蒙古农业大学、青岛海关技术中心、上海市农业技术推广服务中心。

　　本文件主要起草人：赵文军、田茜、李正男、张红梅、牟海清、张京宣、罗金燕。

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　　榆韧皮部坏死植原体检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件描述了榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定方法。

　　本文件适用于进出境榆树苗木及接穗中榆韧皮部坏死植原体的检疫和鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　聚合酶链式反应 polymerasechainreaction;PCR

　　以耐热 DNA 聚合酶和一对引物(与待测 目标核酸分子序列同源的 DNA 片段)通过高温(DNA 分子变性)和低温(引物和目标核酸分子复性并被耐热 DNA 聚合酶延伸)交替循环扩增待测 目标核酸分子的方法。

　　3.2

　　植原体 phytoplasma

　　一类无细胞壁，尚不能人工培养，主要分布于植物韧皮部筛管细胞、刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾液腺等组织。

　　4 榆韧皮部坏死植原体基本信息

　　学名：candidatus Phytoplasma ulmi

　　传播途径：依靠带病苗木进行远距离传播。

　　榆韧皮部坏死植原体的其他信息见附录 A。

　　5 方法原理

　　该病害主要危害榆树，依靠带病苗木进行远距离传播。 其生物学特性和 16S基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。 16S rDNA相对保守，通过植原体通用引物 R16F2/R16R2 即可扩增获得植原体 16S rDNA序列。

　　6 仪器设备和主要试剂

　　6 . 1 仪器设备

　　PCR仪、超净工作台、灭菌锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡

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　　器、移液器、电泳仪、凝胶成像分析仪。

　　6 . 2 主要试剂

　　PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、PCR凝胶电泳检测试剂应符合附录 B。

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯。

　　7 检测与鉴定方法

　　7 . 1 症状观察

　　仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状描述的信息见 A. 7 。

　　7 . 2 DNA提取

　　称取 100 mg含有韧皮部组织的植物材料，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉状，随后直接用商业化植物基因组 DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品总 DNA,

　　-20 ℃保存备用。

　　7 . 3 通用引物进行 PCR扩增并测序

　　利用植原体通用巢式引物 R16mF1/ R16mR1/ R16F2/ R16R2 进行 PCR扩增并测序，具体步骤应符

　　合附录 B。

　　7 . 4 虚拟 RFLP指纹图谱检测

　　利用 iPhyclassifier在线分析软件或 DNA-FP Cluster软件对 7.3 测得的植原体 16S rDNA序列进

　　行虚拟 RFLP指纹图谱检测，具体步骤应符合附录 C。

　　8 结果判定

　　表现症状与附录 A描述一致可初步判定怀疑感染榆韧皮部坏死植原体，但需通过 7 . 3 、7 . 4 进一步检测。

　　在 7 . 3 检测中，若 PCR产物凝胶电泳出现 1 200 bp 左右条带，可初步判定感染榆韧皮部坏死植原体，经克隆测序及分析比对后，若与 B. 6 中序列相似性大于 97 . 5%,则可判定该样品携带榆韧皮部坏死植原体。

　　在 7 . 4 检测中，将测得的植原体 16S rDNA序列经 17 种限制性内切酶 RFLP指纹图分析，若 RFLP图谱与图 C. 1 一致，则可判定该样品携带榆韧皮部坏死植原体。

　　9 样品及检测结果保存

　　9 . 1 样品保存与处理

　　样品经登记和经手人签字后妥善保存。 对检出榆韧皮部坏死植原体的样品应保存于- 70 ℃冰箱中，以备复核。 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。

　　9 . 2 结果记录与资料保存

　　完整的实验记录包括：样品的来源、种类、送检时间，实验时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。 PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，需保存 DNA序列和 RFLP 图谱。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　榆韧皮部坏死植原体其他信息

