GB/T 46540-2025 纺织品 微生物的测定

　　ICS 59. 080. 01 CCS W 04

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46540—2025

　　纺织品 微生物的测定

　　Textiles—Determination ofmicroorganisms

　　2025-10-31发布 2026-05-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46540—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 样品采集和处理 2

　　5 菌落总数的测定 3

　　6 大肠菌群的测定 6

　　7 金黄色葡萄球菌的测定 10

　　8 白假丝酵母的测定 14

　　9 铜绿假单胞菌的测定 18

　　10 乙型溶血性链球菌的测定 23

　　附录 A (规范性) 培养基和试剂 28

　　附录 B (规范性) LAMP引物 38

　　附录 C (规范性) 实时荧光 PCR 引物和探针 39

　　附录 D (资料性) LAMP、PCR试验阳性结果判定图谱 40

　　Ⅰ

　　GB/T 46540—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中国纺织工业联合会提出 。

　　本文件由全国纺织品标准化技术委员会(SAC/TC209)归 口 。

　　本文件起草单位 :郑州海关技术中心 、中纺标(深圳)检测有限公司 、南京海关纺织工业产品检测中心 、浙江雅琪诺装饰材料有限公司 、南昌海关 、中纺标(浙江)检测有限公司 、嘉庚创新实验室 、宁波海关技术中心 、加佳控股集团有限公司 、海安南通大学高端纺织研究院 、深圳歌力思服饰股份有限公司 、湖南华升株洲雪松有限公司 、中国计量大学 、浙江荣大时尚科技有限公司 、广东启悦未来科技有限公司 、中联品检(东莞)检验技术有限公司 、如鱼得水(杭州)软装定制有限公司 。

　　本文件主要起草人 :郭会清 、李轲 、马鹏飞 、张淑霞 、桂家祥 、谢堂堂 、郑悦 、傅科杰 、丁友超 、禹建鹰 、周宇航 、刘欣 、袁奇宇 、张伟 、楼丹丽 、黄周勇 、张合为 、周虎云 、颜鹰 、黄福开 、盛方明 、朱国权 、陈海洋 。

　　Ⅲ

　　GB/T 46540—2025

　　纺织品 微生物的测定

　　警示:从事微生物检测实验的实验室生物安全管理和设施条件要求应满足 GB 19489 的规定 。 使用本文件的工作人员应有微生物实验室工作的实践经验 ,并有责任采取适当的安全和健康保护措施 , 以符合国家有关法规要求。

　　1 范围

　　本文件描述了纺织品中微生物测定的样品采集和前处理以及纺织品中菌落总数 、大肠菌群 、金黄色葡萄球菌 、白假丝酵母 、铜绿假单胞菌 、乙型溶血性链球菌的测定方法 。

　　本文件适用于各类纺织品 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 36433—2018 纺织品 山羊绒和绵羊毛的混合物 DNA定量分析 荧光 PCR法

　　3 术语和定义

　　GB/T 36433—2018界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　菌落形成单位 colony-forming units;CFU

　　根据固体培养基上形成的菌落数量 ,测定样品中活菌浓度的单位 。

　　3.2

　　环介导恒温扩增 loop-mediated isothermalamplification; LAMP

　　在 60 ℃ ~ 65 ℃ 等温环境下 ,DNA 处于动态平衡状态 ,在此温度下利用 4 种特异引物依靠一种高活性链置换 DNA 聚合酶 ,使 DNA 在短时间内进行核酸扩增的技术 。

　　注 : 反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀 ,通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在 。 3.3

　　实时荧光定量 PCR real-time fluorescence; PCR

　　在 PCR反应体系中加入荧光基团 ,利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR进程 ,再通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的 DNA扩增方法 。

　　[来源 :GB/T 36433—2018,3. 2] 3.4

　　Ct值 cycle threshold

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。

　　[来源 :GB/T 36433—2018,3. 5]

　　1

　　GB/T 46540—2025

　　4 样品采集和处理

　　4. 1 样品采集

　　4. 1. 1 样品的采集 :应采集相同批次 、独立包装 、适量件数样品送检 ,最低采样量应符合 4. 2. 2要求 。

　　4. 1.2 样品标记 :应对采集的样品进行及时 、准确的记录和标记 ,采样人应清晰填写采样单(包括采样人 、采样地点 、时间 、样品名称 、来源 、批号 、数量 、保存条件等信息) 。

　　4.2 样品处理

　　4.2. 1 开启包装

　　4.2. 1. 1 实验室收到样品后 ,应先核对样品状态 、包装完整性 、来源 、贮存信息并记录 。

　　4.2. 1.2 样品袋开启前 ,先将其表面擦干净 ,再用 75%酒精消毒开启部位及其周围 ,保证无菌操作 。

　　4.2.2 样液制备

　　4.2.2. 1 称量法

　　在空气洁净度 5 级净化条件下用无菌方法准确称取 25 g 样品 。 剪碎后加入 225 mL无菌稀释液中 ,用拍击式均质器拍打 1 min~ 2 min,充分混匀 ,制成 1 ∶ 10的样液 。

　　4.2.2.2 多点采样洗脱法

　　在空气洁净度 5 级净化条件下用无菌方法在样品四周和中间均匀布控 5 个采样 点,用 灭 菌 规 格板 ,每个采样点按 4 cm×5 cm(20 cm2 )面积范围剪裁 ,每 20 cm2 采样面积为 1 份检样 ,每件纺织品共采集 5 份检样 ,采样面积为 100 cm2 。将上述采集好的 5 份检样放入盛有 200mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋中 ,用拍击式均质器拍打 1 min~ 2 min,充分混匀 ,制成的样品洗脱液作为样液 。

　　4.2.2.3 棉拭子涂抹法

　　用无菌稀释液湿润无菌干燥的棉拭子 ,在样品四周和中间均匀布控 5个采样点,每个采样点用 1个无菌棉拭子 ,用无菌规格板围量 ,按 4 cm×5 cm(20 cm2 )面积范围均匀涂抹 ,立即用无菌剪刀剪去棉签手接触部分 ,将涂抹部分一块放入盛有 50 mL无菌稀释液中 ,制成 1 ∶ 10的样液 。

　　4.2.2.4 样液制备方法的选择

　　4.2.2.4. 1 样液制备一般采用 4. 2. 2. 1方法 。

　　4.2.2.4.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时 ,样液制备应采用 4. 2. 2. 2方法 。采用 4. 2. 2. 2方法时如果被检样品面积过大或过小 ,采样点可按比例增加或减少 。使保持各采样点间距始终保持在 10 cm~ 20 cm 之间 。

　　4.2.2.4.3 当样品质 地 致 密 不 容 易 剪 碎 制 备 , 或 样 品 较 贵 重 , 客 户 要 求 无 损 检 测 的 , 样 液 制 备 应 采 用

　　4. 2. 2. 3方法 。

　　4.2.2.4.4 采用 4. 2. 2. 1、4. 2. 2. 2 方法 ,如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时 ,无菌稀释液可适当增加 , 以满足检测要求 。

　　4.2.3 无菌稀释液的选择

　　定性检测时 ,应选择微生物的预增菌液作为无菌稀释液 ;定量检测时 ,应选择无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液作为无菌稀释液 。

　　2

　　GB/T 46540—2025

　　5 菌落总数的测定

　　5. 1 设备与材料

　　5. 1. 1 无菌剪刀 。

　　5. 1.2 电子天平 :感量为 0. 01 g。

　　5. 1.3 无菌均质袋 。

　　5. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　5. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　5. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

　　5. 1.7 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 :量程为 200 μL~ 1 000 μL。

　　5. 1. 8 无菌小三角瓶/试管 :25 mL/15 mL。

　　5. 1.9 无菌培养皿 :15 mm×90 mm。

　　5. 1. 10 恒温培养箱 :36 ℃ ±1 ℃ 。

　　5. 1. 11 放大镜或菌落计数器 。

　　5. 1. 12 生物安全柜或超净工作台 。

　　5.2 培养基和试剂

　　5.2. 1 磷酸盐缓冲液 :按附录 A 的 A. 1制备 。

　　5.2.2 无菌生理盐水 :按 A. 2制备 。

　　5.2.3 营养琼脂 :按 A. 3制备 。

　　5.2.4 菌落总数测试片 :应符合 5. 2. 3 中营养琼脂培养基质量控制要求 ,且主要营养成分与营养琼脂培养基配方一致 。

　　5.3 菌落总数的测定 平板计数法

　　5.3. 1 原理

　　待测样液经稀释充分混匀 ,使细菌充分分散 ,接种到营养琼脂培养皿上 ,单个细菌在含有丰富营养的培养基上经一定时间培养后形成肉眼可见的菌落 ,计数菌落数 ,从而计算出原始样品中菌落总数 。

