GB/T 26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

　　ICS 65 ● 120 B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 26428—2010

　　饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

　　Method for determination of Bacillus subtilis in feeds

　　201 1-01-14 发布 201 1-07-01 实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 26428—2010

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草 。

　　本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口 。

　　本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心 。

　　本标准主要起草人:朱红惠 、孙晓棠 、羊宋贞 、陈远良 、张鲜姣 。

　　I

　　GB/T 26428—2010

　　饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

　　1 范围

　　本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检验方法 。

　　本标准适用于饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测和计数 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注 日期的引用文件 , 仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件 , 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定

　　GB/T 14699 . 1 饲料 采样(GB/T 14699 . 1—2005 , ISO 6497:2002 , IDT)

　　GB/T 20195 动物饲料 试样的制备(GB/T 20195—2006 , ISO 6498:1998 , IDT)

　　3 稀释液 、培养基及试剂

　　除非另有说明 , 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 , 实验室用水采用蒸馏水或去离子水 , 或相当纯度的水 。

　　3 . 1 0. 85 %灭菌生理盐水 。

　　3 . 2 营养琼脂(NA)培养基:参见附录 A 中的 A. 1 。

　　3 . 3 革兰氏染色液:参见附录 A 中的 A. 2 。

　　3 . 4 7%氯化钠生长培养基:参见附录 A 中的 A. 3 。

　　3 . 5 v-P测定培养基和试剂:参见附录 A 中的 A. 4 。

　　3 . 6 硝酸盐还原培养基和试剂:参见附录 A 中 A. 5 。

　　3 . 7 D-甘露醇发酵培养基:参见附录 A 中的 A. 6 。

　　3 . 8 丙酸盐利用培养基:参见附录 A 中的 A. 7 。

　　4 设备和玻璃器皿

　　除常用微生物实验室设备外 , 其他设备和玻璃器皿如下 。

　　4 . 1 恒温培养箱 :37 ℃ ±1 ℃ 。

　　4 . 2 PH 计:精度到 ±0 . 1 个单位 。

　　4 . 3 玻璃或塑料培养皿 。

　　4 . 4 刻度吸管:标记容量为 1 mL和 10 mL, 最小刻度分别为 0. 1 mL和 0. 5 mL。

　　4 . 5 玻璃或塑料涂布棒 。

　　4 . 6 显微镜 : 1 000 倍 。

　　5 采样

　　实验室样品真实 、具有代表性 。采样工具 , 如铲子 、匙 、采样器 、试管 、广口瓶 、剪子等 , 应是灭菌的 。

　　1

　　GB/T 26428—2010

　　样品送到微生物检验室应越快越好 。采样数量和方式按照 GB/T 14699 . 1 执行 。

　　6 试样的制备

　　按照 GB/T 20195 进行试样的制备 , 样品制备后应尽快检验 。

　　7 操作步骤

　　7 . 1 检样制备 、初始悬液和十倍稀释

　　以无菌操作称取试样 25 g(mL) , 加入 225 mL 0. 85%灭菌生理盐水 , 均质 1 min~2 min , 制成1 : 10的初始悬浮液 。 吸取 1 : 10 的初始悬浮液 1 mL, 加入 9 mL0. 85 %灭菌生理盐水 , 经充分混匀后制成1 : 100的稀释液 。根据样品含菌量 , 做进一步的十倍系列递增稀释 。

　　7 . 2 接种和培养

　　选择 2 个 ~3 个适宜的稀释度 , 水浴 80 ℃ ± 1 ℃维持 10 min , 用无菌移液管分别吸取 0. 1 mL, 接种到两个营养琼脂平板(3 . 2)上 。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面 , 涂布棒不得接触平皿边缘 。每个平皿用一支无菌涂布棒 。涂布好的平皿盖好 , 置室温中放置 15 min使接种物完全被琼脂吸收 。 翻转上述平皿置 37 ℃ ±1 ℃培养箱中培养 48 h±2 h 。

　　7 . 3 菌落计数及筛选

　　培养后 , 选取菌落数在 30 个 ~300 个之间的平板计数 。若平板中有较大片状菌落生长时 , 则不宜采用;若片状菌落不到平板的一半 , 而其余一半中菌落分布又很均匀 , 即可计算半个平板后乘以 2 以代表全皿菌落数 。典型枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙 , 不透明 , 不闪光 , 边缘扩张 , 圆形或蔓延成波浪形 、不规则形 , 灰白色或微黄色 。然后从中选出 5 个特征菌落进行确证试验 。

