GB/T 46661-2025 细胞分选用磁珠性能检测方法

　　ICS 07. 080 CCS A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46661—2025

　　细胞分选用磁珠性能检测方法

　　Magneticbeadsperformancedetection methodsforcellseparation

　　2025-10-31发布 2026-05-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46661—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 标本 2

　　6 粒度 2

　　7 超顺磁性 2

　　8 磁回收率 3

　　9 无菌检查 3

　　10 内毒素检测 3

　　11 体外细胞毒性 3

　　12 细胞活率 4

　　13 细胞纯度 5

　　14 细胞得率 6

　　附录 A (资料性) 无菌检查 8

　　附录 B (资料性) 内毒素检测 13

　　附录 C (资料性) 培养基和试剂 16

　　参考文献 21

　　Ⅰ

　　GB/T 46661—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 :北京市科学技术研究院分析测试研究所(北京市理化分析测试中心) 、吉林大学 、中国测试技术研究院生物研究所 、兰州百源基因技术有限公司 、南京金斯瑞生物科技有限公司 、北京市科学技术研究院 、苏州海狸生物医学工程有限公司 、北京勤邦科技股份有限公司 、北京大学 、长春医学高等专科学校 、北京牛牛基因技术有限公司 、四川大学 、烟台至公生物医药科技有限公司 、迈克生物股份有限公司 、深圳市易瑞生物技术股份有限公司 、清华大学 、瑞孚迪生物医学(上海)有限公司 、利德健康科技(广州)有限公司 。

　　本文件主要起草人 :杜美 红 、洪 甜 、高 德 江 、周 李 华 、车 团 结 、李 静 雯 、王 嘉 玮 、杨 寅 、陈 尔 凝 、管 笛 、魏玲 、赵璐璐 、程小艳 、高原 、池 海 涛 、彭 颖 静 、万 宇 平 、谭 焕 然 、王 兆 芹 、吴 小 胜 、梁 芳 慧 、刘 静 、陈 婉 婷 、牛刚 、郭刚 、洪超 、任辉 、郑晓玲 、焉丽波 、郝利云 、王怡 、龙腾镶 、王炳志 、胡璨鑫 、付辉 、张峰 、吴金玲 。

　　Ⅲ

　　GB/T 46661—2025

　　细胞分选用磁珠性能检测方法

　　1 范围

　　本文件描述了细胞分选用磁珠的性能检测方法 。

　　本文件适用于具有超顺磁性且表面固定有抗体或链霉亲和素等生物活性分子的细胞分选用磁珠的性能检测 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 16886. 5—2017 医疗器械生物学评价 第 5部分 :体外细胞毒性试验

　　GB/T 19077 粒度分析 激光衍射法

　　GB/Z 26082 纳米材料直流磁化率(磁矩)测量方法

　　GB/T 29022 粒度分析 动态光散射法(DLS)

　　GB/T 30902 无机化工产品 杂质元素的测定 电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES) GB/T 38506—2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法

　　GB/T 39729 细胞纯度测定通用要求 流式细胞测定法

　　GB/T 40268—2021 免疫磁性材料性能检测方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　细胞活率 cellviability

　　活细胞数目占总细胞数目的百分比 。

　　3.2

　　设门 gating

　　在流式图分析过程中 ,选取特定细胞群的操作 。

　　3.3

　　细胞纯度 cellpurity

　　目标细胞数目占总细胞数目的百分比 。

　　3.4

　　细胞得率 cellyield

　　分选后获得的目标细胞数目占分选前的目标细胞数目的百分比 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　1

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　　AO: 吖啶橙(acridine orange)

　　CFU :菌落形成单位(colony-forming unit)

　　DMSO:二甲基亚砜(dimethylsulfoxide)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

　　EU : 内毒素单位(endotoxin unit)

　　FSC:前向角散射光(forward scatter)

　　ICP-OES: 电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasmaopticalemission spectrometry)

　　MTT:噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]

　　MVD:最大有效稀释倍数(maximum validdilution)

　　PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)

　　PI:碘化丙啶(propidium iodide)

　　SSC:侧向角散射(side scatter)

　　5 标本

　　优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取 ,如进行上皮型循环肿瘤细胞分选时 ,可使用 MCF-7细胞作为目标细胞 。在需要特殊细胞时 ,如能证明其反应的再现性和精确度 ,应使用直接从活体组织获取的原代细胞等 。

　　6 粒度

　　采用光学分析法检测细胞分选用磁珠的粒度 ,微米级细胞分选用磁珠按照 GB/T 19077 的规定执行 ,纳米级或亚微米级细胞分选用磁珠按照 GB/T 29022的规定执行 。

　　7 超顺磁性

　　7. 1 无柱式

　　取适量细胞分选用磁珠 ,磁分离去除磁珠保护液并干燥至恒重(干燥步骤按照 GB/T 40268—2021中 5. 3 的规定执行) , 取 干 燥 至 恒 重 的 固 体 材 料 , 按 照 GB/Z 26082规 定 的 振 动 样 品 磁 强 计 测 量 方 法执行 。

　　7.2 有柱式

　　7.2. 1 试剂一级水 。

　　7.2.2 设备

　　7.2.2. 1 离心机 :可在 4 ℃条件下进行 20000g 的离心 。

　　7.2.2.2 真空干燥箱 :56 ℃ ±1 ℃ ,压力能保持在 2. 67kPa(20mmHg)以下 。

　　7.2.2.3 电子天平 :分度值为 0. 01 mg。

　　7.2.2.4 振动样品磁强计 。

　　7.2.3 试验步骤和数据处理

　　取适量细胞分选用磁珠 ,在 4 ℃条件下 ,20000g离心约 1. 5 h,待上清液澄清后弃上清液 ,加少量一

　　2

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　　级水混匀磁珠 ,将 混 匀 后 的 磁 珠 转 移 至 已 烘 干 至 恒 重 的 玻 璃 称 量 瓶 中 , 干 燥 至 恒 重 (干 燥 步 骤 按 照GB/T 40268—2021中 5. 3 的规定执行) 。取干燥至恒重的固体材料 ,按照 GB/Z 26082规定的振动样品磁强计测量方法执行 。

