GB/T 20190-2025 饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定

　　ICS 65. 120 CCS B 46

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 20190—2025代替 GB/T20190—2006

　　饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定

　　Determination ofbovine, ovineand goat-derived materialsin feeds

　　2025-06-30发布 2026-01-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 20190—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 20190—2006《饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应(PCR)

　　法》,与 GB/T 20190—2006相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　a) 更改了适用范围和检出限(见第 1 章 ,2006年版的第 1 章) ;

　　b) 增加了 “缩略语 ”一章(见第 4章) ;

　　c) 增加了 “实时荧光聚合酶链式反应法 ”一章(见第 5 章) ;

　　d) 更改了聚合酶链式反应(PCR)法的原理 、试剂与材料 、DNA 提取方法 、PCR检测方法 、结果判定和表述 ,增加了质量控制(见第 6章 ,2006年版的第 3 章 、第 4章 、第 6章 、第 7章) ;

　　e) 增加了 “实验室污染防治措施 ”一章(见第 7章) ;

　　f) 增加了 “危害性废弃物处理 ”一章(见第 8章) ;

　　g) 增加了牛 、绵羊 、山羊 PCR检测内参对照基因及靶基因序列(见附录 B) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 、新希望六和股份有限公司 。

　　本文件主要起草人 :潘良文 、蔡一村 、张语秋 、韩伟 、杨青 、张晨 、邵冰玉 、许镇坚 、宁雪 、吕游 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2006年首次发布为 GB/T 20190—2006;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 20190—2025

　　饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定

　　1 范围

　　本文件描述了饲料中牛 、绵羊和山羊源性成分的实时荧光聚合酶链式反应和聚合酶链式反应的检测方法 。

　　本文件适用于配合饲料 、浓缩饲料 、精料补充料 、饲料原料 、复合预混合饲料和混合型饲料添加剂中牛 、绵羊和山羊源性成分的检测 。

　　本文件的检出限为 0. 1% 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 19495. 3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

　　GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

　　GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　GB/T 35918—2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　bp:碱基对(base pair)

　　Ct:循环阈值(cycle threshold)

　　CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　Tris:三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethylaminomethane)

　　5 实时荧光聚合酶链式反应法

　　5. 1 原理

　　根据牛 β-actin基 因 、绵 羊 催 乳 素 受 体 基 因 和 山 羊 9 号 染 色 体 基 因 的 特 异 性 序 列 设 计 引 物 和 探

　　1

　　GB/T 20190—2025

　　针 ,采用实时荧光 PCR技术进行扩增 ,依据扩增反应中产生的荧光信号和 Ct值实现对牛 、绵羊和山羊源性 DNA成分的检测 。

　　5.2 试剂或材料

　　除非另有规定 ,仅使用分析纯试剂 。所有试剂均使用无 DNA酶污染的容器存储或分装 。

　　5.2. 1 水 :GB/T 6682,一级 。

　　5.2.2 2×实时荧光 PCR预混液 :含有 Taq DNA 聚合酶 、实时荧光 PCR缓冲液 、MgCl2 和 dNTPs等成分 ,不应含有牛血清白蛋白 。

　　5.2.3 氢氧化钠溶液(10 mol/L) :称取 400 g氢氧化钠 ,加水定容至 1 L。

　　5.2.4 Tris-盐酸溶液(1 mol/L) :称取 121. 1 gTris溶解于 800mL水中 ,用盐酸调 pH 至 8. 0,加水定容至 1 L。在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,室温保存 。

　　5.2.5 EDTA溶液(0. 5 mol/L) :称取 186. 1 g Na2EDTA · 2H2 O 溶解于 800 mL水中 ,磁力搅拌器上剧烈搅拌 ,加入氢氧化钠约 20 g,再滴加氢氧化钠溶液(5. 2. 3) 调 pH 至 8. 0,定容至 1 L,在 103. 4 kPa、 121 ℃灭菌 20 min,室温保存 。

