GB/T 35024-2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法

　　ICS 67 . 120 . 10 B 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 35024—2018

　　常见畜禽动物成分检测方法

　　液相芯片法

　　Detectionmethodofmammalsandpoultryingredients—

　　Suspendedbeadarray

　　2018-05-14 发布 2018-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 35024—2018

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC 421)提出并归口 。

　　本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。

　　本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王娉、张舒亚、高宏伟。

　　GB/T 35024—2018

　　常见畜禽动物成分检测方法

　　液相芯片法

　　1 范围

　　本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法。

　　本标准适用于肉及加工品、乳、皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反刍动物成分，和 13种常见肉品或掺杂成分(骆驼、马、驴、牦牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠)动物物种成分的定

　　性检测。方法的最低检出限为(质量百分比)：水牛 5% ,哺乳、反刍、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为 1% ,骆驼、牦牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为 0 .1% 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 14699 . 1 饲料 采样

　　GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

　　SN/T 3561 国境口岸卫生监督食品采样、送样规程

　　3 术语和定义、缩略语

　　3 . 1 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 . 1 . 1

　　液相芯片技术 suspendedbeadarray

　　通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合，通过流式细胞技术对样品中的多种目标成分进行同时检测。

　　3.1.2

　　液相芯片探针 suspendedarrayprobe

　　固定于微球表面，能与 目标成分亲和结合用于探测 目标成分信息的核酸或蛋白分子。

　　3.1.3

　　质控探针 qualitycontrolprobe

　　用来监控芯片反应是否正常的探针。

　　注：本标准使用的是人工合成的一段寡核苷酸探针(polyT20polyA20 , 5′端氨基标记)。

　　3.1.4

　　荧光强度中位值 medianfluoresenceintensity

　　液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值，即软件自动读取与样品结合的微球数量，并进行背景值校正后得到的数值。

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　　3.1.5

　　阈值 cutoffvalue

　　判定阳性信号的最低荧光强度中位值。 通过实验数据统计分析后得出，要求防止假阳性结果，同时保证灵敏度需求。

　　3 . 2 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)

　　DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)

　　dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

　　dCTP：脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

　　dGTP：脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

　　dTTP：脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

　　EDC:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminodipropyl) -N -ethylcar-

　　bodiimade]

　　EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)

　　MES:2-吗啉乙磺酸[2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid]

　　SA-PE：链霉亲和素-藻红素(streptavidin-phycoerythrobilin)

　　SDS：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)

　　Taq：水生栖热菌(Thermusaquaticu)

　　TE：由 Tris 和 EDTA 配制而成的缓冲溶液(Tris-EDTA buffer solution)

　　TMAC：四甲基氯化铵(tetramethyl ammonium chloride)

　　Tris：三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) aminomethane]

　　4 方法提要

　　对样品中的靶基因进行 PCR扩增，通过液相杂交将偶联探针的微球与 PCR扩增产物结合，采用流式细胞技术对目标成分进行检测。 每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针，特异结合一种 目标核酸序列。 该核酸序列连接荧光标记物。 单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测，一束激光检测微球的色标编码，另一束激光检测 目标核酸序列荧光标记物。 检测单一成分时，将该成分PCR产物与相应微球进行反应;检测多种成分时，可以将各个成分的 PCR 产物与微球混合物进行反应 。检测实验室需达到 GB/T 27403—2008 的要求。

　　5 检测用引物和探针

　　质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针，反刍动物通用引物探针，以及 13 种特异性引物和探针序列参见附录 A 中表 A. 1 。

　　6 试剂

　　6. 1 Taq DNA 聚合酶。

　　6.2 10 × PCR 缓冲液。

　　6 . 3 dNTPs ( dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 。

　　6 . 4 琼脂糖。

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　　6 . 5 溴化乙锭。

　　6 . 6 酚 。

　　6 . 7 三氯甲烷。

　　6 . 8 异丙醇。

　　6 . 9 无水乙醇。

　　6 . 10 异戊醇 。

　　6. 1 1 分子量标准品(最小片段 ≥20 bp,最大片段 ≤2 000 bp)。

　　6. 12 TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 , 1 mmol/L EDTA)。

　　6. 13 电泳缓冲液(10 × TBE: Tris 54 g,硼酸 27.5 g, 20 mL 0.5 mol/L EDTA · Tris-HCl, pH 8.0,加水至 1 000 mL; 50 × TAE: Tris 242 g, 100 mL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0,冰乙酸，57.1 mL,加水至 1 L)。