　　A.1 名称与分类地位

　　中文名：榆韧皮部坏死植原体

　　学名：candidatus Phytoplasma ulmi

　　异名：Elm yellows-associated phytoplasmas

　　Illinois elm yellows phytoplasmas

　　Elm phloem necrosis phytoplasma

　　英文名：Elm phloem necrosis phytoplasma

　　分类地 位：细 菌 界 (Bacteria), 厚 壁 菌 门 (Firmicutes), 柔 膜 菌 纲 ( Mollicutes), 非 固 醇 菌 原 体 目 (Acholeplasmatales ) , 非 固 醇 菌 原 体 科 ( Acholeplasmataceae ) , 植 原 体 候 选 属(candidatus Phytoplasma),16SrV植原体组

　　A.2 寄主植物

　　该病害只能为害榆属的种类，主要包括美国本地的美国榆(ulmusamericana)，红榆(u.rubra)， u.alata，u.serotina和 u.crassifolia，嫁接试验表明该病害还能为害欧亚地区的 u.minor，u.lae℃is和榔榆(u.par℃ifolia)。

　　A.3 地理分布

　　主要分布于北美洲地区北纬 32°到 46°,西经 71°到 97°之间。

　　欧洲：捷克、法国、德国、意大利(广泛分布)。

　　北美洲：加拿大(安大略湖)、美国(亚拉巴马州、阿肯色州、佐治亚州、伊利诺伊州、印第安纳州、艾奥瓦州、堪萨斯州、肯塔基州、马里兰州、马萨诸塞州、密歇根州、明尼苏达州、密西西比州、密苏里州、内布拉斯加州、新泽西州、纽约、北达科他州、俄亥俄州、俄克拉何马州、宾夕法尼亚州、田纳西州、弗吉尼亚州)。

　　A.4 传播介体

　　叶蝉(oliarusatkinsoni)、菟丝子(cuscuta)等。

　　A.5 形态学特性

　　植原体寄生于植物韧皮部的筛管内，形态大小约 500 nm~1 000 nm,并能够通过细菌滤器，不具有细胞壁，呈现多型性，一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性。 由于生长周期不同，植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态。

　　A.6 为害情况

　　受榆树韧皮部坏死植原体为害的植物根部组织大量增生肥大，组织纤维化并出现大量的根部坏死。这是植株感病后出现的最初症状，但是这种症状在地上部分出现明显的症状之前是很难观测到的。 韧

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　　皮部坏死的外部症状是有很大差异的。 在美国北部，病害引起的第一次落叶一般发生在 7 月 中旬至9 月 中旬，落叶中有发黄的叶片，有顶部的和未成熟的叶片。 一般来讲，感病植株所有枝条都会立即显症 。有时候症状只会在植株某几个枝条上出现并扩散，而其他的枝条保持正常。 但更多时候，枝条上的所有叶片都变成淡黄绿色到黄色。

　　在生长季节的晚期，感病植株上的叶片呈现出一种比预期时间早的外观。 这种黄化以及外观比起那些由于生长在岩石地区缺少肥料所引起的症状是完全不同的。 显出生长晚期症状的感病植株有可能在下个生长季节不能够正常抽芽或者生长，最后导致死亡。

　　A.7 症状特征

　　在早春，感病植株显示出的外部症状主要是不能够正常产生叶片，或者产生一些最后萎蔫变黄甚至脱落的小叶。 春末的时候，那些正常生长出叶片的植株一般会迅速萎蔫死亡，褐色干枯的叶片有可能在这些已死的叶片上附着几个星期。 盛夏季节植株通常会枯萎，但是这种情况一年四季都有可能发生。总体上讲，一般病株枯死于侵染后的第二年。

　　落叶前，病株的树干和根部韧皮部会形成黄褐色斑块。 在一些巨大的树干上会形成一些垂直融合的巨大斑块。 病株的形成层和木质部的表面也可能形成一些变色斑块，但是这些斑块一般不大于1 mm。 如果在茎干表皮能够明显看到大块的黑色斑块，说明植株同时被感染荷兰榆树病和榆树韧皮部坏死病。 暴露出来的病株韧皮部比健康植株更容易氧化褐变。

