GB/T 21805-2025 化学品 藻类生长抑制试验

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21805—2025代替 GB/T21805—2008

　　化学品 藻类生长抑制试验

　　Chemicals—Alga growth inhibition test

　　2025-10-05发布 2026-02-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21805—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 受试物信息 2

　　5 试验原理 2

　　6 参比物 3

　　7 试验方法 3

　　8 试验程序 4

　　9 质量保证与质量控制 6

　　10 数据与报告 7

　　附录 A (资料性) 试验藻种 11

　　附录 B (资料性) 培养基 13

　　附录 C (资料性) 藻类培养过程示例 16

　　附录 D (资料性) 非线性回归数据分析 17

　　参考文献 20

　　Ⅰ

　　GB/T 21805—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21805—2008《化学品 藻类生长抑制试验》, 与 GB/T 21805—2008相比 , 除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 更改了试验原理的内容(见第 5 章 ,2008年版的 4. 1) ;

　　— 更改了试验方法和试验程序的内容(见第 7章 、第 8章 ,2008年版的第 5 章 、第 6章 、第 7章) ;

　　— 更改了数据与报告的部分内容(见第 10章 ,2008年版的第 9章) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 、沈阳沈化院测试技术有限公司安全评价中心 、上海市检测中心 、辽宁省生态环境事务服务中心 、生态环境部南京环境科学研究所 、上海市环境科学研究院 、广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 。

　　本文件主要起草人 :胡俊杰 、刘晓建 、刘洪英 、董梦琦 、滕晓明 、杨海荣 、白杨 、杨力 、马燕 、杨琨 、杨力 、李非凡 、李文超 、杨婧 、王蕾 、宋京洋 、杨雪菲 、胡双庆 、柳燕贞 、祝新茗 、凌思源 、卢玲 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21805—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅲ

　　GB/T 21805—2025

　　化学品 藻类生长抑制试验

　　1 范围

　　本文件规定了化学品藻类生长抑制试验的受试物信息 、试验原理 、参比物 、试验方法 、试验程序 、质量保证与质量控制 、数据与报告 。

　　本文件适用于评价具有低挥发性 、高环境稳定性且试验条件下可溶于水的受试物对藻类生长的影响 。如果要测试挥发性的 、强吸附性的 、有颜色的 、不溶或难溶于水的受试物 , 以及可能影响培养基中营养物质或矿物质有效利用 的 受 试 物 , 需 要 对 所 述 试 验 程 序 进 行 修 改(如 采 用 密 闭 系 统 、适 当 的 试 验 容器等) 。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件 。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　生物量 biomass

　　单位体积试验介质内活体生物的干重 。

　　注 : 例如每升试验溶液中含多少毫克藻类干重 。生物 量 通 常 被 定 义 为 质 量 ,但 在 本 文 件 中 ,是 指 单 位 体 积 的 质 量 ,通常以单位体积内细胞数量 、荧光性等替代生物量测定 。

　　3.2

　　变异系数 coefficientofvariation

　　标准差与平均数之比 。

　　注 : 变异系数是一个无量纲的数 ,便于样本间的相互比较 ,通常以百分比表示 ,记作 CV% 。对照组各平行平均比生长率变异系数的平均值按以下方式计算 :

　　a) 分别计算对照组各平行在各阶段的平均比生长率的变异系数 ;

　　b) 将上述 a)得到的所有数据进行平均 ,得出对照组各平行平均比生长率变异系数的平均值 。 3.3

　　效应浓度 effectconcentration;ECx

　　在给定测定周期内 ,与对照组相比 ,导致受试生物生长下降 x%的受试物浓度 。

　　注 : ECx 分为基于生长率的 Er Cx 和基于生长量的 Ey Cx 。

　　3.4

　　藻类生长培养基 growth medium

　　人工合成的藻类培养介质 。

　　注 : 本文件中藻类暴露于受试物时 ,通常将受试物溶于该培养介质中 。

　　3.5

　　生长率 growth rate

　　暴露期间生物量的指数增长率 。

　　1

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　　注 : 即平均比生长率(average specific growth rate) 。

　　3.6

　　最低可观察效应浓度 lowestobserved effectconcentration;LOEC

　　给定测试周期内 ,与对照相比 ,对藻类生长有明显(p<0. 05)抑制效应的最低试验浓度(受试物设置浓度) 。

　　注 : 高于 LOEC 的所有试验浓度均观察到与 LOEC相同的或更严重的毒性影响 。如果未满足该条件 ,就 LOEC[以及无可观察效应浓度(NOEC)]的选择进行详细说明 。

　　3.7

　　无可观察效应浓度 no observed effectconcentration;NOEC

　　紧临并低于 LOEC 的试验浓度(受试物设置浓度) 。

　　3. 8

　　响应变量 responsevariable

　　通过不同计算方法 、从描述生物量的任何测量参数中推导出用于估算毒性的变量 。

　　注 : 本文件中指生长率和生长量 。

　　3.9

　　比生长率 specificgrowth rate

　　测试期间 ,生物量自然对数值在单位时间内的变化率 。

　　3. 10

　　生长量 yield

　　测试结束时与测试开始时生物量之差 , 以反映试验期间生物量的增长 。

　　4 受试物信息

　　4. 1 受试物所需信息宜包括 :

　　a) 结构式 ;

　　b) 纯度 ;

　　c) 光中的稳定性 ;

　　d) 试验条件下的稳定性 ;

　　e) 吸光性 ;

　　f) 水解离常数(pKa) ;

　　g) 转化方面的研究结果 ,包括水中的生物降解试验结果 。

　　4.2 受试物所需信息应包括 :

　　a) 水中溶解度 ;

　　b) 正辛醇-水分配系数(POW ) ;

　　c) 蒸气压 ;

　　d) 试验条件下有效的受试物定量分析方法 ,包括注明回收率和检测限 。

　　5 试验原理

　　5. 1 本试验的目的是确定受试物对淡水微藻和/或蓝藻生长的影响 。将呈指数增长的藻类通过分批培养 ,暴露于受试物 。试验周期通常 72 h。尽管测试持续时间相对较短 ,但可评估对几代藻类的影响 。

　　5.2 与无受试物暴露的对照相比 ,暴露于不同浓度的受试物 ,藻类生长会受到不同程度的抑制 ,将生长抑制效应作为暴露浓度的函数进行评估 。测量藻类在营养充足 、连续光照足够长时间的条件下不受限

　　2

　　GB/T 21805—2025

　　制地呈指数生长时的比生长率的降低 , 以充分表达受试物的毒性效应(达到最佳灵敏度) 。

　　5.3 测量不同时间藻类的生物量 , 以量化藻类的生长和生长抑制 ,但因藻类干重难以测量 ,使用替代参数 。在这些替代参数中 ,最常使用细胞计数 。其他替代参数包括细胞体积 、荧光 、光密度等 。测量的替代参数和生物量之间的换算系数应是已知的 。