　　5.3.2 试验程序

　　试验程序见图 1。

　　3

　　GB/T 46540—2025

　　图 1 菌落总数平板计数法试验程序

　　5.3.3 试验步骤

　　5.3.3. 1 样液稀释

　　移取按 4. 2. 2制备好样液 1 mL,缓慢注于盛有 9 mL稀释液的无菌小三角瓶或试管中(吸头尖端不应触及稀释液液面) ,振摇小三角瓶或试管 ,或换用 1 支无菌吸头或吸管反复吹打使其混合均匀 ,制成下一稀释度的样液 。按照以上操作程序 ,制备 10倍系列稀释样液 。每递增稀释 1 次 ,更换 1 次无菌吸头 。

　　5.3.3.2 样液接种

　　根据样品污染情况 ,选取合适的 2 个 ~ 3 个稀释度样液进行检测(如果无法判断污染情况 ,建议先选取 3个以上稀释度样液进行检测 ,培养结束时依据 5. 3. 4再选择 2 个合适稀释度进行结果计算) 。在进行 10倍系列稀释时 , 同时吸取 1 mL样液于无菌培养皿内 , 每个稀释度做两个平行 , 同时 ,分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内做空白对照 。及时将 15 mL~ 20 mL冷却至 46 ℃ ~ 50 ℃的营养琼脂培养基倾注培养皿 ,并转动培养皿使其混合均匀 。

　　5.3.3.3 培养

　　待琼脂凝固后 ,翻转培养皿 ,放入 36 ℃ ±1 ℃恒温培养箱培养 48h±2h。

　　5.3.4 结果计数

　　培养结束后应及时计数 ,菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示 。优先选择同一稀释度的两个平板菌落平均数在 30 CFU~ 300 CFU范围内 、菌落比较清晰的平板计数 ,可用放大镜或菌落计数器辅助计数 。如果 :

　　a) 所有的稀释度平板均无菌落生长 ,则直接以小于 1乘以最低稀释倍数报告结果 ;

　　b) 每个稀释度的两个平板菌落平均数均不在 30 CFU~ 300 CFU 范 围 内 ,选 择 接 近 30 CFU~ 300 CFU 范围的稀释度计数 ,按公式(1)计算 。

　　T = 2 × k …………………………( 1 )

　　4

　　GB/T 46540—2025

　　式中 :

　　T — 样品中的菌落总数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　∑A— 所(液)选,k数(1);平板上的菌落数之和 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　k — 根据样液 制 备 方 法 得 出的 系 数 , 按 4. 2. 2. 2 制 备 样 液 ,k= 2;按 4. 2. 2. 1、4. 2. 2. 3 制 备 样

　　d(n) —————— 稀释因子(计数的平)板(计数(数),的稀释度(一般情况)下)。n= 2;

　　c) 只有一个稀释度两个平板上的菌落平均数在 30 CFU~ 300 CFU 范围内 ,按公式(1)计算 。

　　d) 有两 个 连 续 稀 释 度 的 四 个 平 板 上 的 菌 落 平 均 数 均 在 30 CFU~ 300 CFU 范 围 内 , 则 计 数 这两个连续稀释度四个平板菌落数 ,按公式(2)计算 。

　　T = 2 × k

　　式中 :

　　T — 样品中的菌落总数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　A1 —————— 一据,k;释度所有计数平板上(制备方法得出的系数)的,菌(按 4)落.2数.2.之和(2制)备,单位为(样液),形;成(按 4)单.2.位(2). C、F(4).U(2).;.3制备样

　　∑A2 — 第二个稀释度所有计数平板上的菌落数之和 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　d(n)2 —————— 稀释因子(计数的第)二(计数的第(个稀释度)一的个平稀板释数度,一)。般情况下 n2 = 2;

　　n1 — 计数的第一个稀释度的平板数 ,一般情况下 n1 = 2;

　　5.3.5 结果报告

　　按照 5. 3. 4计数并计算 ,报告每平方厘米 、每克样品菌落总数 , 以 CFU/cm2 、CFU/g表示 。如 T 值为 0,则以小于 10报告 ;如 T 值小于 100CFU , 以实际数值报告 ;如 T 值大于或等于 100CFU 时 ,报告时数值按 GB/T 8170规则进行修约 ,用 10的指数形式来表示 ,数值保留两位有效数字 。

　　5.4 菌落总数的测定 测试片法

　　5.4. 1 原理

　　以纸片 、纸膜 、胶片作为培养基载体 ,将特定的显色液和培养基附着在上面 ,细菌在特定培养基上的生长和代谢产物与指示剂的反应形成有颜色的菌落 。计数测试片上的菌落数 ,从而计算出原始样品中菌落总数 。

　　5.4.2 试验程序

　　试验程序见图 2。

　　5

　　6

　　GB/T 46540—2025

　　5.4.3 操作步骤

　　5.4.3. 1 样液稀释按 5. 3. 3. 1。

　　5.4.3.2 样液接种

　　

　　图 2 菌落总数测试片法试验程序

　　根据样品污染情况 ,选取合适的 2 个 ~ 3 个稀释度样液进行检测(如果无法判断污染情况 ,建议先选取 3个以上稀释度样液进行检测 ,培养结束时依据 5. 4. 4再选择 2 个合适稀释度进行结果计算) 。从冰箱中取出菌落总数测试片 ,待其恢复至室温后 ,将菌落总数测试片置于平整实验台面 ,揭开上层膜 , 吸取样液接种到测试片含有培养基的中央部分 ,每个测试片接种 1 mL,共接种 2个测试片 ,然后再将上层膜缓慢盖下 。 同时分别吸取 1 mL无菌稀释液接种两个测试片做空白对照 。静置 10 s左右使样液被培养基充分吸收 。

　　注 : 一般情况下 ,测试片使用说明书给出具体操作步骤 。

　　5.4.3.3 培养

　　将接种好的测试片透明面朝上水平置于恒温培养箱内 ,36 ℃ ±1 ℃ ,培养 48h±2h。

　　5.4.4 结果计数按 5. 3. 4。

　　5.4.5 结果报告按 5. 3. 5。

　　6 大肠菌群的测定

　　6. 1 设备和材料

　　6. 1. 1 无菌剪刀 、镊子 。

　　6. 1.2 电子天平 :精确度为 0. 01 g。

　　GB/T 46540—2025

　　6. 1.3 无菌均质袋 。

　　6. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　6. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　6. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

　　6. 1.7 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 :量程分别为 200 μL~ 1 000 μL、1 mL~ 10 mL。

　　6. 1. 8 无菌玻璃培养皿或塑料培养皿 :15 mm×90 mm。

　　6. 1.9 恒温水浴箱 :46 ℃ ±1 ℃ 。

　　6. 1. 10 恒温培养箱 :36 ℃ ±1 ℃ 。

　　6. 1. 11 滤膜或一次性无菌滤膜 :直径 47 mm ,微孔径 0. 45 μm。

　　6. 1. 12 无菌滤器 。

　　6. 1. 13 抽滤设备 : -5. 07×104 Pa( -0. 5 atm) 。

　　6. 1. 14 无菌三角瓶 :容量为 300 mL。

　　6. 1. 15 Ⅱ级生物安全柜 。

　　6.2 培养基和试剂

　　6.2. 1 磷酸盐缓冲液 :按 A. 1制备 。

　　6.2.2 无菌生理盐水 :按 A. 2制备 。

　　6.2.3 LST 肉汤发酵管 :按 A. 4制备 。

　　6.2.4 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB肉汤)发酵管 :按 A. 5 制备 。

　　6.2.5 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) :按 A. 6制备 。

　　6.3 大肠菌群定性测定 乳糖胆盐发酵法

　　6.3. 1 原理

　　利用大肠菌群发酵乳糖产酸产气的特性 ,接种适合大肠菌群生长且含有乳糖的肉汤培养基 ,经验证为发酵乳糖产酸产气的定性测定方法 。

　　6.3.2 检验程序

　　检验程序见图 3。

　　图 3 大肠菌群乳糖胆盐发酵法检验程序

　　7

　　GB/T 46540—2025

　　6.3.3 操作步骤

　　6.3.3. 1 初发酵试验

　　用 1 mL微量移液器无菌取制好的样液 1 mL接种 10mLLST 肉汤发酵管内 ,置 36 ℃ ±1℃培养箱内培养 24h±2h,观察发酵管内是否产酸产气 。

