GB/T 26612-2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程

　　ICS 65. 020. 30 B 43

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 26612—2011

　　纯血马 DNA 亲子鉴定技术规程

　　ProceduresofThoroughbredparentageverification

　　with DNA testingtechniques

　　2011-06-16发布 2011-11-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 26612—2011

　　前 言

　　本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E 为资料性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位 : 中国农业大学马研究中心 、中国马业协会 。

　　本标准主要起草人 :赵春江 、吴常信 、韩国才 、张浩 、吴克亮 、杜丹 、韩文朋 。

　　Ⅰ

　　GB/T 26612—2011

　　纯血马 DNA 亲子鉴定技术规程

　　1 范围

　　本标准规定了纯血马 DNA亲子鉴定所用的方法 、过程 、结果的记录和解读等 。

　　本标准适用于纯血马的亲子鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件 ,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本适用于本标准 。

　　GA/T 383 法庭科学 DNA实验室检验规范

　　SN/T 1119 进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法 PCR方法

　　SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本标准 。

　　3. 1

　　纯血马 Thoroughbred

　　符合国际纯血马登记委员会(InternationalStud Book Committee,ISBC)规定 、在ISBC批准的成员国登记委员会登记了的马匹 。

　　3. 2

　　微卫星 DNA 亲子鉴定方法 parentage testing with DNA technique

　　以微卫星 DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法 。

　　4 原理

　　根据微卫星 DNA 的侧翼序列设计引物 ,对微卫星 DNA位点进行扩增 ,其中包括国际动物遗传协会(InternationalSociety ofAnimalGenetics,ISAG)和 ISBC要求的九个微卫星位点 。通过凝胶电泳判定个体的基因型 。根据孟德尔遗传规律 , 比对亲代个体和子代个体各微卫星 DNA位点的基因型是否相符 ,从而达到亲子鉴定的 目的 。

　　5 试剂与器材

　　5. 1 试剂

　　5. 1. 1 乙醇(ethanol) ,分析纯 。

　　5. 1. 2 异丙醇(isopropanol) ,分析纯 。

　　5. 1. 3 氢氧化钠(NaOH) ,分析纯 。

　　5. 1. 4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA) ,分析纯 。

　　5. 1. 5 氯化钠(NaCl) ,分析纯 。

　　5. 1. 6 十二烷基硫酸钠(SDS) ,分析纯 。

　　5. 1. 7 乙酸钾(CH3COOK) ,分析纯 。

　　5. 1. 8 氯化锂(LiCl) ,分析纯 。

　　1

　　GB/T 26612—2011

　　5. 1. 9 氯化钾(KCl) ,分析纯 。

　　5. 1. 10 氯化镁(MgCl2 ) ,分析纯 。

　　5. 1. 11 30%(质量分数)丙烯酰胺溶液 :将 29%丙烯酰胺和 1%N ,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于去离子水 ,充分搅拌溶解并过滤去杂质 ,避光保存 。

　　5. 1. 12 过硫酸铵 ,分析纯 。

　　5. 1. 13 硼酸(boric acid) ,分析纯 。

　　5. 1. 14 乙酸 ,分析纯 。

　　5. 1. 15 甘油 ,分析纯 。

　　5. 1. 16 四硼酸钠 ,分析纯 。

　　5. 1. 17 硝酸银(AgNO3 ) ,分析纯 。

　　5. 1. 18 甲醛 ,分析纯 。

　　5. 1. 19 溴化乙锭 ,分析纯 。

　　5. 1. 20 TaqDNA 聚合酶 。

　　5. 1. 21 溴酚蓝 ,分析纯 。

　　5. 1. 22 盐酸(HCl) ,分析纯 。

　　5. 1. 23 三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris Base) ,分析纯 。

　　5. 1. 24 Tris-HCl: 由 Tris Base和 HCl组成的缓冲溶液 。

　　5. 1. 25 三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTPs) :等量的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP) 、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP) 、三 磷 酸 胸 腺 嘧 啶 脱 氧 核 苷 酸 (dTTP) 、三 磷 酸 胞 嘧 啶 脱 氧 核 苷 酸 (dCTP) 的 混合物 。

