GB/T 21786-2025 化学品 细菌回复突变试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21786—2025代替 GB/T21786—2008

　　化学品 细菌回复突变试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofbacterialreversemutation

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21786—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21786—2008《化 学 品 细 菌 回 复 突 变 试 验 方 法》, 与 GB/T 21786—2008 相

　　比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 更改了“细菌 ”的内容(见 5. 1. 1. 4,2008年版的 4. 1. 1. 4) ;

　　b) 更改了“染毒剂量 ”的内容(见 5. 2. 2. 1,2008年版的 4. 2. 2. 1) ;

　　c) 更改了“对照 ”的内容(见 5. 2. 3. 3,2008年版的 4. 2. 3. 3) ;

　　d) 更改了“试验步骤 ”的内容(见 5. 3. 1、5. 3. 2,2008年版的 4. 3. 1. 1、4. 3. 1. 2) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 、平顶山市慧鑫源生物科技有限公司 。

　　本文件主要起草人 :沈美丽 、戴宇飞 、段化伟 、陈圆圆 、邓富昌 、石莹 、张少平 、刘帅 、石东东 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21786—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21786—2025

　　引 言

　　细菌回复突变试验是利用营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 和大肠杆菌(Escherichia coli)菌株来检测基因突变 ,突变涉及 DNA 的一个或多个碱基对的置换 、插入或缺失 。本试验的原理是检测受试物导致试验菌株因回复突变进而恢复合成必需氨基酸的能力 。发生回复突变的细菌能在缺乏特定必需氨基酸的条件下生长 ,而亲代菌株则不能生长 ,故可根据菌落形成数量 ,判断受试物是否为致突变物 。

　　基因突变是导致众多遗传性疾病的关键因素 ,且有充分证据表明 ,体细胞癌基因和抑癌基因的突变与人类和实验动物的肿瘤形成有关 。细菌回复突变试验具有快速 、经济和操作相对简便等优点 。试验菌株还具有某些特征 ,使其对突变检测更加敏感 ,例如回复突变位点存在响应性 DNA 序列 , 细菌对大分子物质的通透性增强 , 以及 DNA修复系统缺陷或 DNA易错修复过程增强 。试验菌株的特异性可为遗传毒物诱发的突变类型提供有价值的研究信息 。现已构建了包含多种化学结构物质的细菌回复突变试验结果的数据库 , 可 从 中 获 取 相 关 资 料 。 同 时 , 还 为 不 同 理 化 性 质 的 化 学 品 建 立 了 完 善 的 测 试 方法 ,包括挥发性化合物 。

　　细菌回复突变试验采用的是原核细胞 ,其在吸收 、代谢 、染色体结构和 DNA 修复过程等方面与哺乳动物细胞存在显著差异 。本试验属于体外试验 ,可加入外源性代谢活化系统 ,但外源性代谢活化系统不能完全模拟体内代谢条件 。 因此 ,本试验结果不能为受试物对哺乳动物的致突变和致癌能力提供直接证据 。

　　细菌回复突变试验可用于遗传毒性的初步筛选 ,尤其适用于检测受试物诱发的点突变 。 大量研究数据表明 ,许多在本试验中呈阳性的化学品在其他试验中也显示出致突变性 ,但也有一些致突变剂在本试验中未能检出 。这种局限性可能与检测终点的特殊性质 、代谢活化的差异或生物利用度的差异有关 。另外 ,提高本试验灵敏度的因素可能会高估受试物的致突变活性 。

　　细菌回复突变试验不适用于评估某些类别的化学品 ,例如具有较强杀菌作用的化合物(如某些抗生素)和特异性干扰哺乳动物细胞复制系统的化合物(如某些拓扑异构酶抑制剂和某些核苷类似物) 。对这些受试物 ,哺乳动物细胞致突变试验可能更适用 。

　　虽然许多在本试验中呈阳性的化合物都是哺乳动物的致癌物 ,但其相关性并不是绝对的 ,而是与化学品的类别有关 。有一些致癌物通过非遗传毒性机制或试验菌株缺乏的机制诱发癌症 ,所以不能在本试验中检出 。