　　6.3.3.2 复发酵试验

　　如初发酵产酸产气 ,则用无菌接种环挑取一环接种 BGLB 肉汤发酵管进行复发酵试验 ,置 36 ℃ ± 1 ℃培养箱内培养 24h~48h,观察复发酵情况 。

　　6.3.3.3 结果判定

　　如初发酵产酸产气 , 复 发 酵 也 产 酸 产 气 , 则 报 告 大 肠 菌 群 阳 性 。 不 产 酸 产 气 则 报 告 为 大 肠 菌 群阴性 。

　　6.3.4 结果报告

　　报告被检样品检出或未检出大肠菌群 。

　　6.4 大肠菌群定量测定 平板计数法

　　6.4. 1 原理

　　利用大肠菌群发酵乳糖产酸产气的特性 ,接种含有乳糖和指示剂的固体培养基后在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫黑色 、带或不带有金属光泽的特定形态菌落 ,计数经验证为发酵乳糖产酸产气的菌落数 ,从而计算样品中大肠菌群数的定量测定方法 。

　　6.4.2 试验程序

　　试验程序见图 4。

　　图 4 大肠菌群平板计数法试验程序

　　8

　　GB/T 46540—2025

　　6.4.3 操作步骤

　　6.4.3. 1 样液稀释按 5. 3. 3. 1。

　　6.4.3.2 样液接种

　　6.4.3.2. 1 根据样品污染情况 ,选择 2 个 ~ 3 个合适稀释度样液(如果无法判断污染情况 ,建议先选取3个以上稀释度样液进行检测 ,培养结束时依据 6. 3. 3. 4 再选择 2 个合适稀释度进行结果计算) 。 在进行 10倍递增稀释时 , 同时吸取 1 mL样液于无菌培养皿内 , 每个稀释度接种两个培养皿 。 同时分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌培养皿内做空白对照 。

　　6.4.3.2.2 及时将 15 mL~ 20 mL冷却至 46 ℃的 VRBA(可放置 46 ℃ ±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注培养皿 ,边倾注边轻转动培养皿使其混合均匀 。

　　6.4.3.3 培养

　　待结晶紫中性红胆盐琼脂凝固后 ,将平板翻转 ,放入恒温培养箱 ,36 ℃ ±1 ℃培养 24h±2h。

　　6.4.3.4 典型菌落计数

　　6.4.3.4. 1 培养结束时应及时计数 。大肠菌群在 VRBA平板上呈紫红色菌落 ,菌落周围有红色胆盐沉淀环 ,菌落较大 ,直径约 0. 5 mm。

　　6.4.3.4.2 选择有典型或可疑大肠菌群菌落平板计数 ,计数合适范围为 15 CFU~ 150 CFU ,尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板计数 。

　　6.4.3.5 确证试验

　　从可计数的平板上 任 意 挑 取 5 个 (小 于 5 个 全 部 挑 取) 不 同 类 型 典 型 或 可 疑 菌 落 , 分 别 接 种 于BGLB 肉汤发酵管中 ,36 ℃ ±1 ℃培养 24h~ 48 h,观察小倒管内是否有气泡产生 ,BGLB 肉汤发酵管产气的 , 即可确证为大肠菌群阳性菌落 ,反之为阴性 。

　　6.4.4 结果计算

　　6.4.4. 1 只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在 15 CFU~ 150 CFU 之间 ,计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落 ;

　　6.4.4.2 最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于 15CFU ,计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落 ;

　　6.4.4.3 所有稀释度平板上的菌落数均大于 150CFU且有典型或可疑菌落 ,应计数最高稀释度两个平板上的典型或可疑菌落 ;

　　以上典型或可疑菌落确证后按公式(3)计算 。

　　T = k …………………………( 3 )

　　式中 :

　　T — 样品中大肠菌群菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　A — 某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　k — k(根)样;液制备方法得出的系数 , 按 4. 2. 2. 2 制 备 样 液 ,k= 2;按 4. 2. 2. 1、4. 2. 2. 3 制 备 样 液 ,

　　B — 某一稀释度确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

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　　GB/T 46540—2025

　　d — 稀释因子 ;

　　C — 某一实验中用于确证试验的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) 。

　　6.4.4.4 两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在 15 CFU~ 150 CFU 之间 ,则这两个连续稀释度平板上的典型或可疑菌落均应计数 ;菌落确证后按公式(4)计算 。

　　T = k

　　式中 :

　　T — 每样品中大肠菌群菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　A(k)1 —————— =一据1稀(样); 释度(液制)备(低倍稀释度(方法得出)的)两个(系数)平,板(按)典(4).2或.2可(制)疑(备)菌(样)落平(液),均(k),;单(按)位(4).为(2). 菌(2). 落(1)、形(4).2单.3位(制)(CFU(备样)液);,

　　B1 — 第一稀释度(低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　C1 — 某一实验 中 第 一 稀 释 度 (低 倍 稀 释 度) 用 于 确 证 试 验 的 菌 落 数 , 单 位 为 菌 落 形 成 单 位(CFU) ;

　　A2 — 第二稀释度(高倍稀释度)两个平板典型或可疑菌落平均数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ; B2 — 第二稀释度(高倍稀释度)确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　C2 — 某一实验 中 第 二 稀 释 度 (高 倍 稀 释 度) 用 于 确 证 试 验 的 菌 落 数 , 单 位 为 菌 落 形 成 单 位(CFU) ;

　　d — 稀释因子(第一稀释度) 。

　　6.4.4.5 所有稀释度的平板上均没有典型或可疑菌落 ,则直接以小于 1乘以最低稀释倍数报告结果 。

　　6.4.4.6 如典型或可疑菌落计数出现其他情况 ,可先计算同一稀释度的两个平板平均数 ,选择典型或可疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数 ,如只有一个平均结果在计数范围内 ,确证后按公式(3)计算结果 ,如两个平均结果均在计数范围内 ,确证后按公式(4)计算 。

　　6.4.5 结果报告

　　结果报告按 5. 3. 5。

　　7 金黄色葡萄球菌的测定

　　7. 1 设备与材料

　　7. 1. 1 无菌剪刀 。

　　7. 1.2 电子天平 :精确度为 0. 01 g。

　　7. 1.3 无菌均质袋 。

　　7. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　7. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　7. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

　　7. 1.7 恒温培养箱 :36 ℃ ±1 ℃ 。

　　7. 1. 8 显微镜 :10× ~ 100× 。

　　7. 1.9 无菌试管 8 mm×100 mm。

　　7. 1. 10 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 :量程为 200 μL~ 1 000 μL。

　　7. 1. 11 Ⅱ级生物安全柜 。

　　7.2 培养基和试剂

　　7.2. 1 磷酸盐缓冲液 :按 A. 1制备 。

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　　GB/T 46540—2025

　　7.2.2 无菌生理盐水 :按 A. 2制备 。

　　7.2.3 大豆酪蛋白消化液卵磷脂聚山梨酯培养基(SCDLP) :按 A. 7制备 。

　　7.2.4 金黄色葡萄球菌显色培养基 :按 A. 8制备 。

　　7.2.5 贝尔德-帕克培养基(Baird-Parker)培养基 :按 A. 9制备 。

　　7.2.6 营养琼脂 :按 A. 3制备 。

　　7.2.7 普通肉汤培养基 :按 A. 10制备 。

　　7.2. 8 革兰氏染色液 :按 A. 11制备 。

　　7.2.9 兔血浆 :按 A. 12制备 。

　　7.3 金黄色葡萄球菌测定 定性方法

　　7.3. 1 原理

　　金黄色葡萄球菌在生长过程中能产生卵磷脂酶和脂酶 ,卵磷脂酶能降解卵黄使菌落产生透明圈 ,而脂酶则能产生不透明的沉淀环 ;凝固酶阳性的葡萄球菌还能还原亚碲酸钾而产生黑色菌落 。 因此可通过特定的菌落形态 、革兰氏染色镜检 、血浆凝固酶试验鉴定金黄色葡萄球菌 。