　　5. 1. 26 毛囊裂解液 :200 mmol/L NaOH。

　　5. 1. 27 中和液 :200 mmol/L HCl,100 mmol/LTris-HCl,pH 8. 5。

　　5. 1. 28 缓冲液 :

　　a) 血液裂解缓冲液(Buffer A) : 100 mmol/L Tris-HCl(pH 7. 5) , 100 mmol/L EDTA , 100 mmol/L NaCl,0. 5%(质量分数)SDS;

　　b) 蛋白沉淀缓冲液(BufferB) :200mL5 mol/L CH3COOK,500mL 6 mol/LLiCl混匀后使用 ;

　　d(c))) 电泳(DNA)解缓(溶解)冲液(缓冲)(TB(TE)E)::44(10)6(m)m(m)m(o)lo(/)l/(L)L(T)Tris(ris-H)B(C)a(l)s,e(1), 445(mm)m(o)lm(/L)ol/(E)L(D)TBo(A)i(p)cHcid(8).,01;0 mmol/L EDTA

　　(pH 8. 0) ;

　　e) 电泳解缓冲液 50×TAE:2 mol/LTris碱 ,1 mol/L冰乙酸 ,0. 1 mol/LEDTA(pH 8. 0) ;

　　g) 10×PCR缓冲液 :100 mmol/LTris-HCl(pH 8. 0) ,0. 5 mol/LKCl,15 mmol/LMgCl2 。

　　f) 上 样 缓 冲 液 : 30 mmol/L EDTA, 36%(体 积 分 数) 丙 三 醇 , 0. 05%(质 量/体 积 分 数) 溴 酚 蓝 , pH= 7. 0;

　　5. 1. 29 琼脂糖(分析纯) 。

　　5. 1. 30 N ,N ,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED) 。

　　5. 1. 31 琼酯糖胶 :琼脂糖加入电泳解缓冲液 ,加热熔解冷却后制成的胶状物 ,可用于 DNA 电泳 。

　　5. 2 器材

　　5. 2. 1 全自动 DNA分析仪 。

　　5. 2. 2 离心机 ,离心力 10000g。

　　5. 2. 3 紫外可见分光光度计 。

　　5. 2. 4 移液器 ,量程 0. 1 μL~ 1 000 μL。

　　5. 2. 5 PCR仪 ,96孔热循环 。

　　5. 2. 6 水平电泳槽 ,长度 31 cm。

　　2

　　GB/T 26612—2011

　　5. 2. 7 垂直电泳槽 ,长度 24 cm。

　　5. 2. 8 凝胶成像系统 。

　　5. 2. 9 漩涡振荡仪 。

　　5. 2. 10 剪刀 。

　　6 DNA 亲子鉴定规程

　　6. 1 DNA 的提取

　　采取血液或带有毛囊的马毛发 ,从中提取 DNA。具体方法参见附录 A。DNA 样品操作注意事项见 SN/T 1119。

　　6. 2 亲子鉴定所用 DNA微卫星位点

　　亲子鉴 定 所 用 DNA 微 卫 星 位 点 应 包 括 ISAG 和 ISBC 要 求 的 如 下 九 个 微 卫 星 位 点 : AHT4, AHT5,ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20。 在 所 扩 增 的 位 点 中 还 可 包 括HTG6,HTG7, HMS2等三个微卫星位点或其他若干个已被证实在纯血马群体中多态性丰富的微卫星位点,以进一步提高亲子鉴定的准确性 。 引物序列参见附录 B。