　　5.4 测试终点为生长抑制 , 以试验期间生物量对数增加(比生长率)的降低来表达 。根据一系列试验浓度下的平均比生长 率 , 确 定 引 起 比 生 长 率 降 低 达 到 x%(例 如 50%) 的 浓 度 并 表 示 为 Er Cx (例 如 Er C50) 。

　　5.5 另一响应变量是生长量 , 即暴露结束时生物量与暴露开始时生物量之差 。根据一系列试验浓度下的平均生长量 ,确定引起生长量降低达到 x%(例如 50%)的浓度并表示为 Ey Cx (例如 Ey C50) 。

　　5.6 可统计得出 LOEC和(或) NOEC。

　　6 参比物

　　可使用 3,5-二氯苯酚作为参比物 。对于绿藻 ,也可使用重铬酸钾作为参比物 。

　　定期测试参比物对藻类生长的影响 ,至少每年两次 。

　　7 试验方法

　　7. 1 仪器设备

　　7. 1. 1 试验容器

　　试验容器和其他与试验溶液直接接触的器皿应完全为玻璃或其他化学惰性材料制成 ,用于试验前应彻底清洗并灭菌 。试验容器通常为具有一定容积的玻璃瓶 ,如三角瓶 , 以保证试验期间有足够的试验溶液用于测试 , 同时也保证 CO2 的充分交换 。应保证有足够的液体用作分析测量 。

　　7. 1.2 培养设备

　　使用温度控制精度在 ±2℃范围内的光照培养箱 。

　　7. 1.3 照度计

　　光接受器的类型可能影响测量值 。宜使用 4 π 的球面照度计(可接受来自各方向各角度的直射或反射光照)或 2 π 球面照度计(可接受来自上方各角度的直射或反射光照) 。

　　7. 1.4 测量藻类生物量的仪器设备

　　细胞计数是藻类生物量最常用的替代参数 。用于计数的仪器设备主要有电子颗粒计数仪 、带计数室的显微镜 、流式细胞计数仪等 。也可使用荧光计 、分光光度计 、色度计等测量其他替代参数 。应明确细胞计数和藻类干重之间的转换关系 。为了在低生物量时进行有效测量 ,分光光度计吸收池的光径至少为 4 cm。

　　7. 1.5 其他仪器

　　pH计 、电子分析天平 、高压灭菌器等 。

　　7.2 受试生物

　　选择一些不易附着于瓶壁上的绿藻和蓝藻作为受试生物 。

　　3

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　　a) 绿藻 :

　　— 近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata,曾用名 :羊角月芽藻/Pseudokirchneriella sub- capitata) ;

　　— 近具棘链带藻(Desmodesmussubspicatus,曾用名 :栅藻/Scenedesmussubspicatus) ;

　　— 普通小球藻(Chlorella vulgaris) 。

　　b) 硅藻 :舟形藻(Navicula pelliculosa) 。

　　c) 蓝藻 :

　　— 水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae) ;

　　— 聚球藻(Synechococcusleopoliensis) 。

　　上述藻类的详细信息见附录 A。

　　如选用其他藻类 ,应在报告中说明其品系和(或)来源 ,并确保在试验期间相应的试验条件下保持指数生长 。

　　7.3 培养基

　　推荐使用经济合作与发展组织(OECD)藻类生长培养基和藻类检测程序(AAP) 藻类生长培养基 。两种培养基信息见附录 B。两种培养基的初始 pH 和缓冲能力不同 , 同一受试物在不同培养基中对同一藻类的影响可能不同 ,受试物在水中离子化程度较高时尤为显著 。

　　出于某些特定目的 ,需 要 对 藻 类 生 长 培 养 基 进 行 改 良 时 , 例 如 在 测 试 金 属 和 螯 合 剂 , 或 在 不 同 的pH值条件下测试 ,应详细描述改良后培养基的使用 ,并说明其合理性 。

　　8 试验程序

　　8. 1 试验准备

　　8. 1. 1 藻液的制备

　　为使受试藻类适应试验条件 ,保证藻类在用于接种试验溶液时处于指数生长期 ,应在试验开始前2 d~4 d制备测试培养基的接种物培养液 。应调整藻类生物量 ,确保在接种物培养液在试验开始前呈指数增长 。藻类接种物培养时 ,应测量接种培养基中藻类生物量的增加情况 ,确保在培养条件下藻类的生长处于正常范围内 。 附录 C 中描述了藻类培养程序的一个示例 。 为避免试验期间同步细胞分裂 ,可对接种物传代培养 2 次 。

　　试验时 ,所有试验溶液中的藻类的初始生物量应相同且足够低 , 以保证整个培养期间维持指数增长且不存在营养耗尽的风险 。试验溶液中的藻类初始生物量(干重) 不应超过 0. 5 mg/L。各种藻类在试验溶液中的初始细胞浓度建议如下 :

　　a) 近头状尖胞藻(Raphidocelis subcapitata) ,5×103个/mL~ 5×104个/mL;

　　b) 近具棘链带藻(Desmodesmus subspicatus) ,2×103个/mL~ 5×103个/mL;

　　c) 舟形藻(Navicula pelliculosa) ,104个/mL;

　　d) 水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae) ,104个/mL;

　　e) 聚球藻(Synechococcus leopoliensis) ,5×104个/mL~ 5×105个/mL。

　　8. 1.2 试验溶液的制备

　　将受试物溶解在经灭菌后的新鲜藻类生长培养基中配制受试物储备液 。试验时用培养基稀释成不同的浓度 ,并接种受试藻类接种物 ,配制成一系列不同浓度的受试物溶液 。所有试验溶液应包含相同浓度的藻类生长培养基和藻类初始生物量 。

　　4

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　　如果受试物难溶于水 ,制备受试物储备液时可添加适合的溶剂 ,例如丙酮 、t-丁基乙醇和二甲基甲酰胺等 。应选用对藻类生长无影响的溶剂 ,所有试验溶液(包括对照)中溶剂的添加浓度应相同 ,并且最大允许浓度为 100 μL/L。

　　8.2 试验操作

　　8.2. 1 预试验

　　为确定正式试验中受试物浓度的设置范围 ,可先进行预试验 。

　　测量项目和方法可简化 ,试验时间有时也可缩短 。

　　8.2.2 正式试验

　　根据预试验的结果设置正式试验的受试物浓度范围 ,宜在对藻类产生 5 % ~ 75 %生长抑制效应之间以几何级数设置受试物浓度系列 。正式实验至少设 5 个浓度组 ,浓度间隔系数应不超过 3. 2,对于剂量-效应曲线较为平坦的受试物 ,可能需要更大的浓度间隔系数 。

　　每个试验浓度设 3个平行 。如果试验不需要得出 NOEC,可适当减少平行数而增加试验浓度的设置数量 。应同时设置空白对照组 ,若使用溶剂 ,还应增设溶剂对照组 。对照组至少设 3个平行 。如果条件允许 ,对照组平行数为受试组的 2倍 。可单独配制一组试验溶液用于受试物浓度的分析测量 。