　　8 磁回收率

　　8. 1 细胞分选用磁珠的浓度可通过 ICP-OES法检测获得 ,ICP-OES法按照 GB/T 30902的规定执行 ,通过计算磁场作用下分离回收得到的磁珠量与原体系中磁珠总量的百分比获得磁回收率 。

　　8.2 无柱式细胞分选用磁珠的浓度也可采用分光光度法检测 ,按照 GB/T 40268—2021 中第 9 章的规定执行 。

　　9 无菌检查

　　见附录 A。

　　10 内毒素检测

　　见附录 B。

　　11 体外细胞毒性

　　11. 1 原理

　　活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能将外源性 MTT 还原成蓝紫色甲瓒物质 , 甲瓒的生成量与活细胞的增殖呈正相关 。采用含血清培养基对细胞分选用磁珠进行浸提 ,用浸提液进行细胞的体外培养 ,通过酶标分析仪检测甲瓒含量来评估细胞分选用磁珠对细胞的毒性 。

　　11.2 试剂

　　11.2. 1 L929细胞 。

　　11.2.2 血清 。

　　11.2.3 依格尔最低限量基本培养基 。

　　11.2.4 高密度聚乙烯 。

　　11.2.5 PBS工作液 :见 C. 1。

　　11.2.6 DMSO。

　　11.2.7 0. 25%胰蛋白酶溶液(含 EDTA) :见 C. 2。

　　11.2. 8 MTT。

　　11.2.9 异丙醇 :分析纯 。

　　11.3 设备

　　11.3. 1 Ⅱ级生物安全柜 。

　　11.3.2 水浴锅 :37 ℃ ±1 ℃ 。

　　11.3.3 电子天平 :分度值不大于 0. 01 mg。

　　11.3.4 细胞培养箱 :37 ℃ ±1 ℃ ,适当的湿度 ,5%CO2,95%空气 。

　　11.3.5 倒置显微镜 。

　　3

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　　11.3.6 酶标分析仪 :配置 570 nm 和 650 nm 滤光片 。

　　11.3.7 血细胞计数板或自动细胞计数仪 。

　　11.3. 8 细胞培养瓶或细胞培养皿 。

　　11.3.9 96孔细胞培养板 。

　　11.4 试验步骤

　　11.4. 1 根据细胞分选用磁珠与细胞接触时间长短的不同和细胞分选类型的不同 ,将细胞分选用磁珠浸提液的制备方法分为以下 3种 :

　　a) 方法 1(见 11.4.2)适用于与细胞短期(<24h)接触的细胞分选用磁珠 ,浸提条件为 37 ℃±1℃浸提 24h±2h;

　　b) 方法 2(见 11.4. 3)适用于与细胞长期(≥24h)接触的细胞分选用磁珠 ,浸提条件为 37 ℃±1℃浸提 72h±2h;

　　c) 方法 3适用于阴性分选的有柱式细胞分选用磁珠 ,按照 11. 4. 3 的规定执行 ,浸提条件为 37 ℃ ±1 ℃ ,浸提 24h±2h。

　　11.4.2 浸提液的制备方法 1 如下 :

　　a) 空白对照组 :含 10%血清培养基 ;

　　b) 阴性对照组 : 向 10%血清培养基中加入与洗涤后的磁珠相同质量的高密度聚乙烯材料 ;

　　c) 阳性对照组 : 向 10%血清培养基中加入 10% DMSO;

　　d) 细胞分选用磁珠组 :根据细胞分选用磁珠的操作说明确定分选 1×107 个细胞所需的细胞分选用磁珠量 ,取适量细胞分选用磁珠 ,使用 PBS工作液对细胞分选用磁珠进行洗涤(洗涤次数不超过细胞分选前该磁珠应洗涤的次数) ,使用含 10%血清培养基将经洗涤的分选 1× 107 个细胞所需的细胞分选用磁珠稀释至 100 μL(96孔培养板一个孔的浸提液用量) 。

　　浸提结束后 ,对浸提液进行磁分离 , 以获得去除磁珠的浸提液 ,各组分磁分离条件同细胞分选用磁珠组 ,磁分离后的浸提液为各组的 100%浸提液 。

　　11.4.3 浸提液的制备方法 2 如下 :

　　a) 空白对照组 :含 10%血清培养基 ;

　　b) 阴性对照组 :含 10%血清培养基中加入与细胞分选用磁珠相同体积的 PBS工作液 ;

　　c) 阳性对照组 :含 10%血清培养基中加入 10% DMSO;

　　d) 细胞分选用磁珠组 :根据细胞分选用磁珠的操作说明确定分选 1×107 个细胞所需的细胞分选用磁珠量 ,取适量细胞分选用磁珠 ,使用含 10%血清培养基将分选 1× 107 个细胞所需的细胞分选用磁珠稀释至 100 μL(96孔培养板一个孔的浸提液用量) 。

　　浸提结束后 ,各组液体为 100%浸提液 。

　　11.4.4 制备好的浸提液按照 GB/T 16886. 5—2017中附录 C 的规定进行试验 。

　　11.5 试验数据处理

　　按照 GB/T 16886. 5—2017中 C. 2. 5 的规定执行 。

　　12 细胞活率

　　12. 1 原理

　　基于细胞膜的选择透过性原理 ,活细胞的细胞膜完整且具有选择透过性 ,而死细胞或受损细胞的细胞膜通透性增加 。AO 为绿色荧光核酸染料 ,能进入活细胞和死细胞;PI为红色荧光核酸染料 , 只能进入死细胞 。 因此 ,在活细胞中的 AO染料使细胞呈现出绿色荧光 ; 而死细胞中的 AO 和 PI两种染料发

　　4

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　　生能量共振转移 ,使死细胞呈现出红色荧光 。通过使用双荧光通道的细胞计数仪采集图像数据 ,并进行图像处理和分析 ,得出细胞的数量和活率 。