　　7.3.2 试验程序

　　试验程序见图 5。

　　图 5 金黄色葡萄球菌定性试验程序

　　7.3.3 操作步骤

　　7.3.3. 1 增菌

　　将按 4. 2. 2制备好的 SCDLP液体培养基增菌液放入 36 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中 ,增菌培养 24 h± 2 h。

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　　7.3.3.2 分离

　　挑取增菌液接种到金黄色葡萄球菌显色培养基平板和 Baird-Parker培养基平板上 ,36 ℃ ± 1 ℃培养 48h±2h,观察菌落 。

　　金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态参照其说明书观察 ;金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 培养基平板上为圆形 、光滑 、凸起 、湿润 ,直径为 2 mm~ 3 mm ,颜色呈灰色到黑色 ,边缘为淡色 ,周围为一混浊带 ,在其周围有一透明带 ,用接种针接触菌落似有黄油样黏稠感 。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落 ,但无混浊带及透明带 。如培养 48h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长 ,则可直接报告金黄色葡萄球菌未检出 。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取 5个(少于 5个全部挑取)典型或可疑单个菌落进行 7. 3. 3. 3 确证试验 。

　　7.3.3.3 确证试验7.3.3.3. 1 分纯

　　挑取上述平板上典型或可疑单个菌落接种营养琼脂平板 , 36 ℃ ± 1 ℃培养 24 h±2 h 分离纯化 。将分纯后的菌落接种到普通肉汤培养基中 ,36 ℃ ±1 ℃培养 24h±2h。

　　7.3.3.3.2 镜检

　　挑取分纯后菌落 ,涂片 ,革兰氏染色 ,显微镜下观察 ,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌 、紫色 ,排列成葡萄状 ,无芽胞 ,无荚膜 ,菌体较小 ,直径约为 0. 5 μm~ 1 μm。

　　7.3.3.3.3 血浆凝固酶试验

　　取 0. 3 mL普通肉汤培养物加入分装好的盛有 0. 5 mL兔血浆的试管内充分混合 ,放置 36 ℃ ±1℃培养箱培养 , 每 0. 5 h 观察一次 , 观察 6 h, 培养结束后将试管倾斜或倒置 ,如呈现凝块即为凝固 , 如凝固 ,则判定为阳性结果 。

　　7.3.4 结果报告

　　当选择平板上有典型或可疑菌落生长 ,经染色镜检 ,证明为革兰氏阳性葡萄球菌 ,血浆凝固酶试验呈阳性 ,报告被检样品检出金黄色葡萄球菌 ,反之报告未检出 。

　　7.4 金黄色葡萄球菌的测定 平板计数法

　　7.4. 1 原理

　　样液选取合适的稀释度接种金黄色葡萄球菌显色培养基平板 ,金黄色葡萄球菌在显色培养基平板上具有特定的菌落形态 ,再根据金黄色葡萄球菌形态特征和生化特性 ,鉴定金黄色葡萄球菌 。最后按相应公式计算出金黄色葡萄球菌定量结果 。

　　7.4.2 试验程序

　　试验程序见图 6。

　　12

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　　图 6 金黄色葡萄球菌平板计数试验程序

　　7.4.3 操作步骤

　　7.4.3. 1 样液稀释按 5. 3. 3. 1。

　　7.4.3.2 样液接种

　　根据样品污染情况 ,选择 2 个 ~ 3 个合适的稀释度样液(如果无法判断污染情况 ,建议先选取 3 个以上稀释度样液进行检 测 , 培 养 结 束 时 依 据 7. 4. 3. 3 再 选 择 2 个 合 适 稀 释 度 进 行 结 果 计 算) , 在 进 行10倍递增稀释的同时 ,每个稀释度分别吸取 1000μL样液以 300μL、300μL 、400μL的接种量分别接种三块表面干燥的金黄色葡萄球菌显色培养基平板 ,立即用无菌 L形玻璃棒均匀涂布整个平板 ,不应触及平板边缘 。将平板正面放置至接种物被培养基吸收 , 翻转平板 ,倒置放入培养箱 , 36 ℃ ± 1 ℃ , 培养 48h±2h。

　　7.4.3.3 典型或可疑菌落计数

　　金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态按其说明书进行判断 ;挑选有典型或可疑金黄色葡萄球菌菌落 ,且同一稀释度的两个平板所有典型或可疑菌落数合计在 20CFU~ 200 CFU 范围内的平板 ,计数其典型或可疑菌落数 。

　　7.4.3.4 确证试验

　　从金黄色葡萄球菌显色平板上至少挑取 5个(少于 5 个全部挑取) 典型或可疑菌落按 7. 3. 3. 3 做确证试验 。

　　7.4.4 结果计算

　　7.4.4. 1 只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在 20 CFU~ 200 CFU 内 ,计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落 。

　　7.4.4.2 最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于 20CFU ,计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落 。

　　7.4.4. 3 所有稀释度平板上的菌落数合计均大于 200 CFU 且有典型或可疑菌落 ,应计数最高稀释度

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　　两个平板上合计的典型或可疑菌落 。

　　以上典型或可疑菌落确证后按公式(5)计算 。

　　T = k …………………………( 5 )

　　式中 :

　　T — 样品中金黄色葡萄球菌菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　A — 某(k)=一1稀; 释度 3个平板典型菌落合计数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　k — 根据样液制备方法得出的系数 , 按 4. 2. 2. 2 制 备 样 液 ,k= 2;按 4. 2. 2. 1、4. 2. 2. 3 制 备 样 液 ,

　　B — 某一稀释度确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　C — 某一实验中用于确证试验的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　d — 稀释因子 。

　　7.4.4.4 两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数合计均在 20 CFU~ 200 CFU 内 ,则这两个连续稀释度平板上的典型或可疑菌落均应计数 ;菌落确证后按公式(6)计算 。

　　T = k …………………( 6 )

　　式中 :

　　T — 样品中金黄色葡萄球菌菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　k= 1;

　　k — 根据样液制备方法得出的系数 ,按 4. 2. 2. 2 制备样液 ,k= 2;按 4. 2. 2. 1、4. 2. 2. 3 制 备 样 液 ,

　　A1— 第一稀释度(低倍稀释度)3个平板典型或可疑菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　B1— 第一稀释度(低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　C1— 某一实验 中 第 一 稀 释 度 (低 倍 稀 释 度) 用 于 确 证 试 验 的 菌 落 数 , 单 位 为 菌 落 形 成 单 位(CFU) ;

　　A2— 第二稀释度(高倍稀释度)3个平板典型或可疑菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　B2— 第二稀释度(高倍稀释度)确证试验阳性的菌落数 ,单位为菌落形成单位(CFU) ;

　　C2— 某一实验 中 第 二 稀 释 度 (高 倍 稀 释 度) 用 于 确 证 试 验 的 菌 落 数 , 单 位 为 菌 落 形 成 单 位(CFU) ;

　　d — 稀释因子(第一稀释度) 。

　　7.4.4.5 所有稀释度的平板上均没有典型或可疑菌落 ,则直接以小于 1乘以最低稀释倍数报告结果 。

　　7.4.5 结果报告

　　结果报告按 5. 3. 5。

　　8 白假丝酵母的测定

　　8. 1 设备与材料

　　8. 1. 1 无菌剪刀 。

　　8. 1.2 电子天平 :精确度为 0. 01 g。

　　8. 1.3 无菌均质袋 。

　　8. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　8. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　8. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

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　　8. 1.7 恒温培养箱 :28 ℃ ±1 ℃ 、45 ℃ ±1 ℃ 。

　　8. 1. 8 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 :量程为 20 μL~200 μL、200 μL~ 1 000 μL、1 mL~ 5 mL。