　　8.2.3 试验培养

　　试验容器用透气塞封 口 ,摇匀后放入培养设备中 。试验期间 ,为保持藻细胞的悬浮和 CO2 的流通 ,应持续振荡或搅拌 。 培养温度为 23 ℃ ±2 ℃ 。宜将试验容器随机摆放 , 每天改变其在培养设备中的位置 。

　　试验期间 ,对照组 pH值的升高应不超过 1. 5。如受试物含 有 金 属 或 在 试 验 pH 下 发 生 部 分 离 子化 ,应限制 pH 的偏离 ,确保获得可重复的试验结果 。理论上 pH偏离小于 0. 5是可行的 ,可通过确保从空气到试验溶液间有充足的 CO2交换实现 ,例如增大摇动频率 。另一个途径是减少初始生物量或缩短试验周期以减少对 CO2 的需求 。

　　试验溶液表面应接收持续均匀的光照 ,如冷白型或 日光型光照 。波长在 400 nm~ 700 nm、光照强度在 60 μE · m- 2 · s- 1 ~ 120 μE · m- 2 · s-1范围的光照适用于所推荐绿藻生长(对于单位为 lx 的照

　　度计 ,60 μE · m- 2 · s- 1 ~ 120 μE · m- 2 · s-1大约为 4440 lx ~ 8880 lx 的冷白光) 。对于水华鱼腥藻等较低光照强度下生长良好的物种 ,平均光照强度应选择在 40 μE · m- 2 · s- 1 ~ 60 μE · m- 2 · s-1 范围内 。培养区域的光强差异应保持在 ±15%范围内 。

　　8.2.4 试验周期

　　试验周期为 72 h。但若需满足质量保证与质量控制的相关要求 ,可根据实际试验情况适当缩短或延长试验周期 。

　　8.2.5 测量、分析与观察

　　8.2.5. 1 试验期间 ,每天至少测量一次各试验容器中藻类的生物量 。如果从试验溶液中吸取少量试验溶液进行测量 ,测量完成后 ,不应将取出的试验溶液放回至试验容器中 。

　　8.2.5.2 试验开始和结束时测量试验溶液的 pH。

　　8.2.5.3 建立试验溶液中受试物浓度的分析测定方法 ,试验开始和试验期间定期取样分析 ,确定各试验溶液的初始浓度以及试验期间的实际暴露浓度 。如试验期间受试物浓度维持在配制浓度(或实测初始浓度) ±20%的范围内 ,可仅分析试验开始和结束时最高浓度组 、最低浓度组和接近 50%生长抑制浓度

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　　组中受试物的浓度 ;如无法维持 ,则应测量所有浓度组中受试物的浓度 。如果受试物具有挥发性 、不稳定性或强吸附性 ,则应每隔 24h测量一次 , 以确定受试物的损失情况 。对于此类物质 ,可能需要增加平行数 。在上述任何情况下 ,各浓度组只需用 1个平行(或将几个平行中的试验溶液合并) 测量受试物的浓度 。

　　8.2.5.4 用于受试物浓度分析的培养基应与试验用培养基经过同样的处理 , 即接种藻类且在相同试验条件下培养 。如需要分析溶解的受试物浓度 ,应将藻类从培养基中分离 。分离操作使用低速离心 ,足以使藻类沉淀 。

　　8.2.5.5 如测量浓度在配制浓度(或实测初始浓度) ±20 %的范围内 ,可用配制浓度或实测初始浓度进行结果计算 ;如超出该范围 ,则使用实测浓度的几何平均值或根据受试物浓度下降的模型进行计算 。

　　8.2.5.6 相较其他绝大多数短期的水生毒性试验 ,藻类生长抑制试验更具动态性 。试验中实际的暴露浓度难以确定 ,尤其是在低浓度下测试的吸附性物质 。 由于吸附在不断增加的藻类细胞上 ,试验溶液中受试物的损失并不意味着它从该试验系统中消失 。分析试验结果时 ,应检查试验过程中受试物浓度降低是否伴随藻类生长抑制的降低 。如果发生此类情况 ,可使用合适的受试物浓度下降模型 ;反之 ,则宜基于初始浓度(配制或实测)进行计算 。

　　8.2.5.7 试验结束时 ,用显微镜观察试验接种的藻类细胞外观是否正常和健康 ,并记录藻类细胞的任何异常情况(可能由于暴露于受试物中引起的) 。

　　8.2.6 藻类生长测量方法

　　测量藻类生长的指标和方法很多 ,具体如下 。

　　a) 细胞计数 。在显微镜下 ,用 0. 1 mL计数框或血球计数板对藻细胞的数量计数 。用计数框时可采用视野法 , 即对显微镜视野中的所有细胞计数 。放大倍数 40×10, 每片至少计数 10个视野 ,如果藻细胞密度小 ,则要适当增加计数视野 ,藻数按视野累加 。每次计数(同一批取样的样品)应采用相同方法(视野数目 、放大倍数等) 。 每一样品至少计数 2 次 ,如计数结果相差大于15% ,应予重复计数 。如工作量过大 ,可先取样 ,用卢戈氏液固定后保存 , 留待以后计数 。镜检计数工作量较大 ,有条件时可采用电子颗粒计数仪 。

　　b) 光密度 。取一定量的测试液在分光光度计上测量其光密度 ,波长可选用 650 nm、663 nm 或其他波长 。亦可用荧光光度计测量 。

　　c) 叶绿素 。样品经离心或过滤后 ,用丙酮 、乙醇或其他溶剂萃取 ,进行分光测量 。亦可用荧光光度计测量 。

　　8.2.7 限度试验

　　如果预试验表明受试物浓度达到 100 mg/L或试验条件下饱和溶液浓度(该溶解度低于 100 mg/L)时未对藻类生长产生毒性影响 ,可进行含有 1个对照组和 1 个浓度组(100mg/L或在试验条件下饱和溶液浓度)的限度试验 。进行限度试验 ,宜有受试物的浓度分析加以佐证 。 除了平行数增加到至少 6个之外 ,所有有关试验条件 、试验方法 、质量保证与质量控制的描述均适用于限度试验 。对照组和受试组中测得的响应变量应用统计学方法进行比较分析 ,例如 Studentt检验 。如果两组的方差不相等 ,则应进行不等方差调整的 t检验 。

　　9 质量保证与质量控制

　　试验达到以下指标方为有效 。

　　a) 试验开始的 72 h 内 ,对照组藻类呈指数增长且浓度应至少增加 16倍 , 即比生长率 ≥0. 9 d- 1 。对于常用的试验藻种 ,生长率远高于此(见附录 A) 。如试验使用的藻种生长较慢 ,该指标可能

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　　不适用 。如果发生此类情况 ,应延长试验周期 ,直至对照组藻类呈指数增长且浓度增加 16倍 。同样 ,只要对照组 藻 类 保 持 无 限 的 指 数 增 长 且 浓 度 增 加 16倍 , 也 可 缩 短 试 验 周 期 , 但 至 少48h。

　　b) 试验各阶段 ,如 0 d~ 1 d、1 d~ 2 d和 2 d~ 3 d,对照组各平行的不同阶段平均比生长率变异系数的平均值应不超过 35% 。

　　c) 整个试验期间 ,对照组各平行的平均比生长率变异系数 , 用近头状尖胞藻(Raphidocelis sub- capitata)和近具棘链带藻(Desmodesmussubspicatus)作为藻种时 ,应不超过 7% ;用其他非常用藻种时 ,应不超过 10% 。

