GB/T 27765-2011 SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法

　　ICS 71. 040. 99 C 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 27765—2011

　　SiO2、TiO2、Fe3O4 及 Al2O3 纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法

　　Testing methodsofSiO2 ,TiO2 ,Fe3O4 andAl2O3 nanoparticlesbiologicaleffectby

　　transmission electron microscope(TEM)

　　2011-12-30发布 2012-05-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 27765—2011

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1. 1—2009给出的规则起草 。

　　本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)提出并归 口 。

　　本标准负责起草单位 : 中国人民解放军第二军医大学 、复旦大学及地科院矿产资源研究所 。

　　本标准主要起草人 :杨勇骥 、俞彰 、周健雄 、张天宝 。

　　Ⅰ

　　GB/T 27765—2011

　　SiO2、TiO2、Fe3O4 及 Al2O3 纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法

　　1 范围

　　本标准规定了透射电子显微镜检测含有 SiO2、TiO2、Fe3 O4 及 Al2 O3 纳米颗粒材料的生物试样的技术和规范 。

　　本标准适用于 SiO2、TiO2、Fe3 O4 及 Al2 O3 纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样超微结构分析 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 ,仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 18873—2008 生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则

　　GB/T 19619—2004 纳米材料术语

　　ISO/IEC 17025:2005 检测和校准实验室认可准则(General requirements for the competence of testing and calibration laboratories)

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　纳米颗粒 nanoparticles

　　纳米尺度的固体粒子 。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为 SiO2、TiO2、Fe3 O4 及 Al2 O3 纳米颗粒材料 。

　　3. 2

　　生物效应 biologicaleffect

　　纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能 、生化功能及形态结构的变化 。

　　3. 3

　　生物效应检测 biologicaltest

　　采用生物学 、化学 、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量 。

　　3. 4

　　生物薄试样 thin biologicalsample

　　生物薄试样是指采用超薄切片机切成的 、厚度为 40 nm~ 100 nm 的生物试样 ,用于透射电镜观察 。

　　4 基本原理

　　纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚 ,经分散后与生物体接触 。 纳米颗粒材料与生物体接触后 ,需采用超微结构制样方法 ,将其制成生物薄试样 ,在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物

　　1

　　GB/T 27765—2011

　　体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化 , 以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用 。用聚焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域 ,入射的电子束大部分透过薄试样 ,形成透射电子 ,透射电子中含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子 ,非弹性散射电子在荧光屏 、照相底片或 CCD上成像 ,形成生物薄试样的超微结构图像 。

　　5 仪器设备和材料

　　5. 1 仪器设备

　　5. 1. 1 透射电子显微镜 。

　　5. 1. 2 超薄切片机 。

　　5. 1. 3 制刀机 。

　　5. 1. 4 玻璃刀或钻石刀 。

　　5. 1. 5 恒温烘箱(30 ℃ ~ 70 ℃) 。

　　5. 1. 6 超声波清洗仪 。

　　5. 2 材料

　　5. 2. 1 戊二醛 。

　　5. 2. 2 四氧化锇 。

　　5. 2. 3 乙醇 。

　　5. 2. 4 丙酮 。

　　5. 2. 5 环氧树脂 。

　　5. 2. 6 醋酸双氧铀 。

　　5. 2. 7 枸橼酸铅 。

　　6 仪器的环境条件

　　超薄切片机 、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求 :

　　6. 1 超薄切片机

　　6. 1. 1 切片室应为超薄切片专用房间 。

　　6. 1. 2 相对湿度小于 60% 。

　　6. 1. 3 温度 : (20±5) ℃ 。

　　6. 1. 4 电源电压 :220(1±10%) V。

　　6. 2 透射电子显微镜

　　6. 2. 1 电镜室应为电镜专用房间 。

　　6. 2. 2 相对湿度小于 60% 。

　　6. 2. 3 温度 : (20±5) ℃ 。

　　6. 2. 4 杂散电磁场干扰应小于 0. 1 μT。

　　6. 2. 5 电源电压及频率应稳定[220(1±10%) V,50 Hz±1 Hz] 。

　　6. 2. 6 具备仪器专用地线 ,接地电阻应小于 100 Ω。

　　2

　　GB/T 27765—2011

　　7 纳米颗粒材料分散

　　7. 1 将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和 。

　　7. 2 放入超声波清洗仪中分散 。

　　注 : 建议分散的条件 :水温(25~ 30) ℃ ;功率 300W;频率 40(1±10%)kHz;时间 30 min左右 。

　　8 生物薄试样制备

　　8. 1 纳米颗粒材料

　　8. 1. 1 将不同浓度 、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜(一般用火棉胶或 Fomvar膜) 的 ϕ3 mm 透射电镜专用载网上 。