　　8. 1.9 无菌试管 :10 mm×100 mm。

　　8. 1. 10 恒温水浴箱 :45 ℃ ±1 ℃ 、36 ℃ ±1 ℃ 。

　　8. 1. 11 载玻片 。

　　8. 1. 12 盖玻片 。

　　8. 1. 13 显微镜 :10× ~ 100× 。

　　8. 1. 14 无菌玻璃培养皿或一次性无菌塑料培养皿 :15 mm×90 mm。

　　8. 1. 15 生物安全柜 : Ⅱ级以上 。

　　8.2 培养基和试剂

　　8.2. 1 无菌生理盐水 :按 A. 2制备 。

　　8.2.2 麦芽浸膏肉汤(MEB肉汤) :按 A. 13制备 。

　　8.2.3 念珠菌显色培养基 。

　　8.2.4 念珠菌选择性(Candida Elective)琼脂 :按 A. 14制备 。

　　8.2.5 1% 吐温 80-玉米琼脂培养基 :按 A. 15制备 。

　　8.2.6 兔血清 :按 A. 16制备 。

　　8.2.7 革兰氏染色液 :按 A. 11制备 。

　　8.3 白假丝酵母的测定 定性方法

　　8.3. 1 原理

　　白假丝酵母在特定的培养基上能形成芽管 、假菌丝 、厚膜孢子 ,并能在 45 ℃条件下生长 ,通过芽管试验和温度生长试验鉴定白假丝酵母 。

　　8.3.2 试验程序

　　试验程序见图 7。

　　图 7 白假丝酵母定性试验程序

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　　8.3.3 操作步骤

　　8.3.3. 1 增菌

　　如按 4. 2. 2. 1制备样品 ,则称取 25 g样品 ,剪碎后加入到盛有 225 mL MEB 肉汤的无菌均质袋内 ;如按 4. 2. 2. 2制备样品 ,将 4. 2. 2. 2采集好的 5 份检样放入盛有 200mL MEB 肉汤的无菌均质袋内 ;如按

　　4. 2. 2. 3制备样品 ,则将棉拭子涂抹部分一块放入盛有 50 mL MEB 肉汤的无菌均质袋内 。均质后放置28 ℃ ±1 ℃增菌培养 48h±2h。

　　8.3.3.2 分离

　　将培养后的 增 菌 液 接 种 念 珠 菌 显 色 培 养 基 平 板 和 Candida Elective琼 脂 平 板 , 28 ℃ ± 1 ℃培 养48h±2h, 观察菌落形态 。 白假丝酵母在显色培养基上菌落形态参照其说明书观察 。 白假丝酵母在Candida Elective琼脂平板上呈深棕色小菌落 , 圆形凸起 ,边缘整齐 ,表面干燥成磨砂样 ,用无菌接种环接触后有酸奶状黏稠样 。如培养 50 h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长 ,则可直接报告白假丝酵母未检出 。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取 5个(少于 5个全部挑取)典型或可疑菌落进行

　　8. 3. 3. 3 确证试验 。

　　8.3.3.3 确证试验

　　8.3.3.3. 1 菌落纯化

　　用无菌接种环挑取上述平板上典型或可疑单个菌落分别接种到两块 1% 吐温 80-玉米琼脂培养基平板上 ,28 ℃ ±1 ℃培养 48h±2h,分离纯化 。

　　8.3.3.3.2 芽管实验

　　取 1% 吐温 80-玉米琼脂培养基平板上单个菌落至盛有无菌生理盐水的试管中 ,仔细研磨成乳状液 ,与麦氏比浊管对比 ,制成含菌量约 109个/mL菌液 ,用微量移液器吸取 20μL接种于含 0. 5 mL兔血清的无菌试管中 ,36 ℃ ±1℃水浴箱中培养 2 h~ 3 h,取出混匀 , 吸取 20μL置干净载玻片上 ,盖上盖玻片 ,显微镜(40×)下观察芽管 。用酿酒酵母 、白假丝酵母做阴阳性对照 ,孵育时间不应超过 3 h。

　　8.3.3.3.3 镜检观察菌丝、假菌丝和厚膜孢子

　　挑取 1% 吐温 80-玉米琼脂培养基平板上纯化菌落 ,涂片 ,革兰氏染色 ,镜检 。显微镜下观察白假丝酵母为革兰氏阳性酵母菌 ,着色不均 ,有丰富的假菌丝 ,假菌丝中隔部伴有成簇的圆形分生孢子 ,在假菌丝中间或顶端有较大圆形厚膜孢子 。

　　8.3.3.3.4 45 ℃生长试验

　　挑取纯化单个菌落接种 MEB 肉汤培养基中 ,45 ℃ ±1 ℃培养 48h~ 72h。 白假丝酵母在 MEB 肉汤中 45 ℃ ±1 ℃能生长 。

　　8.3.3.3.5 结果判定

　　当分离出的可疑菌 落 有 芽 管 形 成 , 能 观 察 到 菌 丝 、假 菌 丝 和 厚 膜 孢 子 , 同 时 能 在 45 ℃环 境 中 生长 ,可判定为白假丝酵母 。

　　8.3.4 结果报告

　　结果报告为检出或未检出白假丝酵母 。

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　　8.4 白假丝酵母测定 平板计数法

　　8.4. 1 原理

　　样液选取合适的稀释度接种 Candida Elective琼脂平板 , 根据白假丝酵母形态特征和生理生化特性 ,鉴定白假丝酵母 。计数并按相应公式计算出白假丝酵母总数 。

　　8.4.2 试验程序

　　试验程序见图 8。

　　图 8 白假丝酵母平板计数试验程序

　　8.4.3 操作步骤

　　8.4.3. 1 样液稀释按 5. 3. 3. 1。

　　8.4.3.2 样液接种

　　8.4.3.2. 1 根据样品污染情况 ,选择 2个 ~ 3个合适的稀释度的样液(如果无法判断污染情况 ,建议先选取 3个以上稀释度样液进行检测 ,培养结束时依据 8. 4. 3. 4. 2再选择 2 个合适稀释度进行结果计算) ,在进行 10倍递增稀释时 , 吸取 1 mL样液于无菌培养皿内 , 每个稀释度接种两个培养皿 。 同时分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内做空白对照 。

　　8. 4.3.2.2 及时将 15 mL~ 20mL冷却至 45 ℃±0. 5 ℃(可放置 45 ℃ ±1℃水浴箱中保温)的 Candida Elective琼脂倾注培养皿 ,边倾注边转动培养皿使其混合均匀 。

　　8.4.3.3 培养

　　待琼脂凝固后 ,将培养皿翻转 ,倒置放入培养箱 ,28 ℃ ±1 ℃培养 48h±2h。

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　　8.4.3.4 典型菌落计数和确认

　　8.4.3.4. 1 培养结束后应及时计数 , 白假丝酵母在 Candida Elective琼脂平板上典型菌落呈深棕色小菌落 , 圆形凸起 ,边缘整齐 ,表面干燥成磨砂样 ,用无菌接种环接触后有类似巧克力融化后的样子 。

　　8.4.3.4.2 选择有典型或可疑白假丝酵母菌落的平板计数 。合适的计数范围为 15 CFU~ 150 CFU ,尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板 ,计数典型或可疑菌落数 。

　　8.4.3.4.3 从可计数的平板上任意挑取典型或可疑菌落 5个(小于 5 个全部挑取) ,分别按 8. 3. 3. 3 做确证试验 。

　　8.4.4 结果计算按 6. 4. 4。

　　8.4.5 结果报告

　　结果报告按 5. 3. 5。

　　9 铜绿假单胞菌的测定

　　9. 1 材料和设备

　　9. 1. 1 无菌剪刀 、镊子 。

　　9. 1.2 电子天平 :精确度为 0. 01 g。

　　9. 1.3 无菌均质袋 。

　　9. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　9. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　9. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

　　9. 1.7 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 : 量程分别为 0. 5 μL~ 20 μL、100 μL~ 1 000 μL、1 mL~ 10 mL。

　　9. 1. 8 无菌玻璃培养皿或一次性无菌塑料培养皿 :15 mm×90 mm。

　　9. 1.9 恒温培养箱 :36 ℃ ±1 ℃、42 ℃ ±1 ℃ 。

　　9. 1. 10 显微镜 :10× ~ 100× 。

　　9. 1. 11 全自动微生物生化鉴定系统 。

　　9. 1. 12 灭菌离心管 :1. 5 mL。

　　9. 1. 13 高速冷冻离心机 :2 000 r/min~ 13 000 r/min。

　　9. 1. 14 PCR反应管 。

　　9. 1. 15 水浴锅 :65 ℃ ±1 ℃ 。

　　9. 1. 16 LAMP实时浊度仪 。

　　9. 1. 17 生物安全柜 : Ⅱ级以上 。

　　9.2 培养基和试剂

　　9.2. 1 无菌生理盐水 :按 A. 2制备 。

　　9.2.2 SCDLP液体培养基 :按 A. 7制备 。

　　9.2.3 假单胞菌 CN选择性培养 :按 A. 17制备 。

　　9.2.4 乙酰胺琼脂 :按 A. 18制备 。

　　9.2.5 革兰氏染色液 :按 A. 11制备 。

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　　9.2.6 氧化酶试剂 :按 A. 19制备 。

　　9.2.7 硝酸盐蛋白胨水培养基 :按 A. 20制备 。

　　9.2. 8 营养琼脂 :按 A. 3制备 。

　　9.2.9 灭菌双蒸水 。

　　9.2. 10 10×LAMP扩增缓冲液 :含 200 mmol/LTris- HCl(pH 8. 8) 、100 mmol/L硫酸铵、500 mmol/L氯化钾 、20 mmol/L硫酸镁 、1% 吐温 20。

