GB/T 46303-2025 螺旋藻种质资源鉴定技术规范

　　ICS 65. 150 CCS B 51

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 46303—2025

　　螺旋藻种质资源鉴定技术规范

　　Technicalspecification foridentification ofSpirulina (Arthrospira) species

　　2025-10-05发布 2026-11-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 46303—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中国标准化研究院提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国科学院烟台海岸带研究所 、烟台市科技创新促进中心 、山东省农业科学院 、中国石油大学(华东) 、中国标准化研究院 、福清市新大泽螺旋藻有限公司 、中国科学院过程工程研究所 、内蒙古再回首生物工程有限公司 。

　　本文件主要起草人 :秦松、陈军、陈高、葛保胜、王寅初、崔玉琳、马爱进、王康、肖玉朋、黄永东、苏勇宁、王秀峰 、赵琳 。

　　Ⅰ

　　GB/T 46303—2025

　　螺旋藻种质资源鉴定技术规范

　　1 范围

　　本文件规定了螺旋藻种质资源鉴定内容 、结果鉴定的要求 ,描述了相应的鉴定方法 。

　　本文件适用于钝顶螺旋藻(Limnospira/Arthrospira/Spirulina platensis) 和极大螺旋藻(Limno- spira/Arthrospira/Spirulina maxima)种质资源鉴定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　GB/T 34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 鉴定内容

　　鉴定内容应符合表 1 的规定 。

　　表 1 螺旋藻基本性状与种质资源鉴定项目

　　性状

　　鉴定项 目

　　形态学特征

　　藻丝直径 、螺旋距离 、螺旋幅度 、细胞横壁收缢情况 、末端细胞形状 、有无气囊

　　分子生物学特征

　　核糖体 16S亚基编码序列(16S rDNA) 、数目可变串联重复序列(VNTR)

　　5 试剂或材料

　　除非另有规定 ,仅使用分析纯试剂 。

　　5. 1 试剂

　　5. 1. 1 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,C19 H42BrN) ,CAS: 57-09-0。

　　5. 1.2 三氯甲烷(CHCl3 ) ,CAS:67-66-3。

　　5. 1.3 异戊醇(C5 H12O) ,CAS:123-51-3。

　　5. 1.4 异丙醇(C3 H8 O) ,CAS:67-63-0。

　　5. 1.5 苯酚(C6 H6 O) ,CAS:108-95-2。

　　5. 1.6 乙醇(C2 H6 O) ,CAS:64-17-5。

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　　5. 1.7 溴酚蓝(C19 H10Br4 O5 S) ,CAS:115-39-9。

　　5. 1. 8 乙二胺四乙酸(EDTA,C10 H16N2 O8 ) ,CAS:60-00-4。

　　5. 1.9 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4 H11NO3 ) ,CAS:77-86-1。

　　5.2 溶液配制

　　5.2. 1 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液配制

　　称取 4 gCTAB和 16. 364 g NaCl,使用 70 mL去离子水溶解 ,加入 20 mL 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 8. 0)和 8 mL 0. 5 mol/L乙二胺四乙酸 ,并定容至 200 mL。使用前需加入 2%巯基乙醇并置于 65 ℃水浴锅中预热 。

　　5.2.2 三氯甲烷 : 异戊醇(24 : 1)配制

　　分别量取 240 mL三氯甲烷与 10 mL异戊醇 ,混合均匀后置于 4 ℃保存 。

　　5.2.3 酚 : 三氯甲烷 : 异戊醇(25 :24 : 1)配制

　　将液化苯酚置于 68 ℃溶解 ,加入羟基喹啉至终浓度为 0. 1% 。加入等体积的 0. 5 mol/L TrisHCl (pH 8. 0) ,待两相分开后 ,小心移出上层水相液 。加入等体积的 0. 1 mol/L TrisHCl(pH 8. 0) ,充分混匀后充分移出上层水相液 。重复抽提 ,直至酚相 pH 大于 7. 8。将平衡酚 、三氯甲烷和异戊醇按体积比25 ∶ 24 ∶ 1混合 ,置于 4 ℃避光条件下保存 。

　　5.2.4 Tris-EDTA(TE)缓冲液配制

　　分别量取 5 mL1 mol/LTris-HCl(pH 8. 0)和 1 mL0. 5 mol/LEDTA(pH 8. 0) ,加入 400mL去离子水 ,充分混匀后定容至 500 mL。高温高压灭菌 ,室温保存 。

　　5.2.5 RNA 酶 A(RNaseA)母液配制

　　称取 100 mg RNaseA粉末 ,溶于 10 mmol/L Tris HCl(pH 7. 5) 和 15 mmol/L NaCl中 ,定容至10 mL,于 100 ℃加热 15 min,缓慢冷却至室温 ,分装后置于 -20℃保存 。