　　5. 2.6 Tris-EDTA(TE)缓冲液 :分别量取 10mL Tris-盐酸溶液(5. 2. 4)和 2 mLEDTA溶液(5. 2. 5) ,加水定容至 1 L,混匀 ,在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,备用 。

　　5.2.7 引 物 和 探 针 : 用 TE 缓 冲 液(5. 2. 6) 或 水 将 每 条 引 物 或 者 探 针 分 别 配 制 成 10 μmol/L工 作 溶液 ,备用 。 -18 ℃以下分装保存 ,避免多次冻融 。序列见表 1。

　　5.2. 8 阳性对照样品 :含有牛 、绵羊和山羊源成分的样品 。

　　5.2.9 阴性对照样品 :不含有牛 、绵羊和山羊源成分但含有其他动物成分的样品 。

　　表 1 实时荧光 PCR检测引物和探针序列

　　目标物种

　　引物和探针名称

　　序列

　　基因序列号

　　片段大小/bp

　　18S rRNA

　　18S-179bp-F

　　5'-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3'

　　AF176811. 1

　　179

　　18S-179bp-R

　　5'- CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3'

　　18S-179bp-P

　　5'-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3'

　　牛

　　Bov-62 bp-F

　　5'-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3'

　　NC_037352. 1

　　62

　　Bov-62 bp-R

　　5'-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3'

　　Bov-62 bp-P

　　5'-[FAM]-AGGTGCACAGTACGTTC-[NFQ-MGB]-3'

　　绵羊

　　Ovine-88bp-F

　　5'-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3'

　　NC_056069. 1

　　88

　　Ovine-88bp-R

　　5'-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3'

　　Ovine-88bp-P

　　5'- [FAM]-TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTC-[TAMRA]-3'

　　山羊

　　Goat-87bp-F

　　5'-GGAAGGAAAGAGAATGGGGATATGG-3'

　　NC_030816. 1

　　87

　　Goat-87bp-R

　　5'-TCTCCACACACAGCCAAAACC-3'

　　Goat-87bp-P

　　5'-[FAM]-ATCCATCTCTCCCTCCACTCCCTGCCTAA-[TAMRA]-3'

　　注 :扩

　　增靶标序列见附录

　　A。

　　5.3 仪器设备

　　5.3. 1 实时荧光 PCR仪 。

　　2

　　GB/T 20190—2025

　　5.3.2 分析天平 :精度 0. 1 mg。

　　5.3.3 离心机 :离心速度不低于 14000 r/min。

　　5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪 。

　　5.3.5 微量移液器 :2. 5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等规格 。

　　5.4 样品

　　按照 GB/T 20195规定制备试样 ,至少 200g,粉碎或碾磨使其全部通过 0. 25 mm 孔径的试验筛 ,充分混匀 ,装入密闭容器中 ,备用 。也可采用经过验证等效的其他粉碎或碾磨方法 。

　　同法制备阳性对照样品(5. 2. 8)和阴性对照样品(5. 2. 9) ,备用 。

　　注 : 粉碎或碾磨一个样品后 ,清洗粉碎机或碾磨仪的容器和刀具 , 防止污染 。

　　5.5 试验步骤

　　5.5. 1 DNA提取

　　平行做两份试验 。称取试样 100 mg~ 200 mg,按照 GB/T 19495. 3—2004附录 C 中 C. 6. 2 的方法提取 DNA。也可采用经过验证可靠的 DNA提取试剂盒进行 DNA 提取 ,具体参照说明书使用 。 提取空白对照除不加试样外 ,其他操作同试样一致 。 必要时 , 提取阳性对照样品和阴性对照样品的 DNA。提取的 DNA如需保存 ,置于 -18℃以下 。

　　5.5.2 DNA 溶液浓度测定

　　用紫外分光光度计(波长 :260 nm) 或微量核酸蛋白测定仪(5. 3. 4) 测定 DNA 溶液(5. 5. 1) 的浓度 。 DNA溶液质量浓度宜控制在 5 ng/μL~ 50 ng/μL。