　　9.2. 11 引物 :按附录 B。

　　9.2. 12 MgSO4 液 :100 mmol/L。

　　9.2. 13 10 mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物 :每种核苷酸浓度 10 mmol/L。

　　9.2. 14 嗜热脂肪芽孢杆菌脱氧核糖核酸(Bst DNA)聚合酶 :8 U/μL。

　　9.2. 15 显色液 :SYBR Green I染料 ,1 000× 。

　　9.2. 16 铜绿假单胞菌标准菌株 。

　　9.3 铜绿假单胞菌的测定 定性方法

　　9.3. 1 原理

　　根据铜绿假单胞菌在其选择性培养基上能产生绿脓菌素且氧化酶呈阳性 , 能使硝酸盐还原产气和42 ℃生长等特性 ,鉴定铜绿假单胞菌 。

　　9.3.2 试验程序

　　试验程序见图 9。

　　图 9 铜绿假单胞菌定性试验程序

　　9.3.3 操作步骤

　　9.3.3. 1 样品处理及增菌

　　将按 4. 2. 2制备好的 SCDLP液体培养基增菌液放入 36 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中 ,增菌培养 24 h± 2 h。

　　培养结束后 ,如有铜绿假单胞菌生长 ,培养液表面多有一层薄菌膜 ,培养液常呈黄绿色或蓝绿色 。

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　　9.3.3.2 分离

　　取出增菌后的培养液 ,用一次性接种环 ,从培养液的薄菌膜下方挑取培养物 ,划线接种在一个假单胞菌 CN选择性培养基平板上和一个乙酰胺琼脂平板上 ,置 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h±2 h,观察菌落 。铜绿假单胞菌在假单胞 菌 CN 选 择 性 培 养 基 平 板 上 菌 落 扁 平 无 定 型 , 向 周 边 扩 散 或 略 有 蔓 延 , 表 面 湿润 ,菌落呈灰白色 ,菌落周围培养基常扩散有水溶性色素 ;铜绿假单胞菌在乙酰胺琼脂平板上菌落形态 :乳白色扁平菌落 ,湿润 ,边缘整齐 ,菌落周围培养基颜色变红 。

　　9.3.3.3 确证试验

　　挑取典型或可疑菌落 , 同时做以下确证试验 。

　　a) 染色镜检

　　挑取乙酰胺琼脂平板上单个菌落 ,涂片 ,革兰氏染色 ,显微镜下观察其菌落形态 。铜绿假单胞菌显微镜下为革兰氏阴性菌 ,细长且长短不一 ,有时呈球杆状或线状 ,成对或短链状排列 。

　　b) 氧化酶试验

　　取一张洁净滤纸放在灭菌培养皿内 ,滴加氧化酶试剂一滴于滤纸上 ,挑取乙酰胺琼脂平板上单个菌落涂在滤纸片上 ,在 10 s 内出现蓝色或蓝紫色者为阳性反应 ,不变色为阴性反应 ,铜绿假单胞菌氧化酶试验呈阳性反应 。也可购买商品化氧化酶试剂或氧化酶试纸并按其说明书进行试验 。

　　c) 硝酸盐还原产气试验

　　挑取乙酰胺琼脂 平 板 上 菌 落 , 接 种 硝 酸 盐 蛋 白 胨 水 培 养 基 , 36 ℃ ± 1 ℃培 养 24 h±2 h, 观 察 结果 ,硝酸蛋白盐胨水培养基内的小倒管中有气体者 , 即为阳性 ,否则为阴性 。铜绿假单胞菌能还原硝酸盐 ,并将亚硝酸盐分解产生氮气 , 因此铜绿假单胞菌硝酸盐还原产气试验阳性 。

　　d) 42 ℃生长试验

　　挑取乙酰胺琼脂平板上菌落 ,划线接种在营养琼脂培养基制成的斜面上 ,42 ℃±1 ℃培养 48h±2h,铜绿假单胞菌能 42 ℃生长 ,为阳性 ,而近似的荧光假单胞菌则不能生长 。

　　注 : 如选择全自动微生物生化鉴定系统 ,需挑取假单胞菌 CN选择性培养基平板或乙酰胺琼脂平板 上 可 疑 菌 落 接种营养琼脂平板 36 ℃ ±1℃培养 20h±2h进行纯化 ,挑取纯化后的菌落制成一定浓度的菌悬液 ,使用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定 。

　　9.3.4 结果报告

　　被检样品经增菌后 ,有绿色或蓝绿色薄菌膜 ,可直接报告铜绿假单胞菌阳性 ;如无绿色或蓝绿色薄菌膜 ,经分离培养后 ,经证实为革兰氏阴性杆菌 ,氧化酶试验 、硝酸盐还原产气和 42 ℃生长试验三者皆为阳性时 ,报告被检样品中检出铜绿假单胞菌 ,其他情况报告未检出 。

　　9.4 铜绿假单胞菌的测定 环介导恒温扩增(LAMP)法

　　9.4. 1 原理

　　根据铜绿假单胞菌特有的 ETA 保守序列 ,设计一组 LAMP特异性引物 ,利用 DNA 聚合酶启动循环链置换反应 ,在等温条件(65℃左右)下保温 30 min~ 60 min,特异 、高效 、快速地完成核酸扩增 。扩增后的产物形成白色沉淀 ,通过对比观察或通过浊度仪生成的浊度曲线初步判定样品中是否存在铜绿假单胞菌 ,最后通过生化试验进行确认 。

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　　9.4.2 试验程序

　　试验程序见图 10。

　　图 10 铜绿假单胞菌 LAMP法试验程序

　　9.4.3 操作步骤

　　9.4.3. 1 样品增菌

　　将按 4. 2. 2制备好的 SCDLP液体培养基增菌液放入 36 ℃ ± 1 ℃恒温培养箱中 ,增菌培养 20 h± 2 h。

　　9.4.3.2 DNA 模板制备

　　取 1 mL增菌后的 SCDLP液体培养基增菌液加入两个 1. 5 mL灭菌离心管内 ,置高速冷冻离心机内 10000r/min离心 5 min,吸弃上清液 ;分别加入 1 mL灭菌双蒸水混匀 ,高速冷冻离心机内 10000r/min离心 5 min, 吸弃上清液 ;然后分别加灭菌双蒸水 100μL混匀 ,置 100 ℃煮沸 5 min,高速冷冻离心机内10 000 r/min离心 2 min,取上清作为 DNA模板 ,可 -20 ℃存放备用 。也可使用等效的商品化 DNA提取试剂盒并按其说明操作 。

　　9.4.3.3 DNA 扩增反应

　　9.4.3.3. 1 扩增准备

　　照 +样本数) 。扩增反应体系见表 1,按表 1计算各试剂的使用量 ,按表 1 的顺序加入灭菌离心管内 ,颠

　　倒混匀 ,2 000 r/min离心 10 s, 向设定的 n 个 PCR反应管中分别分装 23μL。

　　根据样本数量设定所需准备 PCR反应管数 n 个(n= 1 管空白对照 +1 管阴性对照 +1 管阳性对

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　　表 1 反应体系

　　单位为微升

　　LAMP试剂

　　1 管试验用量

　　n 管试验用量

　　10×LAMP扩增缓冲液

　　2. 5

　　n× 2. 5

　　F3/B3

　　各 1. 0

　　各 n× 1. 0

　　FIP/BIP

　　各 1. 0

　　各 n× 1. 0

　　LoopF/LoopB

　　各 1. 0

　　各 n× 1. 0

　　100 mmol/LMgSO4

　　1. 75

　　n× 1. 75

　　10 mmol/L dNTP 混合物

　　3. 5

　　n× 3. 5

　　8 U/μLBstDNA 聚合酶

　　1. 0

　　n× 1. 0

　　灭菌双蒸水

　　8. 25

　　n× 8. 25

　　总体积

　　23

　　n× 23

　　注 1: 引物终浓度 F3 和 B3 为 0. 2 μmol/L,FIP 和 BIP 为 1. 6 μmol/L,LoopF和 LoopB为 0. 4 μmol/L;Mg2+ 终浓度为 9 mmol/L;dNTP终浓度 1. 4 mmol/L。