　　12.2 试剂

　　12.2. 1 分选缓冲液 :见 C. 3。

　　12.2.2 AO/PI荧光染料 。

　　12.3 设备

　　12.3. 1 细胞分选用磁珠配套磁分离器 。

　　12.3.2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　12.3.3 双荧光细胞计数仪 :配置 AO/GFP和 PI/RFP荧光通道 。

　　12.4 试验步骤

　　12.4. 1 从标本中获取适量分选前的细胞悬液 ,按照 GB/T 38506—2020 中 5. 1. 1 或 5. 1. 2 的规定测定分选前的细胞悬液的密度 。根据细胞悬液的密度 ,取适量分选前的细胞悬液 ,按照细胞分选用磁珠及其配套试剂的操作说明或设备操作说明进行磁性分选 ,得到分选后的细胞悬液 。

　　12.4.2 预估分选前的细胞悬液或分选后的细胞悬液的细胞密度 ,根据仪器的线性范围 ,适当调整细胞密度 ,取适量细胞悬液 ,加入等体积的 AO/PI荧光染料 ,充分吹打混匀 。细胞和染料混合后应 5 min 内进行测定 。

　　12.4.3 启动细胞计数仪 ,设定细胞类型 ,根据仪器的上样体积要求取适量细胞和染料的混合液加至细胞计数板的一个样品腔内 ,按照仪器操作说明 ,通过图像分析系统 , 自动分析细胞活率 。

　　12.5 试验数据处理

　　按照公式(1)计算细胞活率 :

　　X …………………………( 1 )

　　式中 :

　　X — 细胞活率 ;

　　V — 活细胞数目(如发出绿色荧光的细胞) ,单位为个 ;

　　C — 细胞总数目 ,单位为个 。

　　结果取 3 次平行试验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于 5%) ,计算结果精确到小数点后一位 。

　　13 细胞纯度

　　13. 1 原理

　　通过荧光素标记的单克隆抗体标记待测样品中的目标细胞 ,使用流式细胞仪 ,观测总细胞和目标细胞不同的光学(散射光和荧光)特性 , 实现样本中的总细胞和 目标细胞的区分和计数 , 以获得目标细胞纯度 。

　　13.2 试剂

　　13.2. 1 分选缓冲液 :见 C. 3。

　　13.2.2 荧光素标记的单克隆抗体 :根据目标细胞的特性 ,选择能特异性识别目标细胞的抗体 。

　　5

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　　13.3 设备

　　13.3. 1 细胞分选用磁珠配套磁分离器 。

　　13.3.2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　13.3.3 流式细胞仪 。

　　13.4 试验步骤

　　按照 12. 4. 1规定的磁性细胞分选试验方法进行磁性细胞分选 ,取适量分选前的细胞悬液或分选后的细胞悬液 ,按照 GB/T 39729的规定执行 。

　　13.5 试验数据处理

　　在 FSC/SSC散点图中 ,对除 细 胞 碎 片 外 的 所 有 主 细 胞 设 门 。 在 主 细 胞 散 点 图 中 , 对 目 标 细 胞 设门 。按照 GB/T 39729的规定计算纯度 ,纯度需注明 目标细胞种类和总细胞种类 。结果取 3 次平行试验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于 5%) ,计算结果精确到小数点后一位 。

　　14 细胞得率

　　14. 1 试剂 见 13. 2。

　　14.2 设备

　　14.2. 1 细胞分选用磁珠配套磁分离器 。

　　14.2.2 Ⅱ级生物安全柜 。

　　14.2.3 血细胞计数板或自动细胞计数仪 。

　　14.2.4 流式细胞仪 。

　　14.3 试验步骤

　　14.3. 1 按照 12. 4. 1规定的磁性细胞分选试验方法进行磁性细胞分选 。

　　14.3.2 按照 GB/T 38506—2020中 5. 1. 1 或 5. 1. 2 的规定测定分选前的细胞悬液和分选后的细胞悬液密度 。

　　14.3.3 按照第 13章规定的方法测定分选前的细胞悬液和分选后的细胞悬液纯度 。

　　14.4 试验数据处理

　　按照公式(2)计算细胞得率 :

　　Y = × 100% …………………………( 2 )

　　式中 :

　　Y — 细胞得率 ;

　　ρafter — 分选后的细胞悬液密度 ,单位为个每毫升(个/mL) ;

　　Vafter — 分选后的细胞悬液体积 ,单位为毫升(mL) ;

　　Pafter — 分选后的细胞悬液纯度 ;

　　ρbefore — 分选前的细胞悬液密度 ,单位为个每毫升(个/mL) ;

　　Vbefore — 分选前的细胞悬液体积 ,单位为毫升(mL) ;

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　　Pbefore — 分选前的细胞悬液纯度 。

　　结果取 3 次平行试验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于 10%) ,计算结果精确至小数点后一位 。

　　7

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　　附 录 A (资料性)无菌检查

　　A. 1 概述

　　A. 1. 1 无菌检查系用于检查供试品是否无菌的一种方法 。若供试品符合无菌检查法的规定 ,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染 。

　　A. 1.2 在无菌条件下进行无菌检查 ,试验环境达到无菌检查的要求 ,无菌操作 , 防止微生物污染 , 防止污染的措施不影响供试品中微生物的检出 。定期确认单向流空气区域 、工作台面及受控环境 。定期按相关的要求进行隔离系统的验证 ,其内部环境的洁净度符合无菌检查的要求 。 日常检验时 ,对试验环境进行监测与控制 。