　　6. 3 DNA微卫星位点的扩增

　　可用荧光物质标记用于扩增上述 12个位点的引物 ,采用 PCR方法扩增这些微卫星位点 。PCR 条件参见附录 C。PCR操作中防止污染等注意事项见 GA/T 383。

　　6. 4 基因型的检测

　　使用根据荧光信号探测 PCR产物大小的全自动 DNA分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染(参见附录 D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述 12个位点的基因型 。在分析中设置对照样本 。上述操作技术要求见 SN/T 1193。

　　6. 5 基因型的表示方法

　　基因型用国际通用的字母表示 。在所检测的微卫星位点中 ,等位基因数为奇数的 ,片段长度居中的基因型记为“M”;如等位基因数为偶数 ,居中的两个基因型中片段较小的定义为“M”。其他等位基因对照“M”按升序排列 。微卫星位点基因型的记录参见附录 E。

　　6. 6 亲子关系的判断

　　根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系 。基因型的读取和亲子关系的判断由两人分别独立完成 ,其结果互相印证 。

　　6. 7 否定个案的重复检测

　　对于亲本和子代个体的基因型不符的个案 ,重新采取 DNA样品进行鉴定 ,两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系 。

　　7 亲子鉴定结果的记录

　　7. 1 亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录

　　对于亲本和子代个体的基因型相符的个案 ,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型 ,并记录 “根据上述微卫星位点的基因型检测 ,不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系 ”,并由亲子鉴定负责人签字 。

　　7. 2 亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录

　　对于亲本和子代个体的基因型不符的个案 ,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型 ,并记录 “根据上述微卫星位点的基因型检测 ,可排除子代个体与两亲本存在亲子关系 ”,并由亲子鉴定负责人签字 。

　　3

　　GB/T 26612—2011

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　从血液或毛囊中提取 DNA

　　A. 1 马血液样品 DNA 的提取

　　A. 1. 1 从马颈静脉采取血样 5 mL,用移液器量取 100 μL10%(质量分数)EDTA抗凝 。

　　A. 1. 2 取 50 μL血液样品放入 1. 5 mL离心管中 。

　　A. 1. 3 加入 400 μLBuffer A,充分混合至凝块消失 。

　　A. 1. 4 65 ℃温浴 2 h~4 h。

　　A. 1. 5 加入 800μLBufferB,颠倒混合 ,然后冰浴 10 min(或放入 -20℃冰箱内 5 min~ 10 min) 。 A. 1. 6 用离心机在室温下以 12 000 r/min离心 15 min。

　　A. 1. 7 吸取 1 mL上清液于另一新的 1. 5 mL离心管中 。注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物 ,必要时可重复离心去除沉淀物 。

　　A. 1. 8 加入 600 μL异丙醇(isopropanol) ,颠倒混合几次 。

　　A. 1. 9 室温 12 000 r/min离心 15 min。

　　A. 1. 10 弃上清液 ,然后用 70%(体积分数) 乙醇(ethanol) 清洗两次 , 室温干燥 ,加入 150 μL TE 室温溶解 30 min。

　　A. 1. 11 在水平电泳槽内用 1. 0%(质量分数) 琼脂糖胶电泳检测 DNA 的质量 ;采用紫外可见分光光度计 , 以 260/280吸光度检测 DNA浓度 。

　　A. 1. 12 -20 ℃保存 。

　　A. 2 马毛囊样 DNA 的提取

　　A. 2. 1 采取马的鬃毛 ,应该带有毛囊 ,10支以上 。

　　A. 2. 2 取 0. 2 mL离心管 ,标记样品号 。

　　A. 2. 3 取 6根 ~ 10根 带 有 毛 囊 的 毛 样 , 在 根 部 用 剪 刀 剪 切 约 0. 5 cm (避 免 粘 在 剪 刀 上) , 放 入 离 心管中 。

　　A. 2. 4 加入 80μL毛囊裂解液(此浓度为黑毛样品的用量 ,栗毛加 2/3浓度的毛囊裂解液)于毛囊处 ,漩涡振荡仪上迅速漩涡混合 3 min。

　　A. 2. 5 在 PCR仪上用如下程序进行一个热循环 :75℃ 1 min,80℃ 2 min,90℃ 1 min,97℃ 10min。 A. 2. 6 从热循环仪上取下样品 ,加入 80 μL中和液(此浓度为黑毛样品的用量 ,栗毛加 2/3浓度的中和液) ,漩涡混合 3 min。