　　Ⅱ

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　　化学品 细菌回复突变试验方法

　　1 范围

　　本文件给出了细菌回复突变试验方法的试验基本原则 ,规定了试验方法 、试验数据和报告 。

　　本文件适用于检测化学品(有杀菌作用的除外)的致突变性 。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件 。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　回复突变试验 reversemutation test

　　以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物 ,进行基因突变检测的体外试验 。

　　注 : 常用的菌株有组氨酸营养 缺 陷 型 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌(Salmonella typhimurium) 和 色 氨 酸 营 养 缺 陷 型 大 肠 杆 菌(Escherichia coli) 。

　　4 试验基本原则

　　4. 1 细菌悬液 分 别 在 加 入 和 不 加 入 外 源 性 代 谢 活 化 系 统 的 条 件 下 , 与 受 试 物 混 匀 。 在 平 板 掺 入 法中 ,将上述混合物与顶层琼脂充分混匀 ,再迅速倾入底层琼脂平板上 。在预培养法中 ,先将细菌悬液与受试物混合进行预培养 ,然后与顶层琼脂充分混匀 ,再迅速倾入底层琼脂平板上 。上述平板培养 2 d~3 d后 ,计数回变菌落数 ,并与溶剂对照组的自发回变菌落数进行比较 。

　　4.2 细菌回复突变试验有多种操作方法 ,其中最常用的是平板掺入法 、预培养法 、波动 法 和 悬 浮 培 养法 。此外 ,还有用于检测气体或蒸气的改良方法 。

　　4.3 本文件所描述的主要是平板掺入法和预培养法 。 这两种方法在加入和不加入代谢活化系统的条件下都能进行 。有些化学品宜使用预培养法 ,包括短链脂肪族亚硝胺 、二价金属 、醛类 、偶氮染料和重氮化合物 、吡咯里西啶生物碱 、烯丙基化合物以及硝基化合物 。某些类别的化学品用标准方法(例如平板掺入法和预培养法)有时不能检出阳性结果 。对这些特殊样品应采用替代方法进行检测 。对偶氮染料和重氮化合物 、气体和挥发性化学品以及糖苷类等特殊样品的检测 , 已有文献报道过替代方法 。对标准方法的偏离应有科学依据 。

　　5 试验方法

　　5. 1 试验准备

　　5. 1. 1 细菌

　　5. 1. 1. 1 新鲜菌悬液应培养至对数生长期晚期或稳定期早期(浓度约为每毫升 109 个) ,不应使用稳定

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　　期晚期的菌悬液 。试验采用的菌悬液应含有较高浓度的活细菌 。活菌浓度可通过细菌生长曲线的历史对照数据确定 ,或每次试验时通过平板计数法测定 。

　　5. 1. 1.2 宜采用的培养温度为 37 ℃ 。

　　5. 1. 1.3 至少应使用 5 种菌株 。宜使用的菌株组合方案如下 :

　　a) 鼠伤寒沙门氏菌 TA1535;

　　b) 鼠伤寒沙门氏菌 TA1537或 TA97或 TA97a;

　　c) 鼠伤寒沙门氏菌 TA98;

　　d) 鼠伤寒沙门氏菌 TA100;

　　e) 大肠杆菌 WP2 uvrA或大肠杆菌 WP2 uvrA(pKM101)或鼠伤寒沙门氏菌 TA102。

　　注 : 所使用的鼠伤寒沙门氏菌(TA1535;TA1537或 TA97或 TA97a;TA98和 TA100)在不同实验室间的检测结果可靠且具有重现性 。这些菌株在回复突变位点含有 GC碱基对 , 已知其可能无法检测某些氧化性诱变剂 、交联剂和肼类化合物 。此类物质能通过大肠杆菌 WP2系列或鼠伤寒沙门氏菌 TA102进行检 测 ,这 些 菌 株 在 回 复突变位点含有 AT碱基对 。检测交联剂时 ,能采用鼠伤寒沙门氏菌 TA102,或使用 DNA修复功能完整的大肠杆菌 ,例如大肠杆菌 WP2或大肠杆菌 WP2(pKM101) 。

