T/SPMA 008-2023 化妆品舒缓功效测试方法 基于体外肥大细胞的脱颗粒抑制率及组胺释放量检测

以下是团体标准 ​​T/SPMA 008-2023《化妆品舒缓功效测试方法 基于体外肥大细胞的脱颗粒抑制率及组胺释放量检测》​​ 的详细内容总结：

​​一、标准概述​​

• ​​标准编号​​：T/SPMA 008-2023
• ​​名称​​：化妆品舒缓功效测试方法（基于体外肥大细胞的脱颗粒抑制率及组胺释放量检测）
• ​​归口单位​​：上海市预防医学会
• ​​首次制定​​：本文件为首次发布。
• ​​目的​​：规范化妆品舒缓功效的评价方法，通过抑制肥大细胞脱颗粒和组胺释放来验证产品的舒缓作用。

​​二、核心术语与定义​​

1. ​​肥大细胞​​：产生于骨髓造血干细胞，迁移至特定组织分化成熟，参与炎症反应。
2. ​​脱颗粒​​：肥大细胞释放炎性介质（如组胺）的功能状态，是皮肤刺激反应的基础。
3. ​​组胺​​：由肥大细胞分泌的强效炎性介质，导致血管通透性增加和组织损伤。

​​三、测试原理​​

• ​​舒缓机制​​：化妆品通过抑制肥大细胞脱颗粒及组胺释放，减轻皮肤刺激反应（如红肿、瘙痒）。
• ​​两种检测方法​​：
  • ​​脱颗粒抑制率检测​​：以小鼠肥大细胞瘤细胞系 ​​P815​​ 为模型，用刺激剂 ​​C48/80​​ 诱导脱颗粒，通过细胞形态学统计抑制率。
  • ​​组胺释放量检测​​：以 ​​小鼠原代腹腔肥大细胞​​ 为模型，用 ​​神经肽P物质​​ 刺激释放组胺，通过酶联免疫法（ELISA）检测组胺含量变化。

​​四、关键试验流程​​

​​（一）脱颗粒抑制率检测​​

1. ​​细胞准备​​：
   • 细胞系：P815（建议ATCC来源），接种密度需保证12小时后融合度达45%~60%。
   • 刺激剂：C48/80（终浓度40μg/mL），诱导30%~60%细胞脱颗粒视为有效。
2. ​​受试物处理​​：
   • 浓度要求：通过细胞毒性测试确定（细胞活力≥90%）。
   • 溶剂：推荐DMSO或乙醇，避免沉淀或云雾状。
3. ​​试验分组​​：
   • 空白对照组（无刺激）、阴性对照组（仅C48/80）、阳性对照组（色甘酸钠，1mg/mL）、受试物组（含C48/80）。
4. ​​脱颗粒判定​​：
   • ​​未脱颗粒细胞​​：膜光滑、胞质均匀。
   • ​​脱颗粒细胞​​：膜粗糙、胞质颗粒外溢（附录B提供图示）。
5. ​​结果计算​​：
   • 脱颗粒率 = 脱颗粒细胞数 / 总细胞数 × 100%。
   • 抑制率 = [1 - (受试物组脱颗粒率 / 阴性对照组脱颗粒率)] × 100%。

​​（二）组胺释放量检测​​

1. ​​细胞分离​​：
   • 来源：KM小鼠腹腔灌洗液，经Percoll梯度离心纯化（纯度需验证）。
   • 活性要求：台盼蓝染色活力≥90%，甲苯胺蓝染色鉴定肥大细胞（红紫色）。
2. ​​刺激与处理​​：
   • 刺激剂：P物质（终浓度10μM）。
   • 阳性对照：氯化钙（1μg/mL）或二氢燕麦酰基邻氨基苯甲酸D（500μg/mL）。
3. ​​组胺检测​​：
   • 方法：竞争性酶免疫分析法（ELISA），需预实验确定稀释比例。
4. ​​结果计算​​：
   • 组胺含量通过标准曲线回归方程计算。
   • 抑制率 = [1 - (受试物组组胺量 / 阴性对照组组胺量)] × 100%。

​​五、试验有效性判定​​

• ​​脱颗粒检测​​：阳性对照组抑制率需≥20%。
• ​​组胺检测​​：
  • 阴性对照组组胺量较空白组上调≥20%（p<0.05）。
  • 阳性对照组抑制率≥20%（p<0.05）。

​​六、结果报告要求​​

1. ​​数据格式​​：脱颗粒率/组胺含量以 ​​平均值±标准差（SD）​​ 表示。
2. ​​统计学要求​​：受试物组与阴性对照组差异需 ​​p<0.05​​。
3. ​​浓度标注​​：必须注明受试物测试浓度。
4. ​​功效宣称依据​​：
   • 抑制率为正值且p<0.05时，可作为化妆品舒缓功效的证据。

​​七、附录内容​​

• ​​附录A（溶液制备）​​：
  • C48/80储备液（50mg/mL）、色甘酸钠（1mg/mL）等关键试剂的配制方法。
• ​​附录B（细胞形态示例）​​：
  • 提供40倍镜下肥大细胞脱颗粒状态对比图（空白对照、阴性对照、阳性对照、样品组）。

​​八、参与单位​​

• ​​起草单位​​：上海市疾控中心、广东博溪生物、德之馨、云南贝泰妮等17家机构。
• ​​主要起草人​​：陶功华、崔文广、陈田等32位专家。

​​总结要点​​

本标准建立了 ​​两种体外检测方法​​：

1. 基于 ​​P815细胞系​​ 的脱颗粒抑制率检测（形态学统计）；
2. 基于 ​​原代腹腔肥大细胞​​ 的组胺释放量检测（ELISA法）。
   通过抑制肥大细胞活化释放炎性介质，科学验证化妆品舒缓功效，为产品宣称提供标准化依据。