　　A.2 培养基和试剂

　　A.2. 1 硫乙醇酸盐流体培养基 :见 C. 5。

　　A.2.2 胰酪大豆胨液体培养基 :见 C. 6。

　　A.2.3 胰酪大豆胨琼脂培养基 :见 C. 7。

　　A.2.4 沙氏葡萄糖液体培养基 :见 C. 8。

　　A.2.5 沙氏葡萄糖琼脂培养基 :见 C. 9。

　　A.2.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 :见 C. 10。

　　A.2.7 pH 7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 :见 C. 11。

　　A.2. 8 0. 9%无菌氯化钠溶液 :见 C. 12。

　　A.2.9 0. 05%聚山梨酯 80的 pH 7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 。

　　A.2. 10 0. 05%聚山梨酯 80的 0. 9%无菌氯化钠溶液 。

　　A.3 设备

　　A.3. 1 Ⅱ级生物安全柜 。

　　A.3.2 培养箱 :温度范围为 30 ℃ ~ 35 ℃ 、20 ℃ ~ 25 ℃ 。

　　A.3.3 集菌仪 。

　　A.4 试验步骤

　　A.4. 1 培养基的适用性检查

　　每批无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求 。该检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行 。

　　A.4. 1. 1 无菌性检查

　　每批随机取部分培养基 ,置各培养基规定的温度培养 14 d,无菌生长 。

　　A.4. 1.2 灵敏度检查

　　A.4. 1.2. 1 菌种 :培养基灵敏度检查所用菌株传代次数不超过 5代(从菌种保藏中心获得的常用菌种包括以下几种 ,标准菌株为第 0代) ,并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认 , 以保证试验菌株的生物

　　8

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　　学特性 。

　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)〔CMCC(B)26003〕

　　铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)10104〕

　　枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕

　　生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64941〕

　　白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98001〕

　　黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕

　　A.4. 1.2.2 菌液制备 :接种金黄色葡萄球菌 、铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上 , 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中 , 30 ℃ ~ 35℃培养 18h~ 24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上 ,20 ℃ ~ 25 ℃培养 2 d~ 3 d,上述培养物用 pH 7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0. 9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液 。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上 ,20 ℃ ~ 25 ℃培养 5 d~ 7 d或直到获得丰富的孢子 ,加入适量 0. 05%聚山梨酯 80的 pH 7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0. 05%聚山梨酯 80的 0. 9%无菌氯化钠溶液等适宜的稀释液 ,将孢子洗脱 ,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ,用 0. 05%聚山梨酯 80的 pH 7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0. 05%聚山梨酯 80的 0. 9%无菌氯化钠溶液等适宜的稀释液制成适宜浓度的孢子悬液 。

　　A.4. 1.2.3 菌悬液若在室温下放置 ,一般在 2 h 内使用 ;若保存在 2 ℃ ~ 8 ℃可在 24h 内使用 。黑曲霉孢子悬液可保存在 2 ℃ ~ 8 ℃ ,在验证过的贮存期内使用 。

　　A.4. 1.2.4 培养基接种 :取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基 7 管 ,分别接种不大于 100 CFU 的金黄色葡萄球菌 、铜绿假单胞菌 、生孢梭菌各 2 管 ,另 1 管不接种作为空白对照 ;取适宜装量的胰酪大豆胨液体培养基 7管 ,分别接种不大于 100CFU 的枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌 、黑曲霉各 2 管 ,另 1 管不接种作为空白对照 。接种细菌的培养基管培养时间不超过 3 d,接种真菌的培养基管培养时间不超过 5 d。

　　A.4. 1.2.5 结果判定 :空白对照管无菌生长 ,若加菌的培养基管均生长良好 ,判该培养基的灵敏度检查符合规定 。

　　A.4.2 方法适用性试验

　　A.4.2. 1 进行供试品无菌检查时 ,先进行方法适用性试验 , 以确认所采用的方法适合于该供试品的无菌检查 。若检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时 ,重新进行方法适用性试验 。

　　A.4.2.2 方法适用性试验按 B. 4. 3 的规定及下列要求进行操作 。对每一试验菌逐一进行方法确认 。

　　A.4.2.3 菌种及菌液制备 :菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查 。

　　A.4.2.4 薄膜过滤法 :按供试品的无菌检查要求 ,取每种培养基规定接种的供试品总量 ,采用薄膜过滤法过滤 , 冲洗 ,在最后一次冲洗液中加入不大于 100 CFU 的试验菌 ,过滤 。加培养基至滤筒内 ,接种金黄色葡萄球菌 、铜绿假单胞菌 、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基 ;接种枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌 、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基 。另取一装有同体积培养基的容器 ,加入等量试验菌 ,作为对照 。置规定温度培养 ,培养时间不超过 5 d。

　　A.4.2.5 结果判断 : 与对照管比较 ,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好 ,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计 ,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查 。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱 、缓慢或不生长 ,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用 ,宜采用增加冲洗量 、增加培养基用量 、使用中和剂或灭活剂 、更换滤膜品种等方法 ,消除供试品的抑菌作用 ,并重新进行方法适用性试验 。

　　A.4.2.6 方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。

　　A.4.3 供试品的无菌检查

　　A.4.3. 1 供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件与方法适用性试验确认的方法相同 。

　　9

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　　A.4.3. 2 无 菌 试 验 过 程 中 , 若 使 用 表 面 活 性 剂 、灭 活 剂 或 溶 剂 等 , 需 先 证 明 其 有 效 性 , 且 对 微 生 物 无毒性 。

　　A.4.3.3 检验数量 :一次试验所用供试品最小包装容器的数量 ,成品每亚批均进行无菌检查 。 除另有规定外 ,批出厂产品及生物制品的原料和半成品最少检验数量按表 A. 1 规定 ; 上市产品抽检的最少检验数量按表 A. 2规定 。

　　表 A. 1 批出厂产品及生物制品的原料和半成品最少检验数量

　　供试品

　　批产量(N)/个

　　接种每种培养基的最少检验数量

　　注射剂

　　≤100

　　10%或 4个(取较多者)

　　100

　　10个

　　>500

　　2%或 20个(取较少者)

　　20个(生物制品)

　　大体积注射剂(>100mL)

　　—

　　2%或 10个(取较少者)

　　20个(生物制品)

　　冻干血液制品(>5mL)

　　每柜冻干 ≤200

　　5个

　　每柜冻干 >200

　　10个

　　冻干血液制品(≤5mL)

　　≤100

　　5个

　　100

　　10个

　　>500

　　20个

　　眼用及其他非注射产品

　　≤200

　　5%或 2个(取较多者)