　　5. 1. 1.4 应按照已建立的标准操作规程 ,对菌种进行培养 、鉴定和保存 。每次复苏冻存菌种的培养制品时 ,应进行氨基酸需求试验 。此外 ,还应进行其他鉴定 ,包括是否存在 R 因子和特征性突变 。试验菌株会产生自发回变 ,通过平 板 计 数 获 得 的 自 发 回 变 数 应 在 实 验 室 历 史 对 照 数 据 范 围 内 或 文 献 报 道 的 范围内 。

　　注 : 氨基酸需求试验 , 即 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 需 要 组 氨 酸 , 大 肠 杆 菌 需 要 色 氨 酸 。 R 因 子 鉴 定 , 例 如 TA97、TA97a、 TA98、TA100和 WP2 uvrA(pKM101)菌株对氨苄青霉素的抗性 , 以及 TA102菌 株 对 氨 苄 青 霉 素 和 四 环 素 的抗性 。特征性突变 ,例如鼠伤寒沙门氏菌的 rfa突变使 其 对 结 晶 紫 敏 感 , 大 肠 杆 菌 的 uvrA 突 变 或 鼠 伤 寒 沙 门氏菌的 uvrB突变使其对紫外线敏感 。

　　5. 1.2 培养基

　　应用适宜的底层琼脂培养基(例如含 Vogel-Bonner培养基 E 和葡萄糖)和含有组氨酸与生物素(或色氨酸)的顶层琼脂 , 以供细菌完成少量细胞分裂 。

　　5. 1.3 代谢活化

　　应在有和无适量代谢活化系统的两种条件下对受试物进行检测 。应根据受试物的类别选择代谢活化系统及其应用条件 。最常用的代谢活化系统是 S9。S9是由多氯联苯(Aroclor 1254) 诱导或苯巴比妥和 β-萘黄酮联合诱导的啮齿类动物肝脏制备而成 。常用的 S9混合物中 S9的浓度范围是 5% ~ 30% (体积分数) 。若适用 ,可使用一种以上浓度的 S9。对于偶氮染料和重氮化合物 ,应采用还原性代谢活化系统 。

　　5. 1.4 受试物准备

　　试验前 , 固体受试物应溶解或混悬于适宜的溶剂/赋形剂中 ,若需要可适当稀释 。液体受试物可直接加入测定体系和/或 在 处 理 前 适 当 稀 释 。 若 缺 乏 资 料 证 明 受 试 物 储 存 具 有 稳 定 性 , 受 试 物 应 现 用现配 。

　　5.2 试验条件

　　5.2. 1 溶剂/赋形剂

　　溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应 ,且应对细菌的存活和 S9的活性无影响 。若采用的不是常用的溶剂/赋形剂 ,应有资料提供适合的理由 。试验中宜首选水性溶剂/赋形剂 。若受试物对水不稳

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　　定 ,应选用不含水的有机溶剂 。

　　5.2.2 染毒剂量

　　5.2.2. 1 应根据受试物对细菌的细胞毒性和在配制的最终处理混合物中的溶解度确定试验的最高剂量 。可先进行预试验评估受试物的毒性和溶解度 。可将回变菌落数减少 、背景菌苔减少或消失 ,或处理后细菌存活率降低等作为细胞毒性的指征 。代谢活化系统的存在可能改变受试物的细胞毒性 。在实际试验条件下 ,最终处理混合物出现肉眼可见的沉淀即判断为不溶 。对于无细胞毒性的可溶性受试物 ,宜采用的最高剂量为每平板 5 mg或 5 μL。对于无细胞毒性且在每平板 5 mg或 5 μL下不溶解的受试物 ,试验中应包含一个或多个不溶解剂量 。在低于每平板 5 mg或 5 μL时出现细胞毒性的受试物 ,最高剂量应为出现细胞毒性的剂量 。沉淀不应影响菌落计数 。

　　5.2.2.2 在开始试验时 ,至少应设置 5 个可供分析的试验剂量 ,剂量间距可为 10 。 在研究剂量-反应关系时 ,可采用更小的剂量间距 。

　　5.2.2.3 若受试物含有大量可能具有致突变作用的杂质 ,试验剂量可高于每平板 5 mg或 5 μL。

　　5.2.3 对照

　　5.2.3. 1 每次试验应设置平行阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照 ,且应在有和无代谢活化系统的条件下分别设置 。 阳性对照应选择合适的剂量 , 以保证每次试验的有效性 。