　　6. 14 加样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)。

　　6. 15 非磁性微球(微球直径 5.6 μm,羧基修饰，按比例掺入 660 nm 和 730 nm 两种分类荧光染色，每种荧光有 10 种浓度，根据比例不同可以把球型基质分类为 100 种)。

　　6 . 16 0 . 1 mol/ L MES溶液 。

　　6. 17 EDC溶液(10 mg/mL)。

　　6 . 18 0 . 02% Tween-20 。

　　6 . 19 0 . 1% SDS 。

　　6 . 20 SA-PE溶液。

　　6.2 1 TMAC溶液( 5 mol/L TMAC, 20% N-月桂酰肌氨酸，1 mol/L Tris-HCl, pH 8. 0 , 0. 5 mol/L EDTA, pH 8.0)。

　　6.22 CTAB 提取液(20 g/L CTAB ,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2 EDTA,pH 8.0)。

　　6 . 23 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 实验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。

　　7 仪器设备

　　7 . 1 PCR仪 。

　　7 . 2 液相芯片仪。

　　7 . 3 恒温箱。

　　7.4 离心机：离心力 15 000 g。

　　7.5 微量移液器：0.5 μL~10 μL, 10 μL~100 μL, 20 μL~200 μL, 200 μL~1 000 μL。

　　7 . 6 核酸蛋白分析仪。

　　7.7 天平：感量 0.01 mg。

　　8 样品采集与制备

　　8 . 1 样品采集与前处理

　　采样、送样要求应符合 GB/T 14699.1 和 SN/T 3561 的规定。按照 8.1~8.2 进行前处理，处理后的

　　样品分成三等份，包括检样、复检样和贮存样。

　　8 . 2 肉、皮张、内脏等

　　先依次用 70%乙醇和 ddH2 O 冲洗 2 次~3 次，洗去外源成分和调料等，控干水分，搅碎，收集到干净 50 mL离心管或干净密封袋中，冻存于-20 ℃。

　　8 . 3 乳、饲料等

　　混匀后直接分装到干净 50 mL离心管或干净密封袋中，根据样品种类贮存于-20 ℃或 4 ℃。

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　　9 检验步骤

　　9 . 1 DNA提取

　　称取 1 g~2 g 处理好的样品于 50 mL离心管中，加入 2 mL~5 mL CTAB 提取液，加入 20 μL~

　　100 μL 的 20 mg/mL蛋白酶 K, 65 ℃温育 1 h,期间不时震荡混匀，应保证样品 自由悬浮于液体中，必要时再加入适量 CTAB提取缓冲液。室温 12 000 g离心 10 min,转移上清至 2 mL 离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1)颠倒混匀，室温 12 000 g转速下离心 10 min。转移上清液至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24 ∶ 1) ,颠倒混匀，室温下 12 000 g 离心10 min;转移上清至干净离心管中;加入等体积的 CTAB 沉淀液混匀，室温沉淀 1 h。加入 0.8 倍体积的异丙醇或 2 倍体积-20 ℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20 ℃放置 30 min~1 h, 12 000 g 4 ℃离心10 min,弃上清，用 70%乙醇洗涤沉淀一次，12 000 g 4 ℃离心 10 min,弃上清，室温下晾干。加入

　　50 μL~100 μL灭菌双蒸水，室温 10 min,混匀，- 20 ℃保存。也可用等效 DNA 提取试剂盒提取模板 DNA。

　　9 . 2 DNA定量

　　取 10 μL DNA溶液加蒸馏水稀释至 1 mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm和 280 nm 处的吸光值。DNA 的浓度按照式(1)计算，当 OD260/OD280 比值在 1.7~2.1 之间时，适宜于 PCR 扩增。扩增前将所有样品 DNA 调至约 5 ng/μL~50 ng/μL。

　　c= ……………………( 1 )

　　式中：

　　c—DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/μL) ;

　　A— 260 nm 处的吸光值;

　　N— 核酸稀释倍数。

　　9 . 3 PCR扩增

　　9 . 3 . 1 PCR体系

　　反应体系总体积为 25 μL,其中包含：10 × PCR 缓冲液 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTP 2 μL,单一待检目标动物成分的上、下游引物(根据检测 目标物种确定)各 0.5 μL(引物浓度 10 μmol/L) , 5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.2 μL, 5 μL DNA模板(5 ng/μL~50 ng/μL),用灭菌双蒸水补足体积至 25 μL。

　　9 . 3 . 2 PCR参数

　　95 ℃预变性 10 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30 个循环(其中哺乳动物 40 个循环);72 ℃延伸 5 min; 4 ℃保存。