　　5.5.3 对照设置

　　实时荧光检测过程中应设置阳性对照 、阴性对照 、扩增空白对照 、提取空白对照(5. 5. 1) 。用阳性样品(5. 2. 8)的 DNA作阳性对照 ,用阴性样品(5. 2. 9) 的 DNA作阴性对照 ,用等体积的水代替 DNA 溶液作为扩增空白对照 。

　　5.5.4 反应体系配制

　　按表 2 配制实时荧光 PCR检测反应体系 。

　　表 2 实时荧光 PCR检测反应体系

　　试剂

　　试剂浓度

　　体积/μL

　　2×实时荧光 PCR预混液(5. 2. 2)

　　2×

　　12. 5

　　上游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　下游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　探针

　　10 μmol/L

　　0. 5

　　DNA溶液

　　5 ng/μL~ 50 ng/μL

　　5

　　水

　　—

　　5

　　注 : 不同品牌的实时荧光 PCR检测试剂 ,其反应缓冲液成分可能不同 ,具体操作参见产品使用说明书 。

　　3

　　GB/T 20190—2025

　　5.5.5 实时荧光 PCR扩增

　　按表 3反应参数在实时荧光 PCR仪上进行扩增 , 以平行测定的 Ct值的平均值作为最终结果 。

　　表 3 实时荧光 PCR反应参数

　　反应步骤

　　反应温度

　　反应时间

　　循环数

　　预变性

　　95 ℃

　　10 min

　　1

　　热循环

　　95 ℃

　　15 s

　　40

　　60 ℃

　　1 min

　　注 : 不同品牌的实时荧光 PCR检测试剂 ,对 PCR反 应 程 序 的 设 置(如 : 变 性 温 度) 可 能 不 同 ,具 体 操 作 参 见 产 品使用说明书 。

　　5.6 质量控制

　　5.6. 1 内参对照基因扩增

　　真核生物内参对照基因 18S rRNA基因检测应符合下列条件 ,否则重新提取核酸样品 :

　　a) 提取空白对照 :Ct值 ≥37. 0 或无 Ct值 ;

　　b) 扩增空白对照 :Ct值 ≥37. 0 或无 Ct值 ;

　　c) 阴性对照 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤28. 0;

　　d) 阳性对照 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤28. 0;

　　e) 待测样品 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤33. 0。

　　5.6.2 牛、绵羊和山羊源性特异基因扩增

　　牛 、绵羊和山羊源性特异基因的实时荧光 PCR检测应符合以下条件 :

　　a) 提取空白对照 :Ct值 =40. 0 或无 Ct值 ;

　　b) 扩增空白对照 :Ct值 =40. 0 或无 Ct值 ;

　　d) 阳性对照 :荧光通道有荧光信号检出 ,且出现典型的扩增曲线 ,Ct值 ≤35. 0。

　　c) 阴性对照 :Ct值 =40. 0 或无 Ct值 ;

　　5.7 结果判定和表述

　　5.7. 1 结果判定

　　符合 5. 6 时 ,被测样品的检测结果按以下进行判定 :

　　a) Ct值 ≤35. 0,则判定为被检样品阳性 ;

　　b) Ct值 =40. 0 或无 Ct值 ,则判定为被检样品阴性 ;

　　c) 35. 0

　　5.7.2 结果表述

　　结果为阳性的表述为 “检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　结果为阴性的表述为 “未检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　4

　　GB/T 20190—2025

　　6 聚合酶链式反应法

　　6. 1 原理

　　根据牛 、绵羊和山羊线粒体基因的特异性序列设计引物 ,采用 PCR 技术进行扩增 。通过电泳分离PCR产物 ,与 DNA分子 量 标 记 比 较 , 并 对 PCR 产 物 进 行 测 序 , 与 基 因 库 中 的 物 种 参 照 序 列 进 行 比较 ,实现对牛 、绵羊和山羊源性 DNA成分的检测 。