　　5.2.3.2 对于采用代谢活化系统的试验 ,应根据试验菌株类型选择适宜的阳性对照物 ,适合进行代谢活化试验的阳性对照物见表 1。

　　表 1 适用于需代谢活化系统的阳性对照物

　　化学品

　　CAS编号

　　9,10-二甲基蒽(9,10-Dimethylanthracene)

　　781-43-1

　　7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-Dimethylbenz[a] anthracene)

　　57-97-6

　　刚果红(Congo red)(用于还原代谢活化法)

　　573-58-0

　　苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene)

　　50-32-8

　　环磷酰胺(环磷酰胺一水合物)(Cyclophosphamide)(Cyclophosphamide monohydrate)

　　50-18-0(6055-19-2)

　　2-氨基蒽(2-Aminoanthracene)

　　613-13-8

　　注 : 2-氨基蒽不能单独作为评价 S9混合物活性的指示剂 ,若使用 2-氨基蒽 ,对每批 S9还要另选一种需要微粒体酶代谢活化的致突变物证实其活性 ,例如苯并[a]芘或二甲基苯并蒽 。

　　5.2.3.3 对于不加代谢活化系统的试验 ,各菌株特异性的阳性对照物见表 2。

　　表 2 各菌株特异性阳性对照物

　　化学品

　　CAS编号

　　菌株

　　叠氮化钠(Sodium azide)

　　26628-22-8

　　TA1535和 TA100

　　2-硝基芴(2-Nitrofluorene)

　　607-57-8

　　TA98

　　9-氨基吖啶(9-Aminoacridine)或

　　ICR191

　　90-45-9或17070-45-0

　　TA1537、TA97和

　　TA97a

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　　表 2 各菌株特异性阳性对照物 (续)

　　化学品

　　CAS编号

　　菌株

　　过氧化氢异丙苯(Cumene hydroperoxide)

　　80-15-9

　　TA102

　　丝裂霉素 C (MitomycinC)

　　50-07-7

　　WP2 uvrA 和 TA102

　　N-乙基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-Ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)或

　　N-甲 基-N'-硝 基-N-亚 硝 基 胍 (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)或 4-硝基喹啉 1-氧化物(4-Nitroquinoline1-oxide)

　　4245-77-6或70-25-7或

　　56-57-5

　　WP2、WP2 uvrA 和

　　WP2 uvrA(pKM101)

　　呋喃基呋喃酰胺(Furylfuramide,AF-2)

　　3688-53-7

　　含质粒的菌株

　　5.2.3.4 若适用 ,也可选择其他适合的阳性对照物 ,例如与受试物化学类别相关的阳性对照物 。

　　5.2.3.5 每次试验时 , 阴性对照在培养基中只加入溶剂/赋形剂 ,其余操作与处理组相同 。若历史对照数据无法证明所用溶剂/赋形剂无毒性作用或致突变作用 ,还应设置空白对照组(不进行任何处理) 。

　　5.3 试验步骤

　　5.3. 1 平板掺入法 :无代谢活化时 ,将 0. 05 mL或 0. 1 mL受试物/受试溶液 、0. 1 mL新鲜菌悬液(约含108 个活细菌)和 0. 5 mL灭菌缓冲液与 2. 0 mL顶层琼脂混合 。若需代谢活化系统 ,将受试物/受试溶液 、新鲜菌悬液和 0. 5 mL S9混合物(S9约占代谢活化混合物的 5% ~ 30%) 与 2. 0 mL顶层琼脂混合 。将上述混合物充分混匀后 ,迅速倾入底层琼脂平板上 ,转动平板 ,使之分布均匀 。水平放置待冷凝固化后 ,倒置于 37 ℃培养箱培养 48h~ 72 h。培养结束后 ,计数每个平板的回变菌落数 。