　　10 数据与报告

　　10. 1 数据处理

　　10. 1. 1 绘制生长曲线

　　10. 1. 1. 1 用测定的替代参数(如藻细胞浓度 、荧光性)表示试验容器中藻类的生物量 。

　　10. 1. 1.2 以表格形式列出 24h、48h 和 72 h对照组和各受试组的试验容器中的藻类生物量 。

　　10. 1. 1.3 以时间为横轴 ,藻类生物量为纵轴 ,取各平行的平均值 ,绘制对照组和各受试组的藻类生长曲线 。可使用对数坐标轴 ,也可使用直线坐标轴 。用对数坐标轴作出的生长曲线是一条直线 ,其斜率就是藻类的比生长率 。

　　10. 1. 1.4 观察生长曲线 ,检查整个试验期间对照组的生长是否达到预期的指数增长 。仔细检查所有数据点和图表 ,核对原始数据和程序是否存在可能的错误 。仔细检查可能偏离系统误差的所有数据点 。如果发现了明显的程序上的错误或该错误发生的可能性非常高 ,将相关的数据点标为异常值 ,并在进行下一步的统计分析时剔除这些数据(如果其中一个平行中藻类的浓度为零 ,那可能是该平行试验溶液中未接入藻类或器皿的洗涤方法不正确) 。试验报告中对于作为异常值被剔除的数据应阐明其原因 。 可接受的原因仅限于(罕见的)程序错误 ,而不仅仅是精度差 。异常值识别的统计程序对这类问题的用途有限 ,不能代替专家判断 。在之后出现的图表中宜保留异常值 。

　　10. 1.2 响应变量

　　试验的目的是确定受试物对藻类生长的影响 ,有平均比生长率和生长量两个响应变量 。这两个响应变量计算的毒性值不具有可比性 ,应用试验结果时应认识到这种差异 。

　　由于方法的数学基础不同 ,基于平均比生长率(ErCx )的 ECx 值通常会高于基于生长量(Ey Cx )的结果 。这只是数学上的数值不同 ,不是两个响应变量存在灵敏度差异 。平均比生长率是基于藻类在非限制培养中的一般指数生长模式 ,毒性是根据对生长速率的影响来估计的 ,而不依赖于对照组比生长率的绝对水平 、浓度-效应曲线的斜率或试验周期 。 相对而言 ,基于生长量的毒性结果受所有这些其他因素的影响 ,Ey Cx 取决于每个试验使用的藻类物种的比生长率和最大比生长率 , 藻类种类和品系可能都是不同的 。生长量不应用于比较藻类甚至不同菌株对受试物的敏感性 。科学上 ,更倾向于使用平均比生长率进行毒性评价 。

　　10. 1.3 参数计算

　　本文件应计算以下参数以评价受试物对藻类的影响 。

　　a) 比生长率 ,见式(1) 。

　　μi-j …………………………( 1 )

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　　GB/T 21805—2025

　　式中 :

　　μi-j— 从 i时间 ~j 时间的比生长率 ,单位为每天(d-1) ;

　　Xj —j 时间的生物量 ;

　　Xi —i时间的生物量 。

　　对于对照组和各受试组 ,计算各平行的平均值和方差估算值 。

　　采用藻类初始接种生物量的设定值计算整个试验周期(通常 0 d~ 3 d) 的平均比生长率 , 比采用测量值计算得更精确 。如果生物量测量仪器允许足够精确地测量低接种物生物量(如流动血细胞计数仪) ,可使用初始生物量的测量值进行计算 。计算并评估试验过程中每天的(0 d~ 1 d、1 d~ 2 d和 2 d~ 3 d)比生长率 ,并检查对照组的生长率是否符合质量保证与质量控制的要求 。如果与总平均比生长率相比 ,第一天的比生长率相当低 ,说明第一天藻类处于生长停滞期 。通过预培养消除对照组中的生长停滞期或使其最小化 ,暴露组中的生长停滞表明藻类经受试物作用后可能恢复或由于受试物的损失(包括吸附于藻类) 减少了暴露量 。 因此 , 为了评价暴露期间发生的受试物对藻类生长的影响 ,应评价试验各阶段的生长率 。如果平均比生长率和各阶段生长率间存在显著差异 ,说明藻类未保持持续指数增长 ,要仔细检查生长曲线 。

　　b) 基于比生长率的抑制率 ,见式(2) 。

　　Ir …………………………( 2 )

　　式中 :

　　Ir — 基于比生长率的抑制率 , % ;

　　μC — 对照组各平行比生长率的平均值 ;

　　μT — 受试组各平行的比生长率的平均值 。

　　c) 生长量 ,是测试结束时与测试开始时生物量之差 。对于对照组和各受试组 ,计算各平行的生长量的平均值和方差估算值 。

　　d) 基于生长量的抑制率 , 见式(3) 。

　　Iy …………………………( 3 )

　　式中 :

　　Iy — 基于生长量的抑制率 , % ;

　　YC — 对照组各平行生长量的平均值 ;

　　YT — 受试组各平行的生长量的平均值 。

　　e) 计算基于比生长率的抑制率或基于生长量的抑制率时 ,如果试验添加了溶剂 ,应选择溶剂对照组进行计算 。

　　10. 1.4 绘制浓度-效应曲线

　　以受试物浓度的对数值为横坐标 , 比生长率的抑制率或生长量的抑制率为纵坐标 ,作回归曲线 , 即为浓度-效应曲线 。绘制曲线时忽略上一阶段定为异常值的数据 。

　　采用直线内插法或者计算机统计软件得出 EC50 和 EC10 (和/或 EC20 ) 等关键数据 。但该方法有时可能不适用 :

　　a) 计算机统计软件不适用于所有数据 ,专家评审有利于得到更可靠的结果 ,这种情况下 ,一些计算机软件可能无法给出可靠的解决方案(迭代可能不收敛等) ;

　　b) 一般的计算机统计软件不适于处理生长刺激效应的数据 。

　　10. 1.5 统计分析

　　通过回归分析获 得 定 量 的 浓 度-效 应 关 系 。 对 数 据 进 行 线 性 变 换 后 , 例 如 转 换 为 probit、logit或

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　　Weibull单位 ,可进行加权线性回归 ,但非线性回归能更好地处理不规则和偏离曲线但又不能忽略不计的数据的首选方法 。但当效应近于零抑制或完全抑制时 ,数据转换可能会放大不规范性以致干扰分析 。

　　使用 probit、logit或 Weibull变换的标准分析方法旨在用于二元(如死亡率或存活率)数据 ,应进行修改以适应生长或生物量数据 。 附录 D 中进一步详细说明了非线性回归分析的应用 。