　　9 . 4 液相芯片检测

　　9 . 4 . 1 探针与微球偶联

　　取出微球存储管以最高转速涡旋 30 s,超声处理 15 s。选一种微球 50 μL~ 1. 5 mL 离心管中， 10 000 g离心 2 min,弃上清，用 50 μL 0.1 mol/L MES(pH 4.5)重悬微球，彻底涡旋使微球分散成均匀的悬浊液状态，加入一种 0.5 μL 预先稀释好的(0.05 nmol)探针。制备新鲜的 EDC 溶液(10 mg/mL) ,取 2.5 μL EDC 至微球中，彻底混匀，室温避光摇动 30 min,重复此步骤一次。加入 1 mL 0.1% SDS,低速涡旋混匀，12 000 g 离心 2 min,小心移除上清，再加入 1 mL 0. 02% Tween-20 ,低速涡旋重悬，

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　　12 000 g离心 2 min,小心移除上清，最后用 75 μL TE缓冲液重悬微球，4 ℃避光保存。

　　9 . 4 . 2 杂交反应

　　9 . 4 . 2 . 1 单微球探针

　　取样品的 PCR产物 5 μL 于 45 μL 的无菌水中，涡旋混匀。将单一成分微球探针涡旋重悬，与 PCR产物反应。反应体系为：微球 0. 5 μL, PCR 产物 1 μL, 1. 5 × TMAC 33 μL,用 1 × TE 15. 5 μL 调至50 μL,热反应条件为：95 ℃ 5 min, 60 ℃ 10 min, 4 ℃保存。

　　9 . 4 . 2 . 2 多微球探针

　　取样品的 PCR产物 5 μL 于 45 μL 的无菌水中，涡旋混匀。将每一种微球探针均涡旋重悬，与 PCR产物反应。反应体系为：每一种微球探针 0.5 μL,每一种 PCR产物 1 μL, 1.5 × TMAC 33 μL,用 1 × TE 15.5 μL 调至 50 μL。热反应条件为：95 ℃ 5 min, 60 ℃ 10 min, 4 ℃保存。

　　9 . 4 . 3 上机检测

　　将杂交产物转到无菌抽滤板中，抽干，同时记录杂交体系对应孔位置。将 SA-PE 用 1 × TE 稀释到4 ng/μL,每孔加入 50 μL,避光震荡 2 min,再室温震荡 5 min。抽干滤孔板，用 125 μL TE 洗三次，用

　　125 μL TE 重悬。用矫正液矫正液相芯片仪，将上述处理好的样品上机检测。

　　10 质量控制

　　检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、质控对照、空白对照。 分别以 目标引物探针对应的动物物种的肌肉或 DNA溶液作为阳性对照，以提取的植物组织(大豆等任一植物)或 DNA 溶液作为阴性对照，用质控探针作检测体系的质控对照，用无菌双蒸水作空白对照。 对照样品按照 9 . 1 步骤提取 DNA,也可使用购买的 DNA溶液作为阳性或阴性对照。 所有样品设 3 个重复，以荧光强度中位值的平均值作为样品读数。

　　1 1 结果判定与表述

　　1 1 . 1 结果判定

　　1 1 . 1 . 1 质控探针荧光强度中位值大于或等于空白对照 20 倍 。

　　1 1 . 1 . 2 阳性对照荧光强度中位值大于阈值(各成分阈值设定参见附录 A 中表 A. 2) 。

　　1 1 . 1 . 3 阴性对照荧光强度中位值低于阈值。

　　1 1 . 1 . 4 在满足上述结果条件下，如果样品荧光强度中位值大于或等于阈值，判定为阳性;如果低于阈值，判定为阴性。

　　1 1 . 2 结果表述

　　1 1 . 2 . 1 样品检测结果阳性，表述为该样品中含有某某成分。

　　1 1 . 2 . 2 样品检测结果阴性，表述为该样品中某某成分含量低于检测线。

　　12 检测过程中防止交叉污染的措施

　　按照 GB/T 27403—2008 中附录 D 的规定执行。

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　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　常见畜禽动物成分液相芯片扩增引物探针序列及检测阈值

　　表 A. 1 注明了本标准所使用的哺乳动物、反刍动物、骆驼、马、驴、牦牛、水牛、狗、猪、马鹿、羊、鸡、鸭、大鼠、小鼠成分检测的引物探针序列，以及靶基因名称。 表 A. 2 规定了各靶标的检测信号阈值。

　　表 A.1 引物和探针序列

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　　表 A.1(续)

　　表 A.2 探针检测阈值