　　5.3.2 预培养法 :将 0. 05 mL或 0. 1 mL受试物/受试溶液 、0. 1 mL新鲜菌悬液(约含 108 个活细菌) 和0. 5 mL灭菌缓冲液(或 0. 5 mL代谢活化系统)混合 ,在 30 ℃ ~ 37 ℃振荡培养 20 min或以上 。然后再与 2. 0 mL顶层琼脂混合 ,迅速倾入底层琼脂平板上 。其他操作同 5. 3. 1。

　　5.3.3 为了充分评估结果的变异度 ,每个剂量水平应设置 3个平行平板 。若有充分理由 ,也可设置 2个平行平板 ,个别平板的偶然缺失并不否定试验的可靠性 。

　　5.3.4 气态或挥发性物质应采用适当的方式进行试验 ,例如在密封容器中进行 。

　　6 试验数据和报告

　　6. 1 数据处理

　　6. 1. 1 计数回变菌落数 。应列出受试物各剂量组 、阳性对照 、阴性对照(溶剂对照) 和空白对照每个平板的回变菌落数 、平均回变菌落数和标准差 。

　　6. 1.2 对明确的阳性结果不必进行验证试验 。若结果存疑 ,可通过优化试验条件进一步确认 。 阴性结果应视具体情况而定 。若认为阴性结果不必进行验证 ,应说明理由 。在随后的试验中 ,应改变试验参数以扩大评价范围 ,可改变的参数包括剂量间距 、处理方法(平板掺入法或预培养法等)和代谢活化条件 。

　　6.2 结果评价和解释

　　6.2. 1 阳性结果的判定标准 :至少有一种菌株在有或无代谢活化系统的条件下 ,在试验剂量范围内受试物各组回变菌落数的增加呈剂量-反应关系 , 和/或在一个或多个剂量水平每平板回变菌落数出现可重复的增加 。应首先分析结果的生物学意义 。统计学方法可帮助评估试验结果 ,但试验结果在统计学意义上的显著性不能作为阳性结果判定的唯一标准 。

　　6.2.2 若受试物的试验结果不符合以上标准 ,则在本试验中可认为受试物无致突变性 。

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　　6.2.3 虽然大多数试验可得出明确的阳性或阴性结果 ,但极少数情况下可能试验重复多次仍无法对受试物的致突变性做出明确判断 。

　　6.2.4 细菌回复突变试验的阳性结果表明 ,受试物可引起鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌的基因组发生突变 ,例如碱基置换或移码突变 。 阴性结果表明 ,在本试验条件下受试物不引起试验菌株发生突变 。

　　6.3 试验报告

　　试验报告应包括以下内容 。

　　a) 受试物 :

　　— 化学标识数据和 CAS编号(如已知) ;

　　— 物理性质和纯度 ;

　　— 与试验实施相关的理化特性 ;

　　— 受试物的稳定性(如已知) 。

　　b) 溶剂/赋形剂 :

　　— 溶剂/赋形剂的选择依据 ;

　　— 受试物在溶剂/赋形剂中的溶解度和稳定性(如已知) 。

　　c) 菌株 :

　　— 所用菌株 ;

　　— 每个培养物中的细菌数 ;

　　— 菌株特征 。

　　d) 试验条件 :

　　— 每平板加入受试物的量(mg或 μL) ,剂量选择的依据 ,每个剂量的平板数 ;

　　— 所用的培养基 ;

　　— 代谢活化系统的类型和成分 ,包括可接受性标准 ;

　　— 处理方法 。

　　e) 结果 :

　　— 毒性表现 ;

　　— 沉淀现象 ;

　　— 每平板的菌落计数 ;

　　— 每平板平均回变菌落数和标准差 ;

　　— 剂量-反应关系(如可能) ;

　　— 统计学分析(如有) ;

　　— 平行阴性(溶剂/赋形剂)和阳性对照数据 ,包括范围 、均数和标准差 ;

　　— 历史阴性(溶剂/赋形剂)和阳性对照数据 ,包括范围 、均数和标准差 。

　　f) 结果讨论 。

　　g) 结论 。

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　　参 考 文 献

　　[1] OECD Guideline for Testing ofChemicals No. 471BacterialReverse Mutation Test(2020)

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