　　统计分析各响应变量 ,通过浓度-效应关系得到 ECx 值及其 95%置信区间(如有可能) 。效应数据与回归模型的拟合优度宜采用图表或统计分析的方式进行评估 。 回归分析应使用单个平行的效应数据而非受试组均值 。但如果由于数据过于分散 ,难以或无法进行非线性曲线拟合 ,则通过各平行的均值进行回归 ,这样可减少可疑异常值的影响 。如果这样处理 ,在报告中应将偏离常规程序的做法进行说明 。

　　如果所得数据无法通过可利用的回归模型/方法求出 EC50及其 95%置信区间 ,可采用直线内插法 。 通过单因素方差分析(ANOVA) , 比较各处理组受试物对藻类生长影响的平均值 ,得出 LOEC 和NOEC。应采用适当的多重比较方法 , 比较各处理组的平均值和对照组的平均值是否存在显著性差异 。

　　建议采用邓恩特(Dunnett)法或威廉(Wiliams) 法进行多重比较 。应评估 ANOVA 中变量具有齐次性的假设是否成立 。可通过作图或试验进行评估建议采用列文(levene)法或巴特利特(Bartlett)法检验变量是否具有齐次性 ,如果结果是否定的 ,则应通过对数转换进行校正 。如果非齐次性异常显著 ,难以通过数据转换来校正 ,建议采用递减的 Jonkheere趋势检验进行分析 。

　　随着科学研究的发展 ,NOEC 的概念逐步被 ECx 替代 。在藻类试验中 ,ECx 中 x 的最佳取值尚无定论 。根据响应变量的不同 ,x 取值在 10% ~ 20%范围较为适宜 ,宜同时给出 EC10和 EC20 。

　　10. 1.6 生长刺激

　　试验有可能观察到低浓度生长刺激效应(负抑制率) 。产生此效应的原因可能是毒物兴奋效应(毒物刺激效应)或受试物中刺激生长的因子加入至最少量的培养基中所致 。注意 ,加入无机营养盐并不会产生直接的影响 , 因为试验期间培养基中的营养成分是保持过剩状态的 。计算 EC50 时 ,如果观察到明显的刺激效应或需要求解的 ECx 中 x 值较低 ,宜采用毒物兴奋效应模型 。否则可忽略不计 。计算时尽可能避免从原始数据中删除刺激效应的部分 。如果所使用的统计软件不容许刺激效应(次要地位)的出现 ,则采用直线内插法 。

　　10. 1.7 非受试物毒性引起的藻类生长抑制

　　由于遮挡会减少有效光照 ,对于具有光吸收性的受试物来说 ,生长抑制现象加剧 。应通过修改试验条件和试验方法等来区分物理效应与毒性效应对藻类生长的影响 ,并在试验报告中做出单独说明 。

　　10.2 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物 :

　　1) 物理属性和相关理化性质 ,包括水中溶解度 ;

　　2) 化学特性(如 CAS号) ,包括纯度 。

　　b) 受试生物 :藻类的种类 、来源或提供者 , 以及培养条件 。

　　c) 试验条件 :

　　1) 试验开始日期和持续时间 ;

　　2) 试验设计 :试验容器 、培养体积和试验开始时的生物量密度 ;

　　3) 培养基的成分 ;

　　4) 试验浓度和平行(如平行数 、试验浓度数及其公比) ;

　　5) 试验溶液的配制 ,包括溶剂的使用 ;

　　6) 培养设备 ;

　　9

　　GB/T 21805—2025

　　7) 光照强度和光质(来源 ,是否均匀) ;

　　8) 温度 ;

　　9) 浓度测量 :设定浓度和所有实测浓度 , 阐明添加回收试验的方法和仪器的最低检测限 ;

　　10) 对本文件的所有偏离 ;

　　11) 生物量的测量方法 , 以及所测参数和干重的关系 。

　　d) 试验结果 :

　　1) 试验开始和结束时各受试组的 pH;

　　2) 生物量的测量方法 , 以及各测量时间各试验容器中的生物量 ;

　　3) 生长曲线(生物量-时间) ;

　　4) 计算出的各平行的各参数值 ,及其平均值和变异系数 ;

　　5) 浓度-效应曲线 ;

　　6) 评估受试物对藻类的毒性 ,如 EC50、EC10、EC20及其置信区间 ,LOEC和 NOEC及其统计方法(可选) ;

　　7) 如果采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计 ,说明最小显著差数 ;

　　8) 各受试组中任何对藻类生长有刺激效应的结果 ;

　　9) 观察到的其他效应 ,如藻类在形态学上的改变 ;

　　10) 结果讨论 ,包括对偏离的解释说明 。

　　10

　　GB/T 21805—2025

　　附 录 A (资料性)试验藻种

　　A. 1 生物品系

　　A. 1. 1 绿藻

　　近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata,曾用名 :羊角月芽藻/Pseudokirchneriella subcapitata) 。

　　近具棘链带藻(Desmodesmussubspicatus,曾用名 :栅藻/Scenedesmussubspicatus) 。

　　普通小球藻(Chlorella vulgaris) 。

　　A. 1.2 硅藻

　　舟形藻(Navicula pelliculosa) 。

　　A. 1.3 蓝藻

　　水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae) 。

　　聚球藻(Synechococcusleopoliensis) 。

　　A.2 外观和特征

　　试验藻种的外观和特征见表 A. 1。

　　表 A. 1 试验藻种的外观和特征

　　项 目

　　近头状尖胞藻 (Raphidocelis

　　subcapitata)

　　近具棘链带藻 (Desmodesmus

　　subspicatus)

　　舟形藻

　　(Navicula

　　pelliculosa)

　　水华鱼腥藻(Anabaena

　　flos-aquae)

　　聚球藻

　　(Synechococcus

　　leopoliensis)

　　外观

　　新月形或链形 ,单个细胞

　　椭圆形 ,

　　单个细胞

　　杆状细胞

　　椭圆形 ,

　　链状细胞

　　杆状细胞

　　大小(宽 ×长)/(μm×μm)

　　(2~ 3) ×

　　(8~ 14)

　　(3~ 12) × (7~ 15)

　　3. 7× 7. 1

　　3× 4. 5

　　1× 6

　　细胞体积/(μm3 /个)

　　40~ 60a

　　60~ 80a

　　40~ 50a

　　30~ 40a

　　2. 5b

　　细胞干重/(mg/个)

　　(2~ 3) × 10-8

　　(3~ 4) × 10-8

　　(3~ 4) × 10-8

　　(1~ 2) × 10-8

　　(2~ 3) × 10- 9

　　生长率 c/d- 1

　　1. 5~ 1. 7

　　1. 2~ 1. 5

　　1. 4

　　1. 1~ 1. 4

　　2. 0~ 2. 4

　　a 用电子颗粒计数仪测量的结果 。

　　b 用细胞大小计算的结果 。

　　c 培养条件为 OECD藻类生长培养基 ,光照强度为 70 μE · m- 2 · s- 1 ,温度为 21 ℃ 。

　　A.3 试验藻种的培养与测量

　　A.3. 1 近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)和近具棘链带藻(Desmodesmussubspicatus)