　　>200

　　10个

　　单剂量包装的 产 品 ,按 注 射 剂 供 试 品 要求确定最小检验数量

　　—

　　—

　　桶装无菌固体原料

　　≤4

　　每个容器

　　4

　　20%或 4个容器(取较多者)

　　>50

　　2%或 10个容器(取较多者)

　　抗生素固体原料药(≥5g)

　　—

　　6个容器

　　生物制品原液或半成品

　　—

　　每个容器(每个 容 器 制 品 的 取 样 量 为 总量的 0. 1%或 不 少 于 10 mL, 每 开 瓶 一次 ,如上法抽检)

　　体外用诊断制品半成品

　　—

　　每批(抽验量不少于 3 mL)

　　医疗器械

　　≤100

　　10%或 4件(取较多者)

　　100

　　10件

　　>500

　　2%或 20件(取较少者)

　　注 1: 若供试品批产量未知 ,按该类别的最大批产量确定检验数量 。

　　注 2: 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基 ,那么表中的最少检验数量增加相应倍数 。

　　10

　　GB/T 46661—2025

　　表 A.2 上市产品抽检的最少检验数量

　　供试品

　　供试品最少检验数量(瓶或支)

　　液体制剂

　　10

　　固体制剂

　　10

　　血液制品(V<50mL)

　　6

　　血液制品(V≥50mL)

　　2

　　医疗器械

　　10

　　注 1: 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基 ,那么表中的最少检验数量增加相应倍数 。

　　注 2: 抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的最少检验数量为 6瓶(或支) 。桶装固体原料的最少检验数量为 4个包装 。

　　A.4.3.4 最少检验量 :供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量 。 除另有规定外 ,供试品的最少检验量按表 A. 3规定 。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两种培养基 ,则分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基 。采用薄膜过滤法时 ,只要供试品特性允许 ,将所有容器内的内容物全部过滤 。

　　表 A.3 供试品的最少检验量

　　供试品

　　供试品装量

　　每支供试品接入每种培养基的最少量

　　液体制剂

　　V<1 mL

　　全量

　　1 mL≤V≤40 mL

　　半量 ,但少于 1 mL

　　40 mL

　　20 mL

　　V>100 mL

　　10% ,但不少于 20 mL

　　抗生素液体制剂

　　—

　　1 mL

　　需混悬或 乳 化 的 不 溶 性 制 剂 、乳膏剂和软膏剂

　　—

　　取每支供试品 ,总量合计不少于 200 mg

　　固体制剂

　　M<50 mg

　　全量

　　50 mg≤M<300 mg

　　半量 ,但不少于 50 mg

　　300 mg≤M≤5 g

　　150 mg

　　M>5 g

　　500 mg

　　半量(生物制品)

　　生物制品的原液及半成品

　　—

　　半量

　　医疗器械

　　外科用辅料棉花及纱布

　　取 100 mg或 1 cm×3 cm

　　缝合线 、一次性医用材料

　　整个材料a

　　带导管的一次性医疗器械(如输液袋)

　　二分之一内表面积

　　其他医疗器械

　　整个器具a (切碎或拆散开)

　　a 如果医疗器械体积过大 ,培养基用量可在 2 000 mL 以上 ,将其完全浸没 。

　　A.4.3.5 阴性对照 :供试品无菌检查时 ,取相应溶剂和稀释液 、冲洗液同法操作 ,作为阴性对照 。 阴性

　　11

　　GB/T 46661—2025

　　对照生长 。

　　A.4.3.6 实验室基于质量风险管理的要求 ,根据产品特性 、方法适用性试验结果 、人员技能与经验 、数据可靠性 、污染控制措施和实验室质量控制水平等因素 ,综合评估确定日常检验过程中阳性对照试验的必要性 、频次及其他要求 。 阳性对照试验方法同供试品检查 , 加菌量不大于 100 CFU。 阳性对照管培养不超过 5 d,生长良好 。

　　A.4.3.7 供试品处理及接种培养基 :操作时 ,用适宜的方法对供试品容器表面进行彻底消毒 ,如果供试品容器内有一定的真空度 ,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针头)向容器内导入无菌空气 ,再按无菌操作开启容器取出内容物 。

　　A.4.3. 8 除另有规定外 ,按下列方法进行供试品处理及接种培养基 。

　　A.4.3.9 薄膜过滤法 :根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质 ,宜充分考虑供试品的亲水性 、疏水性及其他产品特性(如抗生素)的影响 。无菌检查用滤膜孔径不大于 0. 45 μm。滤膜直径约为 50 mm ,若使用其他尺寸的滤膜 ,对稀释液和冲洗液体积进行调整 ,并重新验证 。使用时 ,保证滤膜在过滤前后的完整性及过滤系统的无菌性 。为发挥滤膜的最大过滤效率 ,注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面 。取规定量 ,直接过滤 ,或混合至含不少于 100 mL适宜稀释液的无菌容器中 ,混匀 ,立即过滤 。适用时 ,水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤 , 以润湿滤膜 。如供试品具有抑菌作用 ,用冲洗液冲洗滤膜 , 冲洗次数一般不少于 3 次 ,所用的冲洗量 、冲洗方法同方法适用性试验 。但即使方法适用性试验证实该方法未能完全消除抑菌性 ,每张滤膜冲洗一般也不超过 5 次 ,每次冲洗量为 100 mL。 冲洗后 ,1份滤器加入硫乙醇酸盐流体培养基 ,1份滤器加入胰酪大豆胨液体培养基 。所用培养基的体积与方法适用性相同 。

　　A.5 结果观察与判断

　　A.5. 1 培养期间定期观察并记录是否有菌生长 。如在加入供试品后或在培养过 程 中 , 培 养 基 出 现 浑浊 ,培养 14 d后 ,不能从外观上判断有无微生物生长 ,可取该培养液不少于 1 mL转种至同种新鲜培养基中 ,将原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于 4 d,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊 ;或取培养液涂片 ,染色 ,镜检 ,判断是否有菌 。