　　6.2 试剂与材料

　　除非另有规定 ,仅使用分析纯试剂 。所有试剂均使用无 DNA酶污染的容器存储或分装 。

　　6.2. 1 水 :GB/T 6682,一级 。

　　6.2.2 正己烷 。

　　6.2.3 异丙醇 。

　　6.2.4 2×PCR反应预混液 :含有 Taq DNA 聚合酶 、PCR缓冲液 、MgCl2 和 dNTPs等成分 ,不应含有牛血清白蛋白 。

　　6.2.5 体积分数为 75%的乙醇 。

　　6.2.6 琼脂糖 。

　　6.2.7 核酸染料 Goldview溶液(10 000 ×) 。

　　6.2. 8 DNA分子量标记(覆盖 100 bp~ 500 bp的范围) 。

　　6.2.9 PCR产物回收纯化试剂盒 :按使用说明操作 。

　　6.2. 10 DNA测序试剂 。

　　6.2. 11 体积分数为 95%的乙醇 。

　　6.2. 12 甲酰胺 。

　　6.2. 13 Tris-盐酸溶液(1 mol/L) : 同 5. 2. 4。

　　6.2. 14 EDTA溶液(0. 5 mol/L) : 同 5. 2. 5。

　　6.2. 15 溴代十六烷基三甲胺(CTAB)提取缓冲液 :在 800 mL去离子水中加入 46. 75 g氯化钠 ,20 g 溴代十六 烷 基 三 甲 胺(CTAB) , 摇 动 容 器 使 溶 质 完 全 溶 解 , 然 后 加 入 50 mL Tris-盐 酸 溶 液(6. 2. 13) 和

　　6(6)..2(2).. 17 三(16 T)r氯is甲烷和异戊醇混合液(饱和苯酚和三氯甲烷)混,V合(三氯(液),甲(V)(烷(T)rV(饱)和(异戊醇(苯酚))+)=V2(1(氯)。甲烷)= 1+1。

　　20 mLEDTA溶液(6. 2. 14)用水定容至 1 L,分装后 ,在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,备用 。

　　6.2. 18 乙酸钠溶液(3 mol/L) :在 80 mL水中 ,加入 40. 81 g 三水合乙酸钠 ,溶解后用冰乙酸调节 pH值到 5. 2,用水定容到 100 mL,分装后 ,在 103. 4 kPa、121 ℃灭菌 20 min,备用 。

　　6.2. 19 TE缓冲液 : 同 5. 2. 6。

　　6.2.20 引物 :用 TE缓冲液(6. 2. 19)或水将每条引物分别配制成 10 μmol/L工作液 ,备用 。 - 18 ℃ 以下分装保存 ,避免多次冻融 。序列见表 4。

　　6.2.21 电泳缓冲液 :称取 54 gTris,27. 5 g硼酸 ,20 mL EDTA溶液(6. 2. 14) ,然后用水定容到 1 L,使用时 10倍稀释 。

　　6.2.22 上样缓冲液 :称取溴酚蓝 250 mg,加水 10 mL,在室温下过夜溶解 ;再称取二甲腈蓝 250 mg,用10 mL水溶解 ;称取蔗糖 50 g,用 30 mL水溶解 ,合并三种溶液 ,用水定容至 100 mL在 4 ℃中保存 。

　　5

　　GB/T 20190—2025

　　表 4 PCR检测引物序列

　　目标物种

　　引物名称

　　序列

　　基因序列号

　　片段大小/bp

　　18S rRNA

　　18S-179bp-F

　　5'-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3'

　　AF176811. 1

　　179

　　18S-179bp-R

　　5'- CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3'

　　牛

　　Bov-271 bp-F

　　5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3'

　　NC_006853. 1

　　271

　　Bov-271 bp-R

　　5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3'

　　绵羊

　　Ovine-369bp-F

　　5'-TATGATTGCTCTTCCATCCTT-3'

　　NC_001941. 1

　　369

　　Ovine-369bp-R

　　5'-GAGCATTGACCGTAGAATAG-3'

　　山羊

　　Goat-293bp-F

　　5'-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3'

　　NC_005044. 2

　　293

　　Goat-293bp-R

　　5'-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3'