　　多种培养基适用于这两种绿藻 。合适的培养基类型可由提供单位获取 。单个细胞 , 细胞密度的测

　　11

　　GB/T 21805—2025

　　量比较简单 ,可用电子颗粒计数仪或显微镜 。

　　A.3.2 水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae)

　　多种培养基适用于此藻 。需留意 ,在藻类进入生长停滞期前转接 ,否则难以恢复 。

　　水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae)会生长成链状细胞的集合体 。根据培养条件的不同 ,形成的集合体大小形状也不同 。进行显微镜下细胞计数或电子颗粒计数仪计数时破坏该集合体 。

　　为了减小计数差异 ,取样并进行超声波处理以破坏细胞的链状结构 。经超声波处理后 ,链状细胞链长变短 ,但是超声时间过长会破坏细胞 。各受试组统一超声的强度和时间 。

　　计数足够的视野数(血球计数板 ,至少 400个小格)有利于补偿计数差异 。这可改善显微镜下测量密度的可靠性 。

　　可使用电子颗粒计数仪测量经超声断链处理的总细胞体积 。

　　将藻种接种至试验容器中时 ,采用搅拌或其他类似方法使接种物悬浮 。

　　持续振荡(150 r/min)或定时剧烈摇动试验容器 , 以防鱼腥藻聚团 。 如果已形成团状物 ,在取样进行测量时剧烈摇动 , 以破坏藻团并使藻细胞均匀分布 。

　　A.3.3 聚球藻(Synechococcusleopoliensis)

　　多种培养基适用于此藻 。合适的培养基类型可由提供单位获取 。

　　单个杆状细胞 。细胞非常小 ,用显微镜计数很复杂也很困难 。使用电子颗粒计数仪时 ,粒径范围调至 1 μm。也可使用体外荧光计进行测量 。

　　A.3.4 舟形藻(Navicula pelliculosa)

　　多种培养基适用于此藻 。合适的培养基类型可由提供单位获取 。注意培养基中硅酸盐的量 。

　　在某些生长条件下会形成团状物 。该藻类细胞有时能够产生脂类 , 因此在液面可能积聚成膜 。基于以上原因 ,为了获得具有代表性的样品 ,在取样测量时需采用某些特殊的方法 。例如使用漩涡搅拌器剧烈搅动 。

　　12

　　GB/T 21805—2025

　　附 录 B (资料性)培养基

　　B. 1 OECD 藻类生长培养基

　　OECD藻类生长培养基同 ISO 8692中所述培养基 ,配制方法见表 B. 1。

　　表 B. 1 OECD 藻类生长培养基

　　营养盐

　　储备液中的质量浓度

　　取用体积

　　最终定容体积

　　储备液 1:常量营养盐

　　1 000 mL

　　NH4Cl

　　MgCl2 · 6H2 O

　　CaCl2 · 2H2 O

　　MgSO4 · 7H2 O

　　KH2PO4

　　1. 5 g/L

　　1. 2 g/L

　　1. 8 g/L

　　1. 5 g/L

　　0. 16g/L

　　10 mL

　　储备液 2:Fe-EDTA

　　FeCl3 · 6H2 O

　　Na2 EDTA · 2H2 O

　　64 mg/L

　　100 mg/L

　　1 mL

　　储备液 3:微量元素

　　H3BO3

　　MnCl2 · 4H2 O

　　ZnCl2

　　CoCl2 · 6H2 O

　　CuCl2 · 2H2 O

　　Na2 MoO4 · 2H2 O

　　185 mg/L

　　415 mg/L

　　3 mg/L

　　1. 5 mg/L

　　0. 01 mg/L

　　7 mg/L

　　1 mL

　　储备液 4:NaHCO3

　　NaHCO3

　　Na2 SiO3 · 9H2 O

　　50 g/L

　　1 mL

　　将配制好的储备液经 0. 2 μm 滤膜过滤或高压灭菌(120 ℃ ,15 min) ,4 ℃避光冷藏保存 。储备液 2和储备液 4 只能通过滤膜过滤灭菌 。

　　B.2 AAP藻类生长培养基

　　AAP藻类生长培养基同美国材料实验协会(ASTM)中所述培养基 ,配制方法见表 B. 2。

　　表 B.2 APP藻类生长培养基

　　营养盐

　　称药量

　　定容体积

　　取用体积

　　最终定容体积

　　储备液 1:常量营养盐

　　500 mL

　　1 mL

　　1 000 mL

　　NaNO3

　　MgCl2 · 6H2 O

　　CaCl2 · 2H2 O

　　12. 750 g

　　6. 082 g

　　2. 205 g

　　13

　　GB/T 21805—2025

　　表 B.2 APP藻类生长培养基 (续)

　　营养盐

　　称药量

　　定容体积

　　取用体积

　　最终定容体积

　　储备液 2:微量营养盐

　　500 mL

　　1 mL

　　1 000 mL

　　H3BO3

　　MnCl2 · 4H2 O

　　ZnCl2

　　FeCl3 · 6H2 O

　　CoCl2 · 6H2 O

　　Na2 MoO4 · 2H2 O

　　CuCl2 · 2H2 O

　　Na2 EDTA · 2H2 O

　　Na2 SeO4 · 5H2 O

　　92. 760 mg

　　207. 690 mg

　　1. 635 mg

　　79. 880 mg

　　0. 714 mg

　　3. 630 mg

　　0. 006 mg

　　150. 000 mg

　　0. 005 mgb

　　储备液 3:MgSO4 · 7H2 O

　　500 mL

　　1 mL

　　MgSO4 · 7H2 O

　　7. 350 g

　　储备液 4:K2 HPO4

　　500 mL

　　1 mL

　　K2 HPO4

　　0. 522 g

　　储备液 5:NaHCO3

　　500 mL

　　1 mL

　　NaHCO3

　　7. 500 g

　　储备液 6:Na2 SiO3 · 9H2 O

　　—

　　—

　　Na2 SiO3 · 9H2 O

　　a

　　a 只有硅藻试验需要 。可直接加入(202. 4 mg)或制备储备液 ,只要保证最终浓度为 20 mg/L(以 Si计)即可 。 b 只有硅藻的储备培养时需要 。

　　定容用水为去离子水或蒸馏水 。

　　使用 0. 1 mol/L或 1. 0 mol/L的 NaOH 或 HCl调节培养基的 pH 至 7. 5±0. 1。

　　将配制好的培养基经 0. 22 μm 滤膜(使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时)或 0. 45 μm 滤膜(不使用电子颗粒计数仪进行细胞计数时)过滤灭菌 ,4 ℃避光冷藏保存直至用于实验 。