　　A. 2. 7 -20 ℃保存 。

　　4

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　　附 录 B

　　(资料性附录)

　　用于扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的引物

　　用于扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的引物如表 B. 1所示 。

　　表 B. 1 用于扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的引物

　　位点名称

　　序列(5′—3′)

　　AHT4

　　正向 :AACCGCCTGAGCAAGGAAGT

　　反向 :GCTCCCAGAGAGTTTACCCT

　　AHT5

　　正向 :ACGGACACATCCCTGCCTGC

　　反向 :ATCTAGCAGGCTAAGGAGGCTCAGC

　　ASB2

　　正向 :CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG

　　反向 :GATCATATGCCCTTATCTCTTTGCGC

　　HTG7

　　正向 :CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG

　　反向 :ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT

　　HMS3

　　正向 :CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA

　　反向 :CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT

　　HMS6

　　正向 :GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG

　　反向 :CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA

　　HMS7

　　正向 :CAGGAAACTCATGTTGATACCATC

　　反向 :TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT

　　HTG4

　　正向 :CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC

　　反向 :CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC

　　HMS2

　　正向 :ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG

　　反向 :CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATG

　　HTG6

　　正向 :CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT

　　反向 :GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT

　　HTG10

　　正向 :CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA

　　反向 :TTTTTATTCTGATCTGTCACATTT

　　VHL20

　　正向 :CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG

　　反向 :AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG

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　　附 录 C

　　(资料性附录)

　　扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的 PCR条件

　　C. 1 PCR条件

　　扩增纯血马亲子鉴定的 12个微卫星位点的 PCR条件如表 C. 1所示 。

　　表 C. 1 用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小

　　位点名称

　　标记颜色

　　片段大小/bp

　　退火湿度/℃

　　Mg++ 浓度/mmol/L

　　AHT4

　　蓝色

　　151~ 167

　　60

　　1. 5

　　AHT5

　　黄色

　　133~ 147

　　60

　　1. 5

　　ASB2

　　绿色

　　212~ 248

　　60

　　2. 5

　　HTG7

　　绿色

　　118~ 128

　　55

　　2. 5

　　HMS3

　　绿色

　　150~ 172

　　60

　　2. 5

　　HMS6

　　黄色

　　159~ 173

　　60

　　2. 5

　　HMS7

　　蓝色

　　170~ 186

　　60

　　2. 5

　　HTG4

　　蓝色

　　129~ 141

　　55

　　1. 5

　　HMS2

　　黄色

　　216~ 238

　　60

　　2. 5

　　HTG6

　　绿色

　　84~ 106

　　55

　　2. 5

　　HTG10

　　黄色

　　94~ 114

　　60

　　1. 5

　　VHL20

　　蓝色

　　87~ 105

　　55

　　2. 5

　　C. 2 PCR反应体系

　　PCR反应体 系 如 下 : 50 μL反 应 体 系 : 10× PCR 缓 冲 液 5 μL, dNTPs (5 mmol/L) 1 μL, 引 物(50 μmol/L)各 2 μL,TaqDNA 聚合酶 (5U/μL) 0. 5 μL、模板 DNA 10μL (50 ng~ 500ng) 、ddH2 O 31. 5 μL,扩增每个位点所需的最佳镁离子浓度参见表 C. 1。