　　红榆(u.rubra)、美国榆(u.americana)、榔榆(u.par℃ifolia)感病症状见图 A.1~图 A.5。

　　图 A.1 感病红榆(u.rubra)叶片变黄症状

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　　图 A.2 感病美国榆(u.americana)整株黄化症状

　　注：左为健康枝条，右为发病枝条。

　　图 A.3 感病美国榆(u.americana)叶片黄化症状

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　　图 A.4 感病榔榆(u.parvifolia)丛枝症状

　　图 A.5 感病美国榆(u.americana)韧皮部坏死症状

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　PCR扩增与测序分析

　　B.1 巢式引物序列

　　植原体通用引物：

　　R16mF1 : 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

　　R16mR1 : 5′-CTTAACCCCAATCATCGA-3′

　　R16F2 : 5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

　　R16R2 : 5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

　　B.2 PCR反应体系

　　2 × PCR mix混合液 12.5 μL, DNA模板 2 μL, 双蒸水 11.5 μL。

　　取第一轮扩增产物 1 μL,稀释 10 倍，取稀释产物 2 μL为模板，进行第二轮扩增，反应体系同上。

　　B.3 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置

　　阴性对照：以健康的榆树叶片 DNA 为模板。

　　阳性对照：采用感病榆树叶片 DNA 为模板。

　　空白对照：双蒸水。

　　B.4 PCR的反应参数

　　第一对引物 R16mF1/R16mR1 : 94 ℃预变性 10 min; 94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸1 min, 35 个循环后于 72 ℃保温 10 min。

　　第二对引物 R16F2/R16R2 : 94 ℃预变性 10 min; 94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 1 min, 35 个循环后于 72 ℃保温 10 min, 4 ℃冰箱中保存。

　　注：不同仪器可根据仪器要求对反应参数做适当调整。

　　B.5 琼脂糖凝胶电泳

　　制备 2%的琼脂糖凝胶，以 DNA Marker作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。

　　B.6 序列测定分析

　　当琼脂糖凝胶电泳显示在 1 200 bp左右有条带，对该条带进行克隆测序，并与 GenBank 中的登录

　　号为 FJ436792.1(candidatusPhytoplasma ulmi 16S ribosomal RNA gene,partial sequence长度 1 248 bp)进

　　行序列比对。

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　虚拟 RFLP指纹图谱分析

　　利 用 iPhyclassifier 在 线 分 析 软 件 或 DNA-FP Cluster 软 件 将 测 得 的 植 原 体 16S rDNA 序 列 (R16F2/R16R2)进行虚拟酶切，选用 17 种限制性内切酶(AluⅠ、BamH Ⅰ、BfaⅠ、BstU Ⅰ、DraⅠ、ECOR Ⅰ、 Hae Ⅲ、Hha Ⅰ、Hinf Ⅰ、Hpa Ⅰ、Hpa Ⅱ、kpn Ⅰ、MbO Ⅰ、Mse Ⅰ、Rsa Ⅰ、Ssp Ⅰ、Taq Ⅰ )。酶切后 RFLP 图谱如图 C.1。此外，使用 iPhyclassifier 的组(亚组)划分功能(16Sr group/subgroup classifi- cation based on similarity coefficient), 可以对未知植原体进行组与亚组的分类。

　　DNA分子量标 准 选 用 Invitrogen 25 bp DNA Ladder, 琼 脂 糖 凝 胶 浓 度 为 3% , 最 小 片 段 选 为10 bp。

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　　参 考 文 献

　　[1] Lee, I.-M. , Martini , M. , Marcone, C. , et al. Classification of phytoplasma strains in the elm yellows group (16SrV) and proposal of‘candidatusPhytoplasma ulmi’for the phytoplasma associat- ed with elm yellows.International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology,2004,54(Pt 2) : 337-347 .

　　[2] Zhao , Y. , Wei , W. , Lee, I.-M. , et al.Construction of an interactive online phytoplasma classi- fication tool,iPhyClassifier, and its application in analysis of the peach X-disease phytoplasma group (16Sr Ⅲ ) . International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2009 , 59 ( Pt 10) : 2582-2593 .