　　注 2: 如选用等效的商品化试剂盒进行 LAMP扩增 , 反应体系中各试剂的量需根据具体情况或不同反应总体积进行适当调整 。

　　9.4.3.3.2 空白对照、阴性对照、阳性对照

　　每次实验应设置空白对照 、阴性对照和阳性对照 。

　　空白对照 : 以灭菌双蒸水代替 DNA模板 。

　　阴性对照 : 以灭菌双蒸水代替样品按 9. 4. 3. 2 提取模板 DNA作为 LAMP反应的模板 。

　　阳性对照 :铜绿假单胞菌标准菌株增菌后按 9. 4. 3. 2 提取模板 DNA作为 LAMP反应的模板或其扩增片段的阳性克隆分子 DNA。

　　9.4.3.3.3 加样

　　将 9. 4. 3. 2制备好的 DNA模板 、空白对照 、阴性对照 、阳性对照各取 2 μL加入 9. 4. 3. 3. 1 准备好的反应管中 ,使反应体系达到 25μL。盖紧管盖 ,混匀 ,2 000 r/min离心 10 s。

　　9.4.3.3.4 扩增

　　将 9. 4. 3. 3. 3反应管置水浴锅或 LAMP实时浊度仪中 ,65 ℃扩增 40 min。

　　9.4.4 结果观察

　　9.4.4. 1 可视化观察结果

　　反应结束后取出反 应 管 , 将 反 应 管 置 黑 色 背 景 下 观 察 。 先 观 察 对 照 反 应 管 , 有 白 色 沉 淀 者 为 阳性 ,无白色沉淀者为阴性 ;如果沉淀现象不明显 ,在反应管中加入 1 000× SYBR Green I染料 2 μL,轻轻混匀 ,立即观察颜色变化 ,绿色为阳性 ,橙色为阴性 。空白对照 、阴性对照管橙色 , 阳性对照管绿色成立 ,才能判定样品的检测结果 ,样品反应管的任何程度沉淀或加染料后的不同于阴性的颜色变化均判定为阳性结果 。

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　　9.4.4.2 浊度仪结果

　　反应结束后 ,观察 LAMP实时浊度仪生成的扩增曲线 , 空白对照 、阴性对照无扩增曲线 ,反应浊度值小于 0. 1, 阳性对照有典型扩增曲线且反应浊度值大于 0. 1,否则实验视为无效 。样品反应浊度值小于0. 1 时 ,可判定该样品结果为阴性 ;样品反应浊度值大于或等于 0. 1 时 ,可判定该样品结果为阳性 。

　　9.4.5 结果报告

　　根据 9. 4. 4铜绿假单胞菌初筛检测结果 ,如果初筛结果为阴性 ,可直接报告样品中未检出铜绿假单胞菌 ;如果初筛结果为阳性 ,则将 9. 4. 3. 1 中培养后的增菌液划线接种假单胞菌 CN 选择性培养基和乙酰胺琼脂平板分离菌落 ,将分离后的典型或可疑菌落按 9. 3. 3. 3 进行确认 ,报告样品中检出或未检出铜绿假单胞菌 。

　　10 乙型溶血性链球菌的测定

　　10. 1 材料和设备

　　10. 1. 1 无菌剪刀 、镊子 。

　　10. 1.2 电子天平 :精确度为 0. 01 g。

　　10. 1.3 无菌均质袋 。

　　10. 1.4 拍击式均质器 :容量为 400 mL。

　　10. 1.5 无菌规格板 :20 cm2 。

　　10. 1.6 无菌干燥棉拭子 。

　　10. 1.7 微量移液器及配套无菌吸头或吸管 : 量程分别为 0. 5 μL~ 20 μL、100 μL~ 1 000 μL、1 mL~ 10 mL。

　　10. 1. 8 恒温培养箱 :36 ℃ ±1 ℃ 。

　　10. 1.9 厌氧培养装置 。

　　10. 1. 10 显微镜 :10× ~ 100× 。

　　10. 1. 11 全自动微生物生化鉴定系统 。

　　10. 1. 12 灭菌离心管 :1. 5 mL。

　　10. 1. 13 高速冷冻离心机 :2 000 r/min~ 13 000 r/min。

　　10. 1. 14 PCR反应管 。

　　10. 1. 15 荧光 PCR仪 。

　　10. 1. 16 生物安全柜 : Ⅱ级以上 。

　　10.2 培养基和试剂

　　10.2. 1 改良胰蛋白胨大豆肉汤(mTSB) :按 A. 21制备 。

　　10.2.2 哥伦比亚 CNA血琼脂 :按 A. 22制备 。

　　10.2.3 哥伦比亚血琼脂 :按 A. 23制备 。

　　10.2.4 胰蛋白大豆肉汤(TSB) :按 A. 24制备 。

　　10.2.5 革兰氏染色液 :按 A. 11制备 。

　　10.2.6 3%过氧化氢溶液 :按 A. 25制备 。

　　10.2.7 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡 。

　　10.2. 8 灭菌双蒸水 。

　　10.2.9 DNA提取液 :20 mmol/LTris-HCl,2 mmol/LEDTA,1. 2% Triton X-100(pH 8. 0) ,也可使

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　　用商业化的 DNA提取试剂盒 。

　　10.2. 10 10×PCR缓冲液 :200 mmol/LTris-HCl(pH 8. 4) ,200 mmol/L氯化钾 ,15 mmol/L氯化镁 。

　　10.2. 11 脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液(10 mmol/L) :每种核苷酸浓度 10 mmol/L。

　　10.2. 12 引物和探针 :引物和探针序列按附录 C。

　　10.2. 13 水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶(5U/μL) 。

　　10.2. 14 标准菌株 : 乙型溶血性链球菌标准菌株(CMCC32210-5a或等效标准菌株) 。

　　10.3 乙型溶血性链球菌的测定 定性方法

　　10.3. 1 原理

　　根据乙型溶血性链球菌具有 β溶血性 、革兰阳性球菌 、呈链状排列 、触酶实验阴性等特征 ,通过显微镜观察菌体特征结合生化特性进行鉴定 。

　　10.3.2 试验程序

　　试验程序见图 11。

　　图 11 乙型溶血性链球菌定性方法试验程序

　　10.3.3 操作步骤

　　10.3.3. 1 增菌

　　将按 4. 2. 2制备好的 mTSB增菌液放入 36 ℃ ±1 ℃恒温培养箱中 ,增菌培养 24h±2h。 10.3.3.2 分离

　　无菌挑取 10. 3. 3. 1增菌液分别接种两个哥伦比亚 CNA血琼脂平板 。置厌氧培养装置 36 ℃ ±1 ℃培养 24h±2h。培养结束后观察各个平板上菌落生长情况及菌落形态 。哥伦比亚 CNA血琼脂平板上乙型溶血性链球菌典型菌落形态为灰白色圆形小菌落 ,表面光滑凸起 ,半透明 ,边缘整齐 ,周围形成一个直径 2 mm~4 mm 界限分明 、无色透明溶血环(β溶血) 。

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　　10.3.3.3 纯化菌落

　　分别挑取哥伦比亚 CNA血琼脂上 5 个(如小于 5 个则全选) 可疑或典型菌落 , 同时接种哥伦比亚血琼脂平板和 TSB 肉汤 ,于 36 ℃ ±1 ℃培养 24h±2 h 纯化 ,纯化后的培养物同时进行 10. 3. 3. 4 确证试验 。

　　10.3.3.4 确证试验

　　10.3.3.4. 1 镜检

　　挑取哥伦比亚血琼脂平板上可疑菌落和 TSB 肉汤培养物进行革兰氏染色镜检 , 乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性 , 圆形或卵圆形 ,直径为 0. 5 μm~ 1 μm ,链的长短不一 ,短者由 4个 ~ 5 个菌体组成 ,长者可达 20个 ~ 30个甚至上百个 。链的长短与细菌种类和生长环境有关 ,在固体培养基中常呈短链 ,液体培养基中易呈长链 。