　　7 . 4 确证试验

　　7 . 4 . 1 概述

　　目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管 , 如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致 , 可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验 。

　　7 . 4 . 2 菌种制备

　　自平板上挑取单菌落 , 划线转接培养于营养琼脂平板上 , 37 ℃ ±1 ℃培养 48 h ±2 h 。从每一平板中选取至少 1 个良好分离的特征菌落 , 转接保存 , 进行确证试验 。

　　7 . 4 . 3 形态观察

　　将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(3 . 3)镜检 。枯草芽孢杆菌细胞应为杆状 , 有芽孢 , 芽孢椭圆形 , 中生或近中生 , 芽孢囊不明显膨大 。

　　7 . 4 . 4 生理生化确证试验

　　将挑选纯化的菌落进行 7%氯化钠生长(3 . 4) 、v-P测定(3 . 5) 、硝酸盐还原(3 . 6) 、D-甘露醇发酵(3 . 7)和丙酸盐利用(3 . 8)试验 。

　　2

　　GB/T 26428—2010

　　7 . 4 . 5 确证结果

　　枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙 , 不透明 , 灰白色或微黄色 , 细胞杆状 , 有芽孢 , 芽孢椭圆形中生或近中生 , 芽孢囊不明显膨大 , 在 7%氯化钠中生长 , v-P测定阳性 , 硝酸盐还原阳性 , 能从 D-甘露醇产酸 , 不利用丙酸盐者可判为枯草芽孢杆菌 。枯草芽孢杆菌与类似芽孢杆菌的鉴别特征见表 1 。

　　表 1 枯草芽孢杆菌与其他类似芽孢杆菌的鉴别特征

　　项 目

　　枯草芽孢杆菌

　　B. subtilis

　　地衣芽孢杆菌

　　B. licheniformis

　　蜡样芽孢杆菌

　　B. cereus

　　凝结芽孢杆菌

　　B. coagulans

　　坚强芽孢杆菌

　　B. firmus

　　迟缓芽孢杆菌

　　B. lentus

　　巨大芽孢杆菌

　　B. megaterium

　　短小芽孢杆菌

　　B. pumilus

　　厌氧生长

　　—

　　+

　　+

　　+

　　—

　　—

　　—

　　—

　　v-P

　　+

　　+

　　+

　　+

　　—

　　—

　　—

　　+

　　硝酸盐还原

　　+

　　+

　　+

　　d

　　d

　　d

　　d

　　—

　　淀粉水解

　　+

　　+

　　+

　　+

　　+

　　+

　　+

　　—

　　明胶液化

　　+

　　+

　　+

　　—

　　+

　　d

　　+

　　+

　　利 用

　　丙酸盐

　　—

　　+

　　ND

　　—

　　—

　　—

　　ND

　　—

　　柠檬酸盐

　　+

　　+

　　+

　　d

　　—

　　—

　　+

　　+

　　产 酸

　　D-木糖

　　+

　　+

　　—

　　d

　　—

　　+

　　d

　　+

　　L-阿拉伯糖

　　+

　　+

　　—

　　d

　　—

　　+

　　d

　　+

　　D-甘露醇

　　+

　　+

　　—

　　d

　　+

　　+

　　d

　　+

　　7%氯化钠生长

　　+

　　+

　　d

　　—

　　+

　　d

　　d

　　+

　　PH5 . 7 生长

　　+

　　+

　　+

　　+

　　—

　　—

　　d

　　+

　　注 : + :阳性 ; — :阴性;d:部分菌株为阳性;ND:未测定 。

　　8 结果计算与报告

　　8 . 1 计算每块板上枯草芽孢杆菌菌落数

　　计数每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数 a , 使用式(1)计算:

　　a C ………………………………( 1 )

　　式中:

　　a — 计数每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数 ;

　　b — 挑取后经证实为枯草芽孢杆菌的菌落数 ;

　　A— 挑取平板上用于验证的菌落数 ;