　　5.2.6 蛋白酶 K 母液配制

　　称取 200 mg 的 蛋 白 酶 K 粉 末 , 溶 于 无 菌 去 离 子 水 中 , 轻 轻 摇 动 , 直 至 完 全 溶 解 , 加 水 定 容 到10 mL,分装后置于 -20℃保存 。

　　6 仪器设备

　　6. 1 分析天平 :精确度 0. 001 g。

　　6.2 高压蒸汽灭菌锅 :0. 1 MPa,121 ℃ 。

　　6.3 光学显微镜 :10倍目镜 ,20倍 ~40倍物镜 。

　　6.4 高速冷冻离心机 :12 000 r/min,4 ℃ 。

　　6.5 恒温水浴锅 :室温(RT) ~ 100 ℃ ± 1 ℃ 。

　　6.6 电泳仪 :120V,45 min。

　　6.7 凝胶成像仪 :检测波长 302 nm。

　　6. 8 紫外-可见光分光光度计 :波长范围 190 nm~ 1 100 nm。

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　　7 鉴定方法

　　7. 1 样本采集

　　应采集培养成熟 、健康状态下的新鲜螺旋藻 。

　　7.2 分离纯化

　　7.2. 1 微吸管分离法

　　扎鲁克(Zarrouk)液体培 养 基 配 方 见 附 录 A。 用 培 养 基 稀 释 检 测 样 品 至 适 宜 微 吸 管 吸 取 单 丝 浓度 ,用微吸管吸取待分离样品 , 以小水滴置于已消毒的载玻片上 4 滴 ~ 5 滴 。显微镜/肉眼观察下 ,用干净的微吸管吸取单个藻丝体置于事先准备好的 Zarrouk液体培养基中进行培养 。

　　7.2.2 平板分离法

　　按照附录 A 的培养基配方配置 Zarrouk液体和固体培养基 。用 Zarrouk液体培养基稀释检测样品至适宜固体平 板 分 离 单 丝 浓 度 , 取 金 属 接 种 环 经 灼 烧 灭 菌 冷 却 后 , 无 菌 条 件 下 蘸 取 待 分 离 样 品 在Zarrouk 固体培养基上轻轻做平行划线或连续划线 。然后在无菌适宜条件下培养至在固体培养基上生长出相互隔离的藻类群落 。用解剖针取藻落放入已灭菌的 Zarrouk 液体培养基中进行培养 ,镜检无其他生物混杂即达到分离目的 。

　　7.3 单种培养

　　将分离纯化出来的单藻丝或其藻落进行富集培养 ,使藻细胞增殖到后续鉴定所需藻体浓度 。

　　7.4 形态学鉴定

　　取适量培养的藻液 滴 在 载 玻 片 上 , 加 上 盖 玻 片 , 在 显 微 镜 下 镜 检 观 察 并 记 录 是 否 满 足 藻 丝 形 态特征 。

　　7.5 分子鉴定

　　7.5. 1 DNA提取步骤

　　螺旋藻基因组 DNA提取步骤如下 :

　　a) 取 0. 5 g新鲜藻体或藻粉 ,用蒸馏水洗涤 3 遍 ,液氮研磨后分别转入含有 5 倍于藻体沉淀体积的 CTAB缓冲液的离心管中 ;

　　b) 65 ℃温浴 2 h,期间每 10 min颠倒混匀 2 次 ~ 3 次 ;

　　c) 2 000 r/min离心 10 min,取上清液转移到另一离心管中 ;

　　d) 冷却至室温后 ,加入等体积的三氯甲烷 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1) ,轻轻颠倒混匀 ,重复 3 次 ;

　　e) 12 000 r/min离心 10 min,取上清液 ;

　　f) 加入等体积的 -20℃预冷异丙醇 ,轻轻颠倒混匀 ,于 -20℃冰箱放置 1 h;

　　g) 12 000 r/min离心 10 min,取沉淀部分 ;

　　h) 用 1 mL 70%乙醇 ,洗两次 ,再用无水乙醇洗一次 ;

　　i) 倒去乙醇 ,将 DNA沉淀在超净工作台内吹干 ;

　　j) 加 入 100 μL TE 缓 冲 液 , 完 全 溶 解 后 , 再 加 入 5 μL RNase A ( 10 mg/mL) 至 终 浓 度50 μg/mL, 37 ℃温浴 1 h;

　　k) 加入等体积的酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1) ,颠倒混匀 ,12000 r/min离心 10min,取上

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　　清液至另一离心管中 ;

　　l) 重复步骤 k) ;

　　m) 