　　A.5.2 若供试品管均澄清 ,或虽显浑浊但经确证无菌生长 ,判供试品符合规定 ;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长 ,判供试品不符合规定 ,除非能充分证明试验结果无效 , 即生长的微生物非供试品所含 。 只有符合下列至少一个条件时方可认为试验无效 。

　　a) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求 。

　　b) 回顾无菌试验过程 ,发现有可能引起微生物污染的因素 。

　　c) 在阴性对照中观察到微生物生长 。

　　d) 供试品管中生长的微生物经鉴定后 ,确证是因无菌试验中所使用的物品和/或无菌操作技术不当引起的 。

　　A.5.3 试验若经评估确认无效后 ,重试 。 重试时 ,重新取同量供试品 ,依无菌检查试验方法进行检查 ,若无菌生长 ,判供试品符合规定 ;若有菌生长 ,判供试品不符合规定 。

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　　GB/T 46661—2025

　　附 录 B (资料性)内毒素检测

　　B. 1 概述

　　本试验系对供试品内毒素进行凝胶限度检测的一种方法 ,本试验操作过程防止内毒素的污染 。

　　B.2 试剂

　　B.2. 1 凝胶法鲎试剂 。

　　B.2.2 细菌内毒素检查用水 : 内毒素含量小于 0. 015EU/mL。

　　B.2.3 细菌内毒素国家标准样品/国家标准物质或细菌内毒素工作标准品 。

　　B.3 设备

　　B.3. 1 恒温水浴锅或干热恒温仪等恒温器 :37 ℃ ±1 ℃ 。

　　B.3.2 旋涡混合器 。

　　B.3.3 无内毒素玻璃反应试管或无内毒素安瓿 。

　　B.3.4 无内毒素吸头或无内毒素移液管 。

　　B.4 试验步骤

　　B.4. 1 确定最大有效稀释倍数(MVD)

　　最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数 ,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测 。按照公式(B. 1)计算得出最大有效稀释倍数(MVD) :

　　MVD …………………………( B. 1 )

　　式中 :

　　L — 细胞分选用磁珠需控制的内毒素限值 , 限值为 2 EU/mL;

　　λ — 凝胶法鲎试剂的标示灵敏度 ,单位为 EU 每毫升(EU/mL) 。

　　B.4.2 鲎试剂灵敏度复核试验

　　B.4.2. 1 在该检查法规定 的 条 件 下 , 使 鲎 试 剂 产 生 凝 集 的 内 毒 素 的 最 低 浓 度 即 为 鲎 试 剂 的 标 示 灵 敏度 ,用 EU/mL表示 。 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时 ,进行鲎试剂灵敏度复核试验 。

　　B.4.2.2 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ) ,将细菌内毒素国家标准样品/标准物质或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解 ,在旋涡混合器上混匀 15 min或参照标准品说明书中的混匀时间进行操作 ,然后制成至少包含 2λ、λ、0. 5λ和 0. 25λ4个浓度的内毒素标准溶液 ,每稀释一步均在旋涡混合器上混匀 30 s或参照标准品说明书中的混匀时间进行操作 。取不同浓度的内毒素标准溶液 ,分别与等体积(如 0. 1 mL)的鲎试剂溶液混合 ,每一个内毒素浓度平行做 4 管 ;另外取 2 管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照 。将试管中溶液轻轻混匀后 ,封闭管 口 ,垂直放入 37 ℃ ±1 ℃的恒温器中 ,保温 60 min±2 min。

　　B.4.2.3 将试管从恒温器中轻轻取出 ,缓缓倒转 180°,若管内形成凝胶 ,并且凝胶不变形 、不从管壁滑

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　　GB/T 46661—2025

　　脱者为阳性 ;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 、变形并从管壁滑脱者为阴性 。保温和拿取试管过程不宜受到振动 ,造成假阴性结果 。

　　B.4.2.4 当最低浓度管均为阴性 , 阴性对照管为阴性 ,试验方为有效 。按照公式(B. 2) 计算反应终点浓度的几何平均值 , 即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc) 。

　　式中 :

　　λc = antilg(∑X/n) …………………………( B. 2 )

　　X — 反应终点浓度的对数值(lg) 。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度 ;

　　n — 为每个浓度的平行管数 。

　　B. 4.2.5 当 λc 为 0. 5λ~ 2λ(包括 0. 5λ和 2λ)时 ,方可用于细菌内毒素检查 ,并以标示灵敏度 λ 为该批鲎试剂的灵敏度 。

　　B.4.3 干扰试验

　　B.4.3. 1 按表 B. 1 制备溶液 A、B、C 和 D,使用的供试品溶液为未检验出内毒素且不超过 MVD 的溶液 ,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 ,并计算溶液 C 和溶液 B 的反应终点浓度的几何平均值 。

　　表 B. 1 凝胶检测技术干扰试验溶液的制备

　　编号

　　内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

　　稀释用液

　　稀释倍数

　　所含内毒素的浓度

　　平行管数

　　A

　　无/供试品溶液

　　—

　　—

　　—

　　2

　　B

　　2λ/供试品溶液

　　供试品溶液

　　1

　　2

　　4

　　8

　　2λ

　　1λ 0. 5λ

　　0. 25λ

　　4

　　4

　　4

　　4

　　C

　　2λ/检查用水

　　检查用水

　　1

　　2

　　4

　　8

　　2λ

　　1λ 0. 5λ

　　0. 25λ

　　2

　　2

　　2

　　2

　　D

　　无/检查用水

　　—

　　—

　　—

　　2

　　注 : A为供试品溶液 ,B为干扰试验系列 ,C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 ,D为阴性对照 。

　　B.4.3.2 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性 ,并且系列溶液 C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时 ,试验方为有效 。 当系列溶液 B 的结果为 0. 5λ~2λ(包括 0. 5λ和 2λ)时 ,认为供试品在该浓度下无干扰作用 。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用 。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰 ,将供试品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀释 ,再重复干扰试验 。

　　B.4.3.3 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤 、中和 、透析或加热处理等)排除干扰 。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性 ,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验 。