　　10.3.3.4.2 触酶试验

　　挑取可疑菌落于洁净的载玻片上 ,滴加适量的 3%过氧化氢溶液 ;也可用玻璃棒或毛细管蘸取可疑菌落于 3%过氧化氢溶液中 ,3 s~ 5 s产生气泡者为阳性 。 乙型溶血性链球菌触酶试验为阴性 。

　　10.3.3.4.3 生化试验

　　镜检和触酶试验判定不确定时可进行生化试验 。挑取纯化菌落使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定 ,具体操作步骤按其说明书进行 。

　　10.3.4 结果报告

　　综合以上 ,报告样品中检出或未检出乙型溶血性链球菌 。

　　10.4 乙型溶血性链球菌的测定 实时荧光定量 PCR法

　　10.4. 1 原理

　　根据乙型溶血性链球菌特有的 htrA基因的保守序列 ,设计一组 PCR 特异性引物和荧光双标记探针(两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团) 。PCR扩增时 ,反应体系中加入 DNA模板 、引物 、探针 、4种脱氧核苷酸 、Taq酶 。 目标菌不存在时 ,探针完整 ,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ,没有荧光信号产生 ; 目标菌存在时 ,探针被 Taq 酶酶切降解 ,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ,从而荧光监测系统可接收到荧光信号 , 即每扩增一条 DNA链 ,就有一个荧光分子形成 ,达到荧光信号的累积与 PCR产物的形成完全同步 ,初步判定样品中是否存在乙型溶血性链球菌 ,最后通过生化试验进行确认 。

　　10.4.2 试验程序

　　试验程序见图 12。

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　　10.4.3 操作步骤

　　10.4.3. 1 样品增菌

　　

　　图 12 乙型溶血性链球菌实时荧光定量 PCR法试验程序

　　按 10. 3. 3. 1。

　　10.4.3.2 DNA模板制备

　　按 9. 4. 3. 2。

　　10.4.3.3 DNA 扩增反应

　　10.4.3.3. 1 扩增准备

　　照 +样本数(根据样)本),扩增反应体 系 见(数量设定所需准)表(备)2(P)C,按表(R反)2(应)计(管)算(数)使(1)用(管)量(空)白,按顺序加入灭菌(对照 +1管阴性)离(对)心(照)管(+)1内管, 颠(阳)倒(性)混(对)

　　匀 ,2 000 r/min离心 10 s,分装至 n 个 PCR反应管内 ,每管 23μL。

　　表 2 反应体系

　　单位为微升

　　组分

　　1 管试验用量

　　n 管试验用量

　　10×PCR缓冲液

　　2. 5

　　n× 2. 5

　　dNTP 混合液(10 mmol/L)

　　1. 0

　　n× 1. 0

　　上游引物(10 μmol/L)

　　1. 0

　　n× 1. 0

　　下游引物(10 μmol/L)

　　1. 0

　　n× 1. 0

　　探针(10 μmol/L)

　　1. 0

　　n× 1. 0

　　Taq DNA聚合酶(5U/μL)

　　0. 5

　　n× 0. 5

　　灭菌双蒸水

　　16. 0

　　n× 16. 0

　　总体积

　　23. 0

　　n× 23. 0

　　注 1: 上 、下游引物终浓度为 0. 4 μmol/L,探针终浓度 0. 4 μmol/L。

　　注 2: 如选用等效的商品化试剂盒进行 PCR扩增 , 反应体系中各试剂的量需根据具体情况或不同反应总体积进行适当调整 。

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　　10.4.3.3.2 空白对照、阴性对照、阳性对照

　　每次实验应设置空白对照 、阴性对照和阳性对照 。

　　空白对照 : 以灭菌双蒸水代替 DNA模板 。

　　阴性对照 : 以灭菌双蒸水代替样品按 10. 4. 3. 2 提取模板 DNA作为 PCR反应的模板 。

　　阳性对照 : 乙型溶血性链球菌标准菌株增菌后按 10. 4. 3. 2 提取模板 DNA 或其扩增片段的阳性克隆分子 DNA。

　　10.4.3.3.3 加样

　　将 10. 4. 3. 2制备好的 DNA模板 、空白对照 、阴性对照 、阳性对照各取 2. 0 μL加入 10. 4. 3. 3. 1 准备好的反应管中 ,使反应体系达到 25 μL。盖紧管盖 ,混匀 ,高速冷冻离心机 2 000 r/min离心 10 s。

　　10.4.3.3.4 扩增

　　将 10. 4. 3. 3. 3反应管置实时荧光 PCR仪中 。反应参数 :95℃预变性 5 min;95℃变性 10 s,60℃退火延伸 30 s,进行 40个循环 ,4 ℃保存反应产物 。

　　注 1: 反应体系中添加 UDG酶时 ,反应参数起始增加 37 ℃ 5 min条件 ;

　　注 2: PCR反应参数需根据基因扩增仪的型号不同进行适当的调整 。

　　10.4.4 结果观察

　　10.4.4. 1 质控标准

　　阴性对照 :无扩增曲线 ,Ct值 ≥40. 0;

　　阳性对照 : 出现典型的扩增曲线 ,Ct值<30. 0;否则 ,实验视为无效 。

　　10.4.4.2 结果判定

　　Ct值 ≥40. 0,可判定样品结果为阴性 ,可直接报告样品未检出乙型溶血性链球菌 Ct值 ≤35. 0,可判定该样品结果为阳性;35. 0

　　10.4.5 结果报告

　　根据确认结果报告样品中检出或未检出乙型溶血性链球菌 。

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　　附 录 A (规范性)

　　培养基和试剂

　　A. 1 磷酸盐缓冲液

　　A. 1. 1 成分

　　磷酸二氢钾 34. 0 g

　　蒸馏水 500. 0 mL

　　A. 1.2 制法

　　贮存液 :称取 34. 0 g 磷 酸 二 氢 钾 溶 于 500 mL 蒸 馏 水 中 , 用 大 约 175 mL 的 1 mol/L氢 氧 化 钠(NaOH)调 pH 为 7. 2±0. 2,用蒸馏水稀释至 1 000 mL后贮存于冰箱 。

　　稀释液 :取贮 存 液 1. 25 mL, 用 蒸 馏 水 稀 释 至 1 000 mL, 分 装 到 适 宜 容 器 中 , 121 ℃ 高 压 灭 菌15 min。

　　A.2 无菌生理盐水

　　A.2. 1 成分

　　氯化钠 8. 5 g

　　蒸馏水 1 000. 0 mL

　　A.2.2 制法

　　称取 8. 5 g氯化钠溶于 1 000 mL蒸馏水中 ,121 ℃高压灭菌 15 min。

　　A.3 营养琼脂

　　A.3. 1 成分

　　蛋白胨 10. 0 g

　　牛肉膏 3. 0 g

　　氯化钠 5. 0 g

　　琼脂 15. 0 g~ 20. 0 g

　　蒸馏水 1 000. 0 mL

　　A.3.2 制法

　　将上述成分混合后 ,加热溶解 ,调 pH 为 7. 5±0. 2,分装到玻璃容器内 , 121 ℃高压灭菌 20 min, 每平板倾注 15 mL~ 20 mL琼脂 ,备用 。

　　A.4 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST肉汤)发酵管

　　A.4. 1 成分

　　胰蛋白胨 20. 0 g

　　氯化钠 5. 0 g

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　　乳糖

　　5. 0 g

　　磷酸氢二钾

　　2. 75 g

　　磷酸二氢钾

　　2. 75 g

　　月桂基硫酸钠

　　0. 1 g

　　蒸馏水

　　1 000. 0 mL

　　A.4.2 制法

　　准确称 取 以 上 各 成 分 溶 解 于 蒸 馏 水 中 , 调 pH 为 7. 4± 0. 1。 分 装 到 内 有 倒 立 小 玻 璃 产 气 管 的20 mm×200 mm 试管中 ,每管 10 mL,115 ℃灭菌 15 min。

　　A.5 煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLG肉汤)发酵管

　　A.5. 1 成分

　　蛋白胨 10. 0 g

　　乳糖 10. 0 g

　　牛胆粉(oxgall或 oxbile)溶液 200. 0 mL

　　0. 1%煌绿水溶液 13. 3 mL

　　蒸馏水 800. 0 mL

　　A.5.2 制法

　　将蛋