　　8. 1. 2 将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放入恒温烘箱中 , 60 ℃烘烤 2 h。

　　8. 2 生物组织

　　8. 2. 1 取材:将生物组织在(2~ 3) %戊二醛固定液(4℃) 中迅速切成小于 1 mm3 的小块 。 配制戊二醛固定液可参考附录 C。

　　8. 2. 2 前固定 :将小块组织浸泡在 20倍体积 、4 ℃的(2~ 3) %戊二醛固定液中固定(1~ 4)h,用缓冲液充分漂洗 。

　　8. 2. 3 后固定 :将生物小块组织浸泡在 1%锇酸 ,4 ℃固定 2 h。配制锇酸可参考附录 D。

　　8. 2. 4 脱水 :用乙醇或丙酮梯度脱水 。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为 :30%、50%、70%、90%乙醇各一次;90%丙酮 1 次 ,100%丙酮 3 次 ;每次(10~ 15)min。

　　8. 2. 5 包埋 :在按比例配制好的环氧树脂(以 Epon812为例 ,配制比例可参考附录 B)中浸透后 ,在胶囊(或硅胶包埋板)内进行包埋 。建议浸透比例为 ,丙酮 :包埋剂(浸透时间) :1 ∶ 1[(1~ 2)h] ;1 ∶ 2(12h) ;纯包埋剂(1h) 。

　　8. 2. 6 聚合 :在恒温烘箱内进行聚合 ,37 ℃聚合 12 h后 ,升温至 60 ℃聚合(36~48)h。

　　8. 2. 7 修块 :包埋块在进行超薄切片之前 ,将分析部位修成易于超薄切片的形状 。

　　8. 2. 8 超薄切片 :采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片 ,厚度一般要求在(40~ 100) nm。

　　8. 2. 9 染色 :采用醋酸铀和枸橼酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检 。

　　8. 3 培养细胞

　　8. 3. 1 前固定 :用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来 ,低速离心(800 g, 5 min) 成小团块 ,弃上清 ,沿管壁加入(2~ 3) %戊二醛固定液 ,放入 4 ℃冰箱固定(1~4)h。用缓冲液充分漂洗 。

　　8. 3. 2 后固定 :经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后 ,加入 1%锇酸 ,放入 4℃冰箱固定 1 h。

　　8. 3. 3 脱水(同 8. 2. 4) 。

　　8. 3. 4 包埋(同 8. 2. 5) 。

　　8. 3. 5 聚合(同 8. 2. 6) 。

　　8. 3. 6 修块(同 8. 2. 7) 。

　　8. 3. 7 超薄切片(同 8. 2. 8) 。

　　8. 3. 8 染色(同 8. 2. 9) 。

　　3

　　GB/T 27765—2011

　　9 透射电子显微镜准备工作

　　9. 1 开机 ,抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定 30 min以上 。

　　9. 2 选择测试生物 薄 试 样 所 需 的 加 速 电 压 , 建 议 检 测 生 物 薄 试 样 所 需 的 加 速 电 压 选 择 在 60 kV~ 120 kV之间 。

　　9. 3 调节电子枪的灯丝电流 ,使束流处于稳定饱和状态 。

　　9. 4 对电子光学系统进行对中调整 ,尽可能消除电子束的像散 ,使透射电子显微镜处于最佳工作状态 。

　　10 测量分析步骤

　　10. 1 纳米颗粒材料

　　10. 1. 1 将干燥的纳米颗粒薄试样放入透射电镜 。

　　10. 1. 2 在低倍(3 000倍 ~4 000倍)下寻找合适的试样部位 ,要求被分析试样无破损 、无污染 。

　　10. 1. 3 在高倍(40 000倍 ~ 50000倍)时观察纳米材料的分散情况 ,测量纳米颗粒的粒径并记录实验结果 。

　　10. 2 生物薄试样

　　10. 2. 1 在低倍(小于 4 000倍)下寻找合适的生物薄试样部位 ,要求被分析试样无破损 、无污染 、无震颤条纹 。

　　10. 2. 2 将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心 。

　　10. 2. 3 逐步增加放大倍数(一般放大倍数在 10 000~ 30 000 即可 ,少数需放大 30 000倍以上) , 寻找细胞内外 、细胞器内外有无纳米材料 。