　　B.4.3.4 当进行细胞分选 用 磁 珠 的 内 毒 素 检 查 试 验 前 , 或 无 内 毒 素 检 查 项 的 品 种 建 立 内 毒 素 检 查 法时 ,进行干扰试验 。

　　B.4.3.5 当鲎试剂 、供试品的处方 、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时 ,重新进行干扰试验 。

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　　GB/T 46661—2025

　　B.4.4 凝胶限度法

　　按表 B. 2 制备溶液 A、B、C 和 D。使用稀释倍数不超过 MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 。

　　表 B.2 凝胶限度试验溶液的制备

　　编号

　　内毒素浓度/配置内毒素的溶液

　　平行管数

　　A

　　无/供试品溶液

　　2

　　B

　　2λ/供试品溶液

　　2

　　C

　　2λ/检查用水

　　2

　　D

　　无/检查用水

　　2

　　注 : A为供试品溶液 ,B为供试品阳性对照 ,C 为阳性对照 ,D为阴性对照 。

　　B.5 结果观察与判断

　　B.5. 1 若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性 ,供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性 , 阳性对照溶液 C 的平行管均为阳性 ,试验有效 。

　　B.5.2 若溶液 A 的两个平行管均为阴性 ,判定供试品符合规定 。若溶液 A 的两个平行管均为阳性 ,判定供试品不符合规定 。若溶液 A 的两个平行管中的一管为阳性 ,另一管为阴性 ,需进行复试 。 复试时溶液 A需做 4支平行管 ,若所有平行管均为阴性 ,判定供试品符合规定 ,否则判定供试品不符合规定 。

　　B.5.3 若供试品的稀释倍数小于 MVD而溶液 A结果出现不符合规定时 ,可将供试品稀释至 MVD重新试验 ,再对结果进行判断 。

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　　GB/T 46661—2025

　　附 录 C (资料性)

　　培养基和试剂

　　C. 1 PBS工作液

　　C. 1. 1 成分

　　PBS工作液的成分及含量见表 C. 1。

　　表 C. 1 PBS工作液的成分及含量

　　成分

　　含量

　　氯化钠(NaCl)

　　8. 00 g

　　氯化钾(KCl)

　　0. 20 g

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 )

　　0. 24 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 )

　　1. 44 g

　　一级水

　　1 000 mL

　　C. 1.2 制法

　　将 C. 1. 1 中各种成分混匀 ,调节 pH 为 7. 3±0. 1,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C.2 0. 25%胰蛋白酶溶液(含 EDTA)

　　C.2. 1 成分

　　0. 25%胰蛋白酶溶液(含 EDTA)的成分及含量见表 C. 2。

　　表 C.2 0. 25%胰蛋白酶溶液(含 EDTA)的成分及含量

　　成分

　　含量

　　胰蛋白酶干粉

　　2. 5 g

　　乙二胺四乙酸二钠二水合物(C10 H14N2 Na2 O8 · 2H2 O)

　　0. 2 g

　　酚红/不含酚红

　　0. 01 g/0 g

　　PBS工作液(见 C. 1)

　　1 000 mL

　　C.2.2 制法

　　将 C. 2. 1 中各种成分混匀 ,调节 pH 为 7. 3±0. 1,0. 22 μm 滤膜过滤除菌 。

　　C.3 分选缓冲液

　　C.3. 1 成分

　　分选缓冲液的成分及含量见表 C. 3。

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　　GB/T 46661—2025

　　表 C.3 分选缓冲液的成分及含量

　　成分

　　含量

　　0. 5 mol/LEDTA(pH 为 8. 0)(见 C. 4)

　　4 mL

　　胎牛血清/人血清

　　20 mL

　　(或牛血清白蛋白/人血清白蛋白)

　　(5g)

　　PBS工作液(见 C. 1)

　　976 mL(996mL)

　　C.3.2 制法

　　将 C. 3. 1 中各种成分混匀 ,0. 22 μm 滤膜过滤除菌 ,现配现用 。

　　C.4 0.5 mol/LEDTA(pH为 8. 0)

　　C.4. 1 成分

　　0. 5 mol/LEDTA(pH 为 8. 0)的成分及含量见表 C. 4。

　　表 C.4 0.5 mol/LEDTA(pH为 8. 0)的成分及含量

　　成分

　　含量

　　乙二胺四乙酸二钠二水合物(C10 H14N2 Na2 O8 · 2H2 O)

　　186. 1 g

　　一级水

　　1 000 mL

　　C.4.2 制法

　　将 C. 4. 1 中各种成分混匀 ,使用氢氧化钠(约 20 g)调节 pH 为 8. 0±0. 1,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C.5 硫乙醇酸盐流体培养基

　　C.5. 1 成分

　　硫乙醇酸盐流体培养基的成分及含量见表 C. 5。

　　表 C.5 硫乙醇酸盐流体培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　胰酪胨

　　15. 0 g

　　酵母浸出粉

　　5. 0 g

　　葡萄糖/无水葡萄糖

　　5. 5 g/5. 0 g

　　L-胱氨酸

　　0. 5 g

　　硫乙醇酸钠/硫乙醇酸

　　0. 5 g/0. 3 mL

　　氯化钠(NaCl)

　　2. 5 g

　　新配置的 0. 1%刃天青溶液

　　1. 0 mL

　　琼脂

　　0. 75 g

　　纯水

　　1 000 mL

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　　GB/T 46661—2025

　　C.5.2 制法

　　取 L-胱氨酸 、琼脂 、氯化钠 、葡萄糖 、酵母浸出粉和胰酪胨与水混合 ,微温溶解 ,加入硫乙醇酸钠或硫乙醇酸 ,必要时用 1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH ,使灭菌后在 25 ℃的 pH 为 7. 1±0. 2。如需过滤 ,可重新加热上述溶液 ,但不煮沸 ,趁热过滤 。加入刃天青溶液 ,混匀 ,分装至适宜的容器中 ,其装量与容器高度的比例符 合 培 养 结 束 后 培 养 基 氧 化 层 (粉 红 色) 不 超 过 培 养 基 深 度 的 1/2。 121 ℃高 压 灭 菌15 min。在供试品接种前 ,培养基氧化层的高度不超过培养基深度的 1/3,否则 ,经水浴或流通蒸汽加热至粉红色消失(不超过 20 min) ,迅速冷却 ,只限加热一次 ,并防止被污染 。