　　反应条件 :PCR反应条件随仪器不同略有改变 。94 ℃预变性 1 min~ 3 min。94 ℃变性 30 s,退火30 s(扩增每个位点所需的最佳退火温度参见表 C. 1) , 72 ℃延伸 45 s, 30个循环 。 72 ℃延伸 30 min。 4 ℃保存 。

　　检测过程中分别设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。用已知可成功扩增的马 DNA 样品作阳性对照 ;用等体积的重蒸馏水代替模板 DNA作空白对照 。

　　C. 3 PCR扩增产物的电泳检测

　　PCR扩增产物电泳检测 :取 2. 5 g琼脂糖 ,放入 100 mL 电泳缓冲液(将电泳缓冲液 50×TAE用去离子水稀释 50倍) 加 热 充 分 熔 解 后 制 胶 。 在 电 泳 槽 中 加 入 电 泳 缓 冲 液 , 使 液 面 没 过 凝 胶 。 将 4 μL PCR扩增产物和适量上样缓冲液混合后上样 。 9 V/cm 恒压电泳 ,溴酚蓝迁移至凝胶中部停止 。将胶放入溴化乙锭溶液(浓度为 0. 5 μg/mL)中染色 15 min,采用凝胶成像系统观察电泳结果并记录 。

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　　GB/T 26612—2011

　　附 录 D

　　(资料性附录)

　　采用银染进行微卫星 DNA基因型的分析方法

　　D. 1 12%(质量分数)聚丙烯胺凝胶(25 mL体积 ,0. 1 cm 胶条)制作及电泳

　　D. 1. 1 清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净 , 晾干后上垫条 ,用夹子夹好 。

　　D. 1. 2 在 100 mL烧杯内加入 30%(质量分数) 聚丙烯酰胺 10 mL,2. 5 mL 50%(体积分数) 的甘油 ,电泳解缓 冲 液 5 × TBE 5 mL, 10% (质 量 分 数) 过 硫 酸 铵 0. 175 mL, TEMED 8 μL, 加 入 蒸 馏 水7. 325 mL,混合均匀后迅速灌胶 。上述为一块胶的量 ,多块胶时按比例加倍 。

　　D. 1. 3 当灌胶至玻璃板上沿 0. 1 cm 时停止 ,插入梳子 ,室温放置至其聚合 。

　　D. 1. 4 凝胶聚合好后 , 向垂直电泳槽加入 1×TBE,用注射器冲洗加样孔 。

　　D. 1. 5 预电泳 10 min,然后上样 、电泳 。

　　D. 2 硝酸银染色方法

　　D. 2. 1 用去离子水冲洗胶 。

　　D. 2. 2 用 25%(体积分数)的乙醇浸泡胶 2 min~ 3 min。

　　D. 2. 3 去离子水冲洗 2遍 。

　　D. 2. 4 用 0. 1%(质量分数) AgNO3 染色液染色 30 min~40 min。

　　D. 2. 5 去离子水冲洗 2遍 。

　　D. 2. 6 用显色液(取 15 g NaOH ,加去离子水至 500mL溶解 ,加 0. 076g 四硼酸钠和 800μL甲醛)显色 10 min~ 20 min。

　　D. 2. 7 用去离子水冲洗多余的显色液 。

　　D. 2. 8 显色后的胶用保鲜膜封好 ,观察和照相 。

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　　GB T 26612 2011

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　　附 录 E

　　(资料性附录)

　　纯血马亲子鉴定微卫星 DNA基因型登记

　　纯血马亲子鉴定微卫星 DNA基因型登记如表 E. 1所示 。

　　表 E. 1 纯血马亲子鉴定微卫星 DNA基因型登记表

　　位点名称

　　VHL20

　　HTG4

　　AHT4

　　HMS7

　　AHT5

　　HMS6

　　ASB2

　　HTG10

　　HMS3

　　HMS2

　　HTG6

　　HTG7

　　子代基因型

　　母马基因型

　　公马基因型

　　子代基因型

　　母马基因型

　　公马基因型