　　注 : 扩增靶标序列见附录 B。

　　6.3 仪器

　　6.3. 1 实验室常用仪器设备 。

　　6.3.2 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪 。

　　6.3.3 PCR扩增仪 。

　　6.3.4 电泳仪 。

　　6.3.5 凝胶成像仪 。

　　6.3.6 DNA序列分析仪 。

　　6.3.7 高压灭菌锅 。

　　6.4 样品

　　同 5. 4。

　　6.5 试验步骤

　　6.5. 1 DNA提取

　　6.5. 1. 1 CTAB提取方法

　　同 5. 5. 1。

　　6.5. 1.2 油脂类饲料中 DNA提取方法

　　平行做两份试验 。取油脂饲料适量(液态油取 30 mL,磷脂类和固态油脂取 5 g)放入 250 mL三角瓶中 ,加入 25mL正己烷(6. 2. 2) ,于磁力搅拌器上不断振荡混合 2 h后 ,加入 25mL CTAB提取缓冲液(6. 2. 15) ,继续于磁 力 搅 拌 器 上 振 荡 混 合 2 h。 将 溶 液 转 入 100 mL 离 心 管 中 , 于 8 000 r/min离 心10min,使有机相和水相分离 ,取水相 ,加入与水相溶液等体积的异丙醇(6. 2. 3)及水相溶液 1/10体积的乙酸钠溶液(6. 2. 18) ,轻缓颠倒混匀 ,室温放置 10 min后 ,12 000 r/min离心 10 min,弃上清液 ,待沉淀干燥后 用 200 μL TE 缓 冲 液 (6. 2. 19) 溶 解 沉 淀 , 加 入 200 μL Tris饱 和 苯 酚 和 三 氯 甲 烷 混 合 液(6. 2. 16) ,轻缓颠倒混匀溶液 ,12 000 r/min离心 10 min,取上清液 ,加入与上清液等体积三氯甲烷和异戊醇混合液(6. 2. 17) ,轻缓颠倒混匀 ,12 000 r/min离心 2 min 至分相 。将上清液转移至干净的离心管

　　6

　　GB/T 20190—2025

　　中 ,加入与溶液等体积的异丙醇(6. 2. 3) 及溶液 1/10体积的乙酸钠溶液(6. 2. 18) ,轻缓颠倒混匀 。 室温放置 10 min后 ,12 000 r/min离心 10 min,弃上清 液 后 , 依 次 加 入 800 μL体 积 分 数 为 75%的 乙 醇 和100 μL体积分数为 75%的乙醇(6. 2. 5)洗涤沉淀 。 12 000 r/min离心 5 min,弃除乙醇溶液 。待沉淀干燥后 ,DNA沉淀溶解于 100 μLTE缓冲液(6. 2. 19)中 ,待测或于 -18℃以下保存备用 。

　　也可采用经过验证可靠的 DNA提取试剂盒 ,提取空白对照 ,除不加试样外 ,其他操作同试样一致 。必要时 ,提取阳性对照样品和阴性对照样品的 DNA。

　　6.5.2 DNA 溶液浓度测定同 5. 5. 2。

　　6.5.3 对照设置同 5. 5. 3。

　　6.5.4 反应体系配制

　　按表 5 配制 PCR检测反应体系 。

　　表 5 PCR检测反应体系

　　试剂

　　试剂浓度

　　体积/μL

　　2×PCR反应预混液(6. 2. 4)

　　2×

　　12. 5

　　上游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　下游引物

　　10 μmol/L

　　1

　　DNA溶液

　　5 ng/μL~ 50 ng/μL

　　5

　　水

　　—

　　5. 5

　　注 : 不同品牌的 PCR检测试剂盒 ,其反应缓冲液成分可能不同 ,具体操作参见产品使用说明书 。

　　6.5.5 PCR扩增

　　按表 6 的程序在 PCR扩增仪(6. 3. 3)上进行 PCR扩增 。PCR反应结束后 ,对反应物进行电泳检测或在 4 ℃保存备用 。

　　表 6 PCR反应程序

　　反应步骤

　　反应温度

　　反应时间

　　循环数

　　预变性

　　94 ℃

　　5 min

　　1

　　热循环

　　94 ℃

　　30 s

　　35

　　56 ℃

　　30 s

　　延伸

　　72 ℃

　　5 min

　　1

　　注 : 不同品牌的 PCR检测试 剂 , 对 PCR 反 应 程 序 的 设 置(如 : 变 性 温 度) 可 能 不 同 , 具 体 操 作 参 见 产 品 使 用 说明书 。