　　B.3 OECD 藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基中各成分的比较

　　OECD藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基各成分的比较如表 B. 3所示 。

　　表 B.3 OECD 藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基各成分的比较

　　成分

　　OECD

　　AAP

　　mg/L

　　mM

　　mg/L

　　mM

　　NaHCO3

　　50. 0

　　0. 595

　　15. 0

　　0. 179

　　NaNO3

　　25. 5

　　0. 300

　　NH4Cl

　　15. 0

　　0. 280

　　MgCl2 · 6H2 O

　　12. 0

　　0. 059 0

　　12. 16

　　0. 059 8

　　CaCl2 · 2H2 O

　　18. 0

　　0. 122

　　4. 41

　　0. 030 0

　　MgSO4 · 7H2 O

　　15. 0

　　0. 060 9

　　14. 6

　　0. 059 2

　　14

　　GB/T 21805—2025

　　表 B.3 OECD 藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基各成分的比较 (续)

　　成分

　　OECD

　　AAP

　　K2 HPO4

　　1. 044

　　0. 005 99

　　KH2PO4

　　1. 60 0. 009 19

　　FeCl3 · 6H2 O

　　0. 0640 0. 000 237

　　0. 160

　　0. 000 591

　　Na2 EDTA · 2H2 O

　　0. 100 0. 000 269

　　0. 300

　　0. 000 806

　　H3BO3

　　0. 185 0. 002 99

　　0. 186

　　0. 003 00

　　MnCl2 · 4H2 O

　　0. 415 0. 002 10

　　0. 415

　　0. 00201

　　ZnCl2

　　0. 003 00 0. 000 022 0

　　0. 003 27

　　0. 000 024

　　CoCl2 · 6H2 O

　　0. 001 50 0. 000 006 30

　　0. 00143

　　0. 000 006

　　Na2 MoO4 · 2H2 O

　　0. 00700 0. 000 028 9

　　0. 007 26

　　0. 000 030

　　CuCl2 · 2H2 O

　　0. 000 01 0. 000 000 06

　　0. 000 012

　　0. 000 000 07

　　pH

　　8. 1

　　7. 5

　　乙二胺四乙酸(EDTA)与铁的摩尔比略高于 1。这样可避免离子沉淀 , 同时使重金属离子的螯合作用最小化 。

　　在使用舟形藻(Navicula pelliculosa)作为受试生物时 ,两种培养基中都需补充 Na2SiO3 · 9H2 O,使其浓度达到 1. 4 mg/L(以 Si计) 。

　　培养基的 pH 是培养基的碳酸盐体系和空气中 CO2 的分压之间平衡的结果 。 25 ℃时的 pH 与碳酸氢盐的物质的量浓度之间的近似关系见式(B. 1) 。

　　式中 : pHeq = 11. 30+lg[HCO3 ] …………………………( B. 1 )

　　pHeq — 培养基 pH;

　　[HCO3 ] — 碳酸氢盐的物质的量浓度 。

　　NaHCO3 浓度为 15 mg/L时 ,AAP藻类生长培养基 pHeq为 7. 5。NaHCO3 质量浓度为 50 mg/L时 ,OECD藻类生长培养基 pHeq为 8. 1。

　　B.4 OECD 藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基中各元素的比较

　　OECD藻类生长培养基和 AAP藻类生长培养基的元素组成如表 B. 4所示 。

　　表 B.4 OECD和 AAP培养基中各元素的比较

　　元素

　　培养基中各元素质量浓度/(mg/L)

　　OECD

　　AAP

　　C

　　7. 148

　　2. 144

　　N

　　3. 927

　　4. 202

　　P

　　0. 285

　　0. 186

　　K

　　0. 459

　　0. 469

　　Na

　　13. 704

　　11. 044

　　Ca

　　4. 905

　　1. 202

　　Mg

　　2. 913

　　2. 909

　　Fe

　　0. 017

　　0. 033

　　Mn

　　0. 115

　　0. 115

　　15

　　GB/T 21805—2025

　　附 录 C

　　(资料性)

　　藻类培养过程示例

　　C. 1 一般建议

　　根据以下程序培养藻类的目的是培养毒性试验所用的藻类 。

　　采用防止藻类受细菌污染的方法 。可无菌培养 , 同时建立和使用单藻培养 。

　　所有操作在无菌条件下进行 ,避免受到细菌和其他藻类污染 。

　　C.2 设备和材料

　　见 7. 1。

　　C.3 培养程序

　　C.3. 1 准备

　　培养基中所有营养盐都以浓缩储备液形式避光冷藏保存 。这些溶液通过过滤或高压灭菌消毒 。

　　配制培养基时 ,将相应量的储备液加到无菌的蒸馏水中 。 注意不要发生污染 。对于固体培养基加0. 8%的琼脂即可 。

　　C.3.2 储备培养

　　储备培养是定期将藻类转接到新鲜培养基中作为初始测试材料的小型藻类培养 。如果藻类不经常使用 ,可在试管内固体培养基斜面上保存 ,至少两个月转接一次 。

　　用三角瓶进行储备培养时要控制培养基的量(如体积为 100mL) ,若在温度为 20 ℃ 、连续光照的培养箱中培养 ,要一个星期转接一次 。

　　在大量转接时要用无菌吸管转接到有新鲜培养基三角瓶内 。这样 ,对于生长快速的品种 ,其初始浓度比原培养物低 100倍 。

　　可从生长曲线确定藻类的生长速率 。若生长率已知 ,可估计转接到新鲜培养基的密度 。 培养物在到达衰亡期之前转接到新鲜培养基中 。

　　C.3.3 预培养

　　预培养旨在为试验提供一定量的适合接种测试的藻类培养物 。预培养在与试验要求相同的条件下进行 。通常培养 2 d~4 d后藻类仍处于指数生长阶段即可用于试验接种 。镜检发现藻类预培养物被污染或生长异常(如畸形等) ,则废弃处理 。

　　16

　　GB/T 21805—2025

　　附 录 D

　　(资料性)

　　非线性回归数据分析

　　D. 1 总体思路

　　藻类试验和其他微生物生长试验中 , 响应变量即生物量的生长 ,本质上是一个连续的测量变量 。如果采用生长率 ,则是过程速率 ;如果采用生物量 ,则为随时间变化的积分 。两者都需要通过重复设置的未暴露对照组的响应均值进行标准化 ,反映了所施加条件(光照和温度是藻类试验的主要影响因素) 下的最大反应值 。试验系统是连续分布的或同质的 ,生物量可被视为一个连续体 ,无需考虑单个细胞 。此类系统中 , 响应方差分布仅与试验因素有关(通常用误差的对数正态分布或正态分布描述) 。 与通常以分数表示的生物测定响应变量相反 ,生物个体的耐受度(通常为二项分布)通常被认为是主要的方差组成 。对照响应在这里为零或者背景值 。

　　在不复杂的情况下 ,归一化的或相对的响应值 r,将从 1(零抑制) 单调下降到 0(完全抑制) 。所有响应值都有一个误差相伴 , 明显的负抑制是计算的随机误差结果 。