　　10. 2. 4 仔细分析纳米材料分布的位置 ,注意区分样品制备过程中引入的污染物和纳米颗粒材料 。如果无法判别 ,建议采用 X射线能谱分析对颗粒物进行定性分析 ,分析方法参见 GB/T 18873—2008。

　　10. 2. 5 精确聚焦并存储实验结果 。

　　11 分析结果的发布

　　分析结果报告应包 括 以 下 信 息(参 见 附 录 A) , 亦 可 参 照 ISO/IEC 17025: 2005 中 有 关 分 析 报 告格式 。

　　11. 1 分析报告的惟一编号 。

　　11. 2 送样人姓名 ,单位和地址 。

　　11. 3 样品的接收日期 。

　　11. 4 分析仪器及其工作条件 。

　　11. 5 分析结果和必要的说明 。

　　11. 6 分析报告负责人的签字 。

　　11. 7 分析报告的页码 。

　　11. 8 实验室名称和地址 。

　　11. 9 分析报告的 日期 。

　　4

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　SiO2、TiO2、Fe3O4 及 Al2O3 纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜分析结果报告

　　报告编号 :

　　送样单位 :

　　送样日期 :

　　样品内容 :

　　检测内容与要求 :

　　送样人姓名 : 送样人联系电话 : 送样人 E-mail地址 :

　　测量条件 :

　　仪器型号 :

　　仪器条件 :

　　加速电压 :

　　检测结果 :

　　倍率标尺 :

　　分析结果 :

　　必要的说明 :

　　分析单位(公章) 分析人 :

　　批准人 : 分析日期 : 年 月 日

　　报告书共 页

　　分析单位地址 : 分析单位联系电话 :

　　5

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　环氧树脂 Epon812包埋剂配制比例参考

　　环氧树脂 Epon812包埋剂配置顺序 :DDSA→ MNA→ 812→ DMP-30。具体见表 B. 1。表 B. 1

　　DDSA

　　MNA

　　812

　　DMP-30

　　总量

　　2 g

　　3 g

　　5 g

　　0. 16 mL

　　10 mL

　　4 g

　　6 g

　　10 g

　　0. 32 mL

　　20 mL

　　6 g

　　9 g

　　15 g

　　0. 48 mL

　　30 mL

　　6

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　磷酸缓冲液-戊二醛配方参考

　　C. 1 配置 2. 0%戊二醛

　　量取 0. 2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7. 3) 50mL,加入纯化的 25%戊二醛水溶液 8 mL,最后用双蒸水补足到 100 mL。充分混匀 。

　　C. 2 配置 3. 0%戊二醛

　　量取 0. 2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7. 3) 50 mL,加入纯化的 25%戊二醛水溶液 12 mL,最后用双蒸水补足到 100 mL。充分混匀 。

　　注 : 戊二醛固定液宜现配现用 。

　　GB/T 27765—2011

　　GB T 27765 2011

　　— /

　　附 录 D (资料性附录)锇酸配方参考

　　D. 1 配制 2%四氧化锇贮存液

　　将装有四氧化锇的安瓿(共 2 g)用肥皂水洗净 ,再用清洁液浸泡过夜 , 自来水冲洗干净后 ,用玻璃划割器在上面刻痕 ,再用蒸馏水冲洗几次 ,放入洁净棕色广口玻璃瓶内 ,加上 100 mL双蒸水 ,用洁净玻璃棒捣破安瓿 。然后用蜡将广口玻璃严密封 口 ,贴上标签备用 。洗净后的安瓿严禁与手 、纱布及滤纸等接触 。将配好的 2%四氧化锇置于干燥器中 ,4 ℃保存 。

　　D. 2 配制磷酸缓冲-四氧化锇固定液

　　等量 0. 2 mol/L磷酸缓冲液(pH7. 3)与 2%四氧化锇贮存液混合 ,现配现用 。