　　C— 平板上的所有特征菌落数 。

　　最终结果按照 GB/T 8170 数值修约规则修约至整数 。

　　示例 :

　　若某板上长有 78 个典型菌落 , 从中选出做确证实验的 5 个菌中有 4 个证实为枯草芽孢杆菌 , 则 :

　　按照 GB/T 8170 数值修约规则得 a 为 62 。

　　3

　　GB/T 26428—2010

　　8 . 2 样品中枯草芽孢杆菌数的计算方法与报告

　　选择两个连续稀释度平板(每个稀释度至少有一块平板 , 其上经确证后的枯草芽孢杆菌菌数介于30~300 之间) , 通过式(2)计算 , 即为 1 mL或 1 g样品中的枯草芽孢杆菌数 N:

　　N ………………………………( 2 )

　　式中:

　　N — 样品中枯草芽孢杆菌菌数 ;

　　Σ a — 所有平板经确证后的枯草芽孢杆菌菌数的总和 ;

　　v — 平板的接种体积 , 单位为毫升(mL) ;

　　n1 — 第一个稀释度的平板数 ;

　　n2 — 第二个稀释度的平板数 ;

　　d — 第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的 d值为 1) 。

　　按照 GB/T 8170 数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字 , 也可将样品的枯草芽孢杆菌菌落数记录为 1 . 0~9 . 9 乘以 10 的指数幂表示 。

　　报告每毫升或每克样品的枯草芽孢杆菌估计数 , 单位为 CFU/g(mL) 。

　　示例 1 :

　　若第一个稀释度(10 —3 )经确证后的菌落数为 168 和 215 , 第二个稀释度(10 —4 )经确证后的菌落数为 34 和 55 , 则 :

　　按照 GB/T8170 数值修约规则得出每克或每毫升样品中含枯草芽孢杆菌估计数为 2 100 000 CFU/g(mL)或 2 . 1 × 106 CFU/g(mL) 。

　　示例 2 :

　　若只有最后一稀释液(10 —4 )经证实含枯草芽孢杆菌菌落数分别为 120 和 130 , 则 :

　　按照 GB/T 8170 数值修约规则修约 , 报告每克或每毫升样品中含枯草芽孢杆菌估计数为 12 000 000 CFU/g(mL)或 1 . 2 × 107 CFU/g(mL) 。

　　4

　　GB/T 26428—2010

　　附 录 A (资料性附录)培养基和试剂

　　A. 1 营养琼脂(NA)培养基

　　A. 1 . 1 成分

　　蛋白陈

　　10 g

　　牛肉膏

　　3 g

　　氯化钠

　　5 g

　　琼脂

　　16 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A. 1 . 2 制法

　　溶解各成分于水中,必要时加热O调整 PH值,使培养基 PH值在 25 ℃时为 7 . 3 ±0 . 2 O 121 ℃灭菌 30 minO

　　A. 2 革兰氏染色

　　A. 2 . 1 结晶紫染色液

　　A. 2 . 1 . 1 成分

　　结晶紫

　　1 g

　　95%乙醇

　　20 mL

　　1%草酸铵水溶液

　　80 mL

　　A. 2 . 1 . 2 制法

　　将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合O A. 2 . 2 革兰氏碘液

　　A. 2 . 2 . 1 成分

　　碘

　　1 g

　　碘化钾

　　2 g

　　蒸馏水

　　300 mL

　　A. 2 . 2 . 2 制法

　　将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mLO

　　5

　　A. 2 . 3 沙黄复染液A. 2 . 3 . 1 成分

　　沙黄

　　0 . 25 g

　　95%乙醇

　　10 mL

　　蒸馏水

　　90 mL

　　A. 2 . 3 . 2 制法

　　将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释 。

　　A. 2 . 4 染色法

　　将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染色 1 min,水洗;滴加革兰氏碘液,作用 1 min,水洗;滴加 95 %乙醇脱色,约 30s,水洗;滴加沙黄复染液,复染 1 min,水洗,待干,镜检 。