　　7

　　GB/T 20190—2025

　　6.5.6 PCR扩增产物的电泳检测

　　将适量的 琼 脂 糖 加 入 电 泳 缓 冲 液(6. 2. 21) 中 , 加 热 将 其 溶 解 , 配 制 成 质 量 分 数 为 1. 5%的 琼 脂 糖(6. 2. 6)溶液 ,然后按每 100 mL琼脂糖溶液中加入 5 μL核酸染料 Goldview 溶液(6. 2. 7) 的比例 ,加入Goldview溶液 ,混匀 ,稍适冷却后 ,将其倒入电泳板上 , 室温下凝固成凝胶后 ,放入电泳缓冲液(6. 2. 21)中 。取 10 μL~ 15μLPCR反应液 ,加入 3 μL~ 5 μL上样缓冲液(6. 2. 22)并混合均匀 ,在每个泳道中加入取 10 μL~ 15 μL的上述混合物 ,其中一个泳道中加入 DNA 分子量标记(6. 2. 8) ,接通电源 , 9 V/cm电压 , 电泳 20 min~ 30 min。

　　电泳结束后 ,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪(6. 3. 5) 上成像 。 根据 DNA 分子量标记判断扩增出的目的条带的大小 ,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照 。

　　对 PCR 阳性结果的样品 ,要对 PCR扩增产物进行 DNA序列测定 。

　　6.5.7 PCR扩增产物直接测序

　　6.5.7. 1 PCR 扩增产物的纯化

　　将 60 μLPCR反应液与上样缓冲液(6. 2. 22)混合后 ,加入预制好的含质量分数为 0. 8%的琼脂糖凝胶的泳道中 ,在其中的一个泳道中加入 DNA分子量标记 ,接通电源进行电泳 。在凝胶成像仪下将 PCR特异性增条带切割下来 , 以下步骤按 PCR产物回收纯化试剂盒(6. 2. 9)说明进行 。

　　6.5.7.2 测序扩增反应

　　反应体系(20μL) :8 μLDNA测序试剂(6. 2. 10) ,200ng~ 500ngPCR纯化产物 ,3. 2 pmol引物 ,水补足至 20 μL;PCR扩增程序 :96 ℃ 10 s,50 ℃ 5 s,60 ℃ 4 min,25个循环 ,扩增产物 4 ℃保存 。

　　6.5.7.3 测序扩增产物的纯化

　　扩增管中 加 入 16 μL水、64 μL体 积 分 数 为 95% 的 乙 醇 (6. 2. 11) , 稍 混 匀 , 室 温 放 置 15 min, 12000 r/min离心 20min,去上清 ,加入 250μL体积分数为 75%的乙醇(6.2. 5) ,短暂混匀 ,12000 r/min离心 10min,去上清 ,室温干燥 。

　　6.5.7.4 测序

　　纯化产物中加入 170 μL甲酰胺(6. 2. 12) ,95 ℃ , 5 min,迅速转移至冰上 , 2 min。分装样品测序仪的加样槽中 , 自动测序 。

　　6.5.7.5 测序产物拼接

　　用正向和反向引物分别进行测序扩增反应 、纯化和测序 ,将两次测得序列进行拼接 ,得到最终 PCR产物测序结果 。

　　6.5. 8 PCR扩增产物克隆测序

　　PCR扩增产物克隆测序按照 GB/T 35918—2018附录 D执行 。

　　6.6 质量控制

　　6.6. 1 内参对照基因扩增的质量控制

　　当进行真核生物内参对照基因 18S rRNA基因的实时荧光 PCR 检测时 ,应符合下列条件 ,否则要重新提取样品 DNA:

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　　GB/T 20190—2025

　　a) 提取空白对照 :无扩增条带 ,或条带比阴性对照 、阳性对照和待测样品的扩增条带明显浅 ;

　　b) 扩增空白对照 :无扩增条带 ,或条带比阴性对照 、阳性对照和待测样品的扩增条带明显浅 ;

　　c) 阴性对照 : 出现 179bp片段长度的扩增条带 ;

　　d) 阳性对照 : 出现 179bp片段长度的扩增条带 ;

　　e) 待测样品 : 出现 179bp片段长度的扩增条带 。

　　6.6.2 目标基因扩增的质量控制

　　当进行目标基因的实时荧光 PCR检测时 ,应符合下列条件 :

　　a) 提取空白对照 :无扩增条带 ;

　　b) 扩增空白对照 :无扩增条带 ;

　　c) 阴性对照 :无扩增条带 ;

　　d) 阳性对照 :检测牛 、绵羊 、山羊源性成分时 , 分别出现 271 bp、369 bp、293 bp片段长度的扩增条带 。

　　6.7 结果判定和表述

　　6.7. 1 结果判定

　　6.7. 1. 1 待测样品的靶基因扩增 PCR产物的电泳结果阴性 ,判定靶基因检测结果阴性 。

　　6.7. 1.2 待测样品的靶基因扩增 PCR产物的电泳结果阳性 ,判定靶基因检测结果阳性 。若需要进一步确证 ,需进行 DNA测序 ,测序结果与在 GenBank 中通过 BLAST 功能搜索得到的牛 、绵羊和山羊靶基因序列或与附录 B 中牛 、绵羊和山羊的靶基因序列进行比较 :

　　— 序列结果符合程度 ≥90% ,确证靶基因检测结果阳性 ;

　　— 序列结果符合程度<90% ,确证靶基因检测结果阴性 。

　　6.7.2 结果表述

　　结果为阳性的表述为 “检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　结果为阴性的表述为 “未检出 × ×源性 DNA成分 ”。

　　7 实验室污染防治措施

　　按 GB/T 27403—2008附录 D规定执行 。

　　8 危害性废弃物处理

　　按 GB/T 27403—2008中 5. 5. 2规定执行 。

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　　GB/T 20190—2025

　　附 录 A

　　(资料性)

　　牛、绵羊、山羊实时荧光 PCR检测内参对照基因及靶基因序列

　　A. 1 18SrRNA

　　18S rRNA 内参对照基因序列如下 :

　　A.2 牛 (Bostaurus)

　　牛靶基因序列如下 :

　　A.3 绵羊 (Ovisaries)

　　绵羊靶基因序列如下 :

　　A.4 山羊 (Caprahircus)

　　山羊靶基因序列如下 :

　　注 : 单下划线为引物位置 ,双下划线为探针位置 。

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　　GB/T 20190—2025

　　附 录 B

　　(规范性)

　　牛、绵羊、山羊 PCR检测内参对照基因及靶基因序列

　　B. 1 18SrRNA

　　18S rRNA 内参对照基因序列如下 :

　　B.2 牛 (Bostaurus)

　　牛靶基因序列如下 :

　　B.3 绵羊 (Ovisaries)

　　绵羊靶基因序列如下 :

　　B.4 山羊 (Caprahircus)

　　山羊靶基因序列如下 :

　　注 : 单下划线为引物位置 。

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　　GB/T 20190—2025

　　参 考 文 献

　　[1] ISO/TS 20224-1: 2020 Molecular biomarker analysis—Detection of animal derived materi- alsin foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR—Part1:Bovine DNA detection method

　　[2] ISO/TS 20224-2: 2020 Molecular biomarker analysis—Detection of animal derived materi- alsin foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR—Part2:Ovine DNA detection method

　　[3] ISO/TS20224-5: 2020 Molecular biomarker analysis—Detection of animal derived materi- alsin foodstuffs and feedstuffs by real-time PCR—Part5:GoatDNA detection method

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