NY/T 2476-2025 大白菜品种鉴定 SSR分子标记法

以下是对《NY/T 2476-2025 大白菜品种鉴定 SSR分子标记法》标准核心内容的详细总结：

​​一、标准概况​​

1. ​​标准属性​​

   • 中华人民共和国农业行业标准，替代NY/T 2476-2013。
   • 归口单位：全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC 277）。
   • 起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业农村部科技发展中心。

2. ​​主要修订内容​​

   • ​​新增13对引物​​：CRIB1-43、CRIB1-54等（覆盖A1-A10连锁群）。
   • ​​删除13对引物​​：cnu_m139a、nia_m086a等（涉及A1/A3/A6/A9/A10连锁群）。
   • 结构调整及文本优化。

3. ​​适用范围​​

   • 适用于大白菜（Brassica rapa ssp. Pekinensis）品种的DNA分子数据采集与鉴定。

​​二、技术原理​​

• ​​SSR标记原理​​
  利用大白菜基因组中简单重复序列（SSR）的重复次数差异，通过PCR扩增和电泳检测片段长度多态性，区分不同品种。

​​三、关键流程与要求​​

​​1. 样品准备​​

• ​​样品类型​​：种子、幼苗、叶片等（种子需按GB/T 3543.2扦样）。
• ​​样本量​​：≥30个个体混合分析，必要时单体检。

​​2. DNA提取（CTAB法）​​

• ​​步骤​​：液氮研磨→65℃ CTAB裂解→氯仿抽提→乙醇沉淀→TE溶解。
• ​​质量要求​​：OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.7~2.0，浓度≥25 ng/μL。

​​3. PCR扩增​​

• ​​反应体系（25μL）​​：

  组分	终浓度	体积（μL）
  10X缓冲液	1X	2.5
  dNTPs	0.2 mmol/L	0.625
  Taq酶	0.05 U/μL	0.4
  引物（正/反）	0.25 μmol/L	各2
  DNA模板	2.5 ng/μL	5
  ddH₂O	-	12.475

• ​​扩增程序​​：
  94℃ 4min → [94℃ 45s → 65℃→50℃ 45s →72℃ 45s]（15循环）→ [94℃ 45s →50℃ 30s →72℃ 45s]（30循环）→72℃ 10min

​​4. 电泳检测​​

• ​​方法选择​​：
  • ​​变性PAGE​​：普通引物，银染显色（附录B.4）。
  • ​​荧光毛细管电泳​​：荧光标记引物（附录D），需内标校正系统误差。
• ​​关键参数​​：
  • PAGE胶浓度：6%，电压1800V，电泳时间1.5~3.5h（依片段大小定）。
  • 毛细管电泳：按仪器手册操作，引物分组见附录F。

​​5. 数据分析​​

• ​​等位变异判定​​：
  • 纯合位点：记录为 X/X（如257/257）。
  • 杂合位点：记录为 X/Y（如181/187）。
  • 缺失位点：记录为 0/0。
• ​​系统误差校正​​：通过参照品种（附录E）校准片段大小（示例见10.5.1）。

​​6. 结果判定​​

• ​​判定规则​​：
  • ​​差异位点数 > 2​​ → 判定为“不同”。
  • ​​差异位点数 ≤ 2​​ → 判定为“疑同”。
• ​​结果表述​​：
  送检样品与对照样品采用[检测方法]，检测位点数[ ]，差异位点数[ ]，判定为[不同/疑同]。

​​四、核心附录内容​​

​​附录A：仪器与试剂​​

• ​​关键设备​​：PCR仪、电泳系统（PAGE/毛细管）、离心机、核酸测定仪等。
• ​​主要试剂​​：CTAB、dNTPs、SSR引物、丙烯酰胺、荧光染料（FAM/ROX/TAMRA/HEX）等。

​​附录B：溶液配制​​

• ​​DNA提取液​​：CTAB提取液、TE缓冲液（pH 8.0）。
• ​​电泳相关​​：40%丙烯酰胺、10×TBE、银染试剂（硝酸银/甲醛显影液）。

​​附录C：引物序列​​

• ​​30对核心引物​​（如CRIB1-43、nia_m138a等），包含正向/反向序列及连锁群位置。

​​附录D：引物信息​​

• ​​荧光标记​​：每对引物推荐荧光染料（如CRIB1-43用HEX）。
• ​​等位变异范围​​：如nia_m138a为245~261 bp。
• ​​参照品种​​：每引物对应参照品种（如nia_m138a的参照为豫早0901、W13-8等）。

​​附录E：参照品种​​

• ​​34个品种​​（如玉青、津绿-3、福77-105等），来源主要为山东省农科院蔬菜所。

​​附录F：引物分组（荧光毛细管电泳）​​

• ​​3个检测组​​：

  组别	FAM标记引物	ROX标记引物	其他标记引物
  1	cnu_m090a等3对	CRIB2-23等2对	CRIB1-43（HEX）
  2	CRIB6-3等3对	CRIB10-30等2对	CRIB1-54（HEX）
  3	CRIB5-11等4对	cnu_m537a等3对	ENA2（TAMRA）

​​五、关键注意事项​​

1. ​​专利声明​​：部分内容可能涉及专利，标准发布机构不承担识别责任。
2. ​​引物使用​​：优先使用新增引物（如CRIB系列），删减引物（如cnu_m139a）停用。
3. ​​数据校正​​：必须通过参照品种消除电泳系统误差。
4. ​​终止条件​​：检出足够差异位点时可提前终止检测。

​​总结​​：该标准系统规范了大白菜SSR分子标记鉴定的全流程，重点更新了引物体系，强化了荧光毛细管电泳的应用，并通过参照品种和分组策略提升检测效率与准确性。判定规则明确（差异位点>2即判定不同），为品种真实性鉴定提供技术依据。