　　A. 3 7%氯化钠生长

　　A. 3 . 1 成分

　　蛋白陈

　　10 g

　　牛肉膏

　　3 g

　　氯化钠

　　70 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A. 3 . 2 制法

　　溶解各成分于水中,必要时加热 。调整 PH值,使培养基 PH值在 25 ℃时为 7 . 4±0 . 2 。分装试管 , 121 ℃灭菌 30 min 。

　　A. 3 . 3 试验方法

　　取新鲜培养物接种于上述培养基中 , 36 ℃ ± 1 ℃培养 2d~7d,与未接种的对照管对比 , 目测生长情况 。

　　A. 4 V-P测定

　　A. 4 . 1 培养基

　　A. 4 . 1 . 1 成分

　　蛋白陈 5 g

　　葡萄糖 5 g

　　氯化钠 5 g

　　蒸馏水 1 000 mL

　　A. 4 . 1 . 2 制法

　　溶解各成分于水中,必要时加热 。调整 PH值,使培养基 PH值在 25 ℃时为 7 . 0±0 . 2 。分装试管 ,

　　6

　　121 ℃灭菌 30 min 。 A. 4 . 2 试剂

　　肌酸

　　0. 3%或原粉

　　氢氧化钠

　　40%

　　A. 4 . 3 试验方法

　　接种菌于上述培养基中 , 36 ℃ ±1 ℃培养 2 d~4 d 。取培养液和 40%氢氧化钠等量相混 。加少许肌酸 , 10 min如培养液出现红色 , 即为阳性反应 , 有时需放置更长时间才出现红色反应 。

　　A. 5 硝酸盐还原

　　A. 5 . 1 培养基

　　A. 5 . 1 . 1 成分

　　蛋白陈

　　20 g

　　牛肉膏

　　3 g

　　氯化钠

　　5 g

　　硝酸钾

　　1 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A. 5 . 1 . 2 制法

　　溶解各成分于水中 , 必要时加热 。调整 PH值 , 使培养基 PH值在 25 ℃时为 7 . 4±0 . 2 。分装试管 , 121 ℃灭菌 30 min 。

　　A. 5 . 2 试剂

　　甲液 :

　　对氨基苯磺酸10 %乙酸溶液

　　0 . 5 g

　　150 mL

　　乙液 :

　　甲萘胺

　　蒸馏水

　　10 %乙酸溶液

　　0 . 1 g 20 mL

　　150 mL

　　二苯胺试剂 :

　　二苯胺

　　蒸馏水

　　浓硫酸

　　0 . 5 g 20 mL

　　100 mL

　　A. 5 . 3 试验方法

　　接种菌于上述培养基中 , 36 ℃ ±1 ℃培养 2 d~4 d 。加入甲液和乙液各 1 滴 , 观察结果 。如溶液变为红色 、橙色 、棕色为硝酸盐还原阳性 。如无红色出现 , 可加 1 滴 ~2 滴二苯胺试剂 , 如不呈蓝色 , 也为硝酸盐还原阳性 , 呈蓝色则为阴性 。

　　7

　　A. 6 D-甘露醇发酵A. 6 . 1 培养基

　　A. 6 . 1 . 1 成分

　　磷酸氢二铵

　　1 g

　　氯化钾

　　0 . 2 g

　　硫酸镁

　　0 . 2 g

　　酵母膏

　　0 . 2 g

　　D-甘露醇

　　10 . 0 g

　　0. 04%溴甲酚紫

　　15 mL

　　琼脂

　　5 g

　　蒸馏水

　　1 000 mL

　　A. 6 . 1 . 2 制法

　　除指示剂溴甲酚紫外,其余各成分溶解于水,必要时加热o 调整 PH 值,使灭菌后培养基 PH 值在25 ℃时为 7 . 0±0 . 2 o 加入指示剂溴甲酚紫,分装试管,115 ℃灭菌 30 mino

　　A. 6 . 2 试验方法

　　挑取小量培养物接种于上述培养基中, 36 ℃ ± 1 ℃培养 2 d~5 do 观察指示剂变黄,表示产酸,为阳性;不变或变蓝(紫)则为阴性o

　　A. 7 丙酸盐利用

　　A. 7 . 1 培养基

　　A. 7 . 1 . 1 成分

　　硫酸镁 ● 7H2 O

　　0 . 2 g

　　磷酸氢二氨

　　1 g

　　磷酸氢二钾 ● 3H2 O

　　1 g

　　氯化钠

　　5 g

　　丙酸钠

　　2 g

　　1%溴百里酚蓝水溶液

　　10 mL