　　D.2 回归分析

　　D.2. 1 模型

　　区间(量描)述(回)。是。的可-=1在,50、C(的)1描0及(中)-关(5)lo)

　　logistic方程 、非对称 Weibul方程和对数正态分布函数 ,这些函数都是 S形曲线 , 当 C趋近于 0 时 ,渐进趋近于 0, 当 C趋近于无穷时趋近于 1。连续阈值的函数模型或可作为渐进模型的新兴替代方法 。该模型假设 ,浓度低于某阈值 EC0 + 时没有效应 ,EC0 + 通过浓度效应关系外推 ,并使用一个在起点处不可微的简单连续函数与浓度轴相交来估算 。

　　如果要补偿方差的异质性 ,则可用残差平方和(固定方差假设)或加权平方和的简单最小化来进行处理 。

　　D.2.2 程序

　　得尽可能多的信息(统计过程可概)括,使用单(如下):个培养瓶的测量值(选择适当的函数方)要(程),优(Y)使(f)(用(C))重,复(用)测(非)量(线)的(性)均(回)值(归拟)。但另(合数)据一。如(从)果(数)方(据)差(中)较(获)

　　大 ,实践经验表明 ,与使用单个的数据点相比 ,使用重复测量的均值可提供更稳健的数学估计 ,系统误差的影响更小 。

　　绘制拟合曲线和测量数据 ,并检验曲线拟合的适宜性 。残差分析是拟合效果检查中特别有用的工具 。如果所选的浓度效应拟合函数无法良好地描述整条曲线或者曲线中关键区段 ,例如低浓度下响应 ,可选择另外的曲线来拟合 ,例如采用类似 Weibul函数的非对称曲线来代替对称曲线 ,或当对数正态分布函数出现负抑制时改用其他回归函数 。不建议对负抑制赋值为 0 或一个小正值 , 因为这样会扭曲误差分布 。合适的做法是对曲线分段(如低抑制部分)拟合 , 以估计 EClow x 值 。根据拟合方程[通过 “逆估

　　表明(计”C),- 据1(点(Y))充]足 且 无(计算 EC)x低浓度刺(的几个特)激(征)干(点)扰时(估计)值,藻, 类试验(至少要)精(报)度(告)通(EC)常50可(和)支 持(一两个)10(E)%(C)lo抑制水平(wx的估计)的(值)。合理 估 算(实践经验)。

　　EC20 的估计精度显著优于 EC10, 因为前者通常位于浓度反应曲线中部近似线性的部分 。 由于低浓度生

　　17

　　GB/T 21805—2025

　　长刺激 ,EC10有时难以解释 。 因此 ,尽管 EC10通常足够准确 ,但建议同时报告 EC20。

　　D.2.3 加权因子

　　试验方差通常不是恒定的 ,且一般包含一个比例量 ,因此加权回归往往更有优势 。此类分析中 ,通常假设加权因子与方差成反比 ,见式(D.1)。

　　Wi …………………………( D.1 )

　　式中 :

　　Wi — 加权因子 ;

　　Var(ri) — 试验方差 。

　　多数回归程序支持选择加权回归分析 ,并将加权因子列于表中 。方便起见 ,一般通过将加权因子乘以 nwi(n为数据点的总个数)实现归一化处理 。

　　D.2.4 归一化响应

　　通过对照组响应均值进行归一化会产生一些原理问题 ,并产生相当复杂的方差结构 。将反应值除以对照组响应均值计算抑制率 ,会引入由对照组均值误差引起的一个额外误差 。 除非这个误差小到可忽略不计 ,否则需要根据与对照组的协方差校正回归分析的加权因子和置信限 。需要注意的是 ,为了最小化相对响应的总方差 ,高精度估计对照组响应均值是非常重要 。该方差见式(D.2)。

　　Yi I=f …………………………( D.2 )

　　式中 :

　　Yi — 相对响应 ;

　　i — 浓度水平 i;

　　0 — 对照组 。

　　值 Y(1/r)0i方,的(i0(差(Y))对r)i于。/(布(∂Y)数i/据(∂r)且i)2有·m(V)ia与(r)(复(Y)i时(/∂)r,a(2)rrr=(rσ(0)/,i中,那(么(∂Y)相i/对(∂r)

　　Var

　　式中 :

　　Var(Yi) — 相对响应值 Yi的总方差 ;

　　σ2 — 试验系统固有方差 ;

　　r0 — 对照组均值 ;

　　mi — 受试组样本量 ;

　　ri — 受试组响应值 ;

　　m0 — 对照组样本量 。

　　对照组均值的误差与对照组重复次数平均值的平方根成反比 ,有时将历史数据纳入是合理的 ,通过这种方式能大幅降低误差 。另一种做法是对数据不做归一化处理 ,而是直接拟合包括对照组数据在内的绝对响应值 ,即引入对照响应值 ,作为非线性回归函数进行拟合的附加参数 。与常用的二参数回归方程不同 ,该方法拟合 3个参数 ,因此 ,相较于用预设对照响应值对数据进行归一化处理后再开展非线性回归分析 ,此方法所需的数据点数量更多 。

　　D.2.5 逆置信区间

　　通过逆估计计算非线性回归置信区间较为复杂 ,因此不是常规统计计算机程序包中现成的标准可

　　18

　　GB/T 21805—2025

　　选方法 。借助重新参数 化 的 标 准 非 线 性 回 归 程 序 可 得 到 近 似 的 置 信 限(示 例 见 Bruce and Versteeg,

　　f(α,β,浓度) 。

　　浓度(1992))) ,,定义 f(但需要)(,β(目),EC(标点)10估)1(值)以(改)及(写)f(数)学(α方,β程,EC,例50,05(把),以(EC)一10个等(和 E)价(C)50函(作)数(为)g(待)(EC(估参)10数,EC。50(,c(函)octr(I)ion(f)(),代(β),

　　更直接的计算方法是保留原始方程并使用 ri 和 r0 均值附近的 Taylor 展开实现 。近来“Bootstrap”法应用广泛 ,该方法使用测量数据和由随机数生成器控制的频繁重抽样来估算经验方差分布 。

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　　GB/T 21805—2025

　　参 考 文 献

　　[1] OECD: OECD GuidelinesforTesting OfChemicals201,AlgaGrowthInhibition Test.Paris: OECD & OCED,Adopted 27July,2011.

　　[2] ISO 8692 Waterquality-Fresh wateralgalgrowthinhibition testwith unicellulargreen al- gae,Adopted 15February,2012.

　　[3] ASTM E1415 Standard Guide for Conducting Static Toxicity Tests With Lemna gibba G3,Approved Dec. 1,2012.

　　[4] Kooijman,S. A. L. M.; Hanstveit,A. O.;Nyholm ,N. (1996) :No-effect concentrationsin algal growth inhibition tests.WaterResearch. 30,1625-1632.

　　[5] Andersen, J. S. , Holst, H. , Spliid, H. , Andersen, H. , Baun, A. & Nyholm , N. ( 1998) : Continuous ecotoxicologicaldata evaluated relativeto a controlresponse.JournalofAgricultural,Bi- ologicaland EnvironmentalStatistics,3,405-420.

　　[6] Bruce,R. D. and Versteeg, ,D.J. (1992) A StatisticalProcedureforModellingContinuousEc- otoxicityData.Environ.Toxicol.Chem. 11,1485-1494.

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