GB/T 25876-2010 牛早期胚胎性别的鉴定 巢式PCR法

　　ICS 65. 020. 30 B 43

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 25876—2010

　　牛早期胚胎性别的鉴定 巢式 PCR法

　　Method ofnested PCR forsex identification ofearly cattleembryo

　　2011-01-10发布 2011-06-01实施

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 25876—2010

　　前 言

　　本标准的附录 B为规范性附录 , 附录 A为资料性附录 。

　　本标准由中华人民共和国农业部提出 。

　　本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归 口 。

　　本标准起草单位 :华中农业大学 。

　　本标准主要起草人 :张淑君 、杨利国 、李翔 、刘辉 、刘文举 、胡修忠 。

　　Ⅰ

　　GB/T 25876—2010

　　牛早期胚胎性别的鉴定 巢式 PCR法

　　1 范围

　　本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式 PCR方法 。

　　本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。凡是注 日期的引用文件 ,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准 ,然而 ,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注日期的引用文件 ,其最新版本适用于本标准 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本标准 。

　　3. 1

　　巢式 PCR nested polymerasechain reaction

　　利用两套 PCR 引物(巢式 PCR 引物对)进行两轮 PCR 扩增反应 ,在第一轮扩增中 ,外引物用以产生扩增产物 ,此产物在内引物的存在下 ,作为 DNA模板 ,进行第二轮扩增 。

　　3. 2

　　SRY基因 SRY gene

　　哺乳动物 Y染色体上决定雄性性别的基因 。

　　3. 3

　　HBB基因 HBB gene

　　β珠蛋白基因 ,位于常染色体上 。

　　4 原理

　　利用巢式 PCR反应的敏感性高和特异性强的特性 ,对少量胚胎细胞的 SRY基因片段进行扩增 , 以HBB基因的扩增作为阳性参照 , 电泳检测 PCR扩增产物 ,根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别 。

　　5 引物

　　SRY1

　　5/CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 3/ 5/AGCCCAAACCCATCAACCTA 3/

　　SRY2

　　5/CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3/

　　5/TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA 3/

　　HBB

　　5/TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 3/

　　1

　　GB/T 25876—2010

　　5′GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 3′

　　6 试剂和仪器

　　6. 1 主要试剂

　　水应符合 GB/T 6682中灭菌双蒸水的要求 。

　　TaqDNA 聚合酶及 PCR缓冲液 、100 bp梯度 DNA标记物 。

　　TE缓冲液 、TAE缓冲液 、加样缓冲液 、溴化乙锭等 。具体制备方法参见附录 A。

　　6. 2 主要仪器

　　冷冻离心机 、梯度 PCR仪 、电泳仪 、凝胶成像系统、pH 计 、电子天平 、恒温水浴锅 、双蒸馏水器 、微量移液器 。

　　7 检测方法

　　7. 1 试样的制备与保存

　　从待检胚胎中分离 4个(或 4个以上)细胞 ,用无菌超纯水冲洗 3 次后 ,放入 0. 5 mL PCR 管中 ,加入 10μL无菌超纯水 ,100℃煮沸 10min~ 15min,立即置于碎冰中 ,冷却后 4℃离心(8228g)5min,取上清液保存于 4 ℃冰箱中备用 。

　　7. 2 SRY基因片段 PCR扩增

　　第一次扩增体系为 20 μL:0. 8 mmol/L的 dNTP、2U 的 TaqDNA 聚合酶 、0. 2 μmol/L的 SRY基因外引物 SRY1和内参照引物 HBB、10×PCR缓冲液 、2. 5 mmol/L的氯化镁 ,加适量双蒸水 ; 反应程序为 95 ℃预变性 5 min,94℃变性 30 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,20个循环结束后 ,72 ℃再延伸10 min,4 ℃保温 2 min~ 10 min。

　　取第一次 PCR扩增产物 8 μL,作为第二次扩增模板 , 同时加入 10× PCR 缓冲液 、2. 5 mmol/L的氯化镁 、0. 8 mmol/L 的 dNTP 1. 6 μL, 2U 的 Taq DNA 聚 合 酶 、0. 2 μmol/L 的 SRY 基 因 内 引 物SRY2和内参照引物 HBB、适量的双蒸水至 20 μL;反应程序为 95 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,34个循环后 ,72 ℃再延伸 10 min,4 ℃保温 2 min~ 10 min。

　　7. 3 结果判定

　　取 5 μLPCR扩增产物 ,1. 0% ~ 1. 5%琼脂糖凝胶电泳(3V/cm~ 5 V/cm , 电泳 20min~ 30min) ,溴化乙锭染色 ,凝胶成像系统检查 , 电泳图谱见附录 B 中的图 B. 1。

　　电泳图谱中出现 558bp(HBB扩增产物)和 219bp(SRY扩增产物)条带 ,判定为雄性胚胎 ; 电泳图谱中只出现 558bp条带 ,判定为雌性胚胎 。

　　2

　　GB/T 25876—2010

　　附 录 A

　　(资料性附录)

　　试剂和材料

　　表 A. 1 试剂和材料

　　试剂

　　配方

　　TE缓冲液

　　10 mmol/LTris-HCl(pH 8. 0) ,1 mmol/LEDTA(pH 8. 0)

　　10×PCR缓冲液

　　200 mmol/LTris-HCl(pH 8. 4) ,200 mmol/L氯化钾 ,100 mmol/L硫酸铵 ,15 mmol/L氯化镁

　　琼脂糖电泳缓冲液

　　242. 28 gTris碱 ,57. 1 mL冰 乙 酸 , 100 mL 0. 5 mol/L EDTA(pH 8. 0) , 加 双 蒸 水 定 容 至1 000 mL,使用时 50倍稀释

　　加样缓冲液

　　0. 25%溴酚蓝(质量浓度) ,40%蔗糖(质量浓度) 。

　　溴化乙锭

　　100 mL双蒸水中加入 0. 1 g 溴化乙锭 ,搅拌使完全溶解 ,转入棕色试剂瓶 ,锡箔包裹 、备用

　　GB/T25876—2010

　　GB T 25876— 2010

　　附 录 B

　　(规范性附录)

　　/

　　SRY基因和内参基因巢式 PCR产物电泳图谱与结果判断示意图

　　M 为 100 bp梯度 DNA标记物 ;

　　泳道 1~ 4 均为雌性胚胎样本 ,检出 558bp条带 ;

　　泳道 5~ 8均为雄性胚胎样本 ,检出 558bp和 219bp两个条带 。

　　图 B. 1 SRY基因和内参基因巢式 PCR产物电泳图谱与结果判读示意图