T/SPMA 009-2023 化妆品舒缓功效测试方法 基于脂多糖诱导巨噬细胞系炎症细胞模型的一氧化氮含量测定

以下是团体标准 ​​T/SPMA 009-2023《化妆品舒缓功效测试方法 基于脂多糖诱导巨噬细胞系炎症细胞模型的一氧化氮含量测定》​​ 的详细内容总结：

​​一、标准基本信息​​

• ​​标准编号​​：T/SPMA 009-2023
• ​​名称​​：化妆品舒缓功效测试方法（基于脂多糖诱导巨噬细胞系炎症模型的一氧化氮含量测定）
• ​​发布与实施日期​​：2023年5月5日发布并实施
• ​​归口单位​​：上海市预防医学会
• ​​起草单位​​：上海市疾控中心、贝泰妮集团、片仔癀、上海家化等16家单位
• ​​适用范围​​：适用于化妆品舒缓功效的体外测试评价

​​二、核心原理​​

通过细菌脂多糖（​​LPS​​）刺激小鼠巨噬细胞（​​RAW264.7​​），模拟皮肤炎症状态，诱导细胞释放一氧化氮（​​NO​​）。具有舒缓功效的化妆品可抑制NO的过量释放，通过检测细胞上清液中NO含量变化，计算抑制率，评价化妆品舒缓功效。

​​三、关键术语定义​​

1. ​​一氧化氮（NO）​​：免疫调节因子，参与皮肤炎症反应。
2. ​​光密度（OD）​​：反映溶液中物质浓度的吸光度参数。
3. ​​试验有效性标准​​：
   • LPS诱导组（阴性对照）NO含量需≥空白组2倍；
   • 阳性对照组（地塞米松）NO抑制率需≥25%。

​​四、试验流程​​

​​1. 细胞准备​​

• ​​细胞株​​：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（ATCC TIB-71）。
• ​​培养条件​​：高糖DMEM培养基（含新生牛血清），37℃、5% CO₂培养。
• ​​接种要求​​：密度需保证12小时后融合度达45%~60%（建议4×10⁵ cells/孔）。

​​2. 受试物处理​​

• ​​浓度选择​​：需通过细胞毒性测试（细胞活力≥90%）。
• ​​溶剂要求​​：DMSO或乙醇（体积一致且无细胞毒性）。
• ​​分组设置​​：
  • ​​空白对照组​​：仅培养基；
  • ​​阴性对照组​​：LPS（1 μg/mL）；
  • ​​阳性对照组​​：LPS + 地塞米松（100 μg/mL）；
  • ​​受试物组​​：LPS + 化妆品样品（3个复孔）。

​​3. 刺激与孵育​​

• ​​刺激条件​​：LPS终浓度1 μg/mL（可微调）。
• ​​孵育时间​​：LPS刺激共24小时（分两阶段处理）。

​​4. NO检测（Griess法）​​

• ​​步骤​​：
  1. 收集细胞上清液（400 μL/孔）；
  2. 按试剂盒说明操作，酶标仪检测540 nm波长OD值；
  3. 根据标准曲线计算NO浓度。

​​五、结果计算与判定​​

​​1. 计算公式​​

• ​​NO含量​​：通过标准曲线回归方程计算（3复孔平均值）。
• ​​抑制率（%）​​：

  /text{抑制率} = /left(1 - /frac{T}{C}/right) /times 100/%

  • T：受试物组NO平均值；
  • C：阴性对照组NO平均值。

​​2. 舒缓功效判定​​

• ​​有效性前提​​：满足阴性对照组NO上调≥2倍，阳性组抑制率≥25%。
• ​​功效宣称条件​​：
  • 抑制率 > 0；
  • 受试物组与阴性对照组差异显著（P < 0.05）。

​​六、附录内容​​

• ​​附录A​​：RAW264.7细胞培养图片示例（20倍镜下图）。
• ​​附录B​​：关键溶液配制方法（如地塞米松储备液、LPS工作液）。

​​七、注意事项​​

1. 受试物需新鲜配制，避免溶剂干扰。
2. 操作需在超净台中进行，确保无菌环境。
3. 结果报告需包含浓度、抑制率及统计学差异。

​​总结​​

该标准建立了基于巨噬细胞炎症模型的化妆品舒缓功效​​体外评价方法​​，通过量化NO抑制率提供科学依据。其核心是规范化的细胞培养、LPS刺激条件及Griess法检测流程，确保结果可靠性和可重复性，为化妆品功效宣称提供技术支持。