　　C.6 胰酪大豆胨液体培养基

　　C.6. 1 成分

　　胰酪大豆胨液体培养基的成分及含量见表 C. 6。

　　表 C.6 胰酪大豆胨液体培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　胰酪胨

　　17. 0 g

　　大豆木瓜蛋白酶水解物

　　3. 0 g

　　葡萄糖/无水葡萄糖

　　2. 5 g/2. 3 g

　　氯化钠(NaCl)

　　5. 0 g

　　磷酸氢二钾(K2 HPO4 )

　　2. 5 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C.6.2 制法

　　取 C. 6. 1成分 ,混合 ,微温溶解 ,冷却至室温 ,用 1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH 使胰酪大豆胨液体培养基灭菌后在 25 ℃的 pH 为 7. 3±0. 2,必要时滤清 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C.7 胰酪大豆胨琼脂培养基

　　C.7. 1 成分

　　胰酪大豆胨琼脂培养基的成分及含量见表 C. 7。

　　表 C.7 胰酪大豆胨琼脂培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　胰酪胨

　　15. 0 g

　　大豆木瓜蛋白酶水解物

　　5. 0 g

　　氯化钠(NaCl)

　　5. 0 g

　　琼脂

　　15. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

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　　GB/T 46661—2025

　　C.7.2 制法

　　除琼脂外 ,取 C. 7. 1成分 ,混合 ,微温溶解 ,调节 pH使胰酪大豆胨液体培养基灭菌后在 25 ℃的 pH为 7. 3±0. 2,加入琼脂 ,加热溶化后 ,摇匀 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C. 8 沙氏葡萄糖液体培养基

　　C. 8. 1 成分

　　沙氏葡萄糖液体培养基的成分及含量见表 C. 8。

　　表 C. 8 沙氏葡萄糖液体培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物

　　10. 0 g

　　葡萄糖

　　20. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C. 8.2 制法

　　除葡萄糖外 ,取 C. 8. 1成分 ,混合 ,微温溶解 ,调节 pH 使沙氏葡萄糖液体培养基灭菌后在 25 ℃的pH 为 5. 6±0. 2,加入葡萄糖 ,摇匀 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C.9 沙氏葡萄糖琼脂培养基

　　C.9. 1 成分

　　沙氏葡萄糖琼脂培养基的成分及含量见表 C. 9。

　　表 C.9 沙氏葡萄糖琼脂培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物

　　10. 0 g

　　葡萄糖

　　40. 0 g

　　琼脂

　　15. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C.9.2 制法

　　除葡萄糖 、琼脂外 ,取 C. 9. 1 成 分 , 混 合 , 微 温 溶 解 , 调 节 pH 使 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 灭 菌 后 在25 ℃的 pH 为 5. 6±0. 2,加入琼脂 ,加热溶化后 ,再加入葡萄糖 ,摇匀 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C. 10 马铃薯葡萄糖琼脂培养基

　　C. 10. 1 成分

　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基的成分及含量见表 C. 10。

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　　GB/T 46661—2025

　　表 C. 10 马铃薯葡萄糖琼脂培养基的成分及含量

　　成分

　　含量

　　马铃薯(去皮)

　　200 g

　　葡萄糖

　　20. 0 g

　　琼脂

　　15. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C. 10.2 制法

　　取马铃薯 ,切成小块 ,加水 1 000 mL,煮沸 20 min~ 30 min,用 6层 ~ 8层纱布过滤 ,取滤液补水至1 000 mL,调节 pH使马铃薯葡萄糖琼脂培养基灭菌后在 25 ℃的 pH 为 5. 6±0. 2,加入琼脂 ,加热溶化后 ,再加入葡萄糖 ,摇匀 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C. 11 pH 7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(稀释液、冲洗液)

　　C. 11. 1 成分

　　pH 7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(稀释液 、冲洗液)的成分及含量见表 C. 11。

　　表 C. 11 pH 7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(稀释液、冲洗液)的成分及含量

　　成分

　　含量

　　磷酸二氢钾(KH2PO4 )

　　3. 56 g

　　磷酸氢二钠(Na2 HPO4 )

　　5. 77 g

　　氯化钠(NaCl)

　　4. 3 g

　　蛋白胨

　　1. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C. 11.2 制法

　　取 C. 11. 1成分 ,混合 ,微温溶解 ,必要时滤清 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　C. 12 0. 9%无菌氯化钠溶液(稀释液、冲洗液)

　　C. 12. 1 成分

　　0. 9%无菌氯化钠溶液(稀释液 、冲洗液)的成分及含量见表 C. 12。

　　表 C. 12 0. 9%无菌氯化钠溶液(稀释液、冲洗液)的成分及含量

　　成分

　　含量

　　氯化钠(NaCl)

　　9. 0 g

　　纯水

　　1 000 mL

　　C. 12.2 制法

　　取 C. 12. 1成分 ,混合 ,微温溶解 ,必要时滤清 ,分装 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

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　　GB/T 46661—2025

　　参 考 文 献

　　[1] GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法

　　[2] GB/T 16886. 12—2023 医疗器械生物学评价 第 12部分 :样品制备与参照材料

　　[3] GB/T 41309—2022 纳米技术 纳米材料的内毒素体外测试 鲎试剂法

　　[4] GB/Z43592. 1—2023 纳米技术 磁性纳米材料 第 1 部分 :磁性纳米悬浮液的特性和测量规范

　　[5] WS/T 360—2024 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

　　[6] 国家药典 委 员 会 . 中 华 人 民 共 和 国 药 典 : 2025年 版 . 四 部[M] . 北 京 : 中 国 医 药 科 技 出 版 社 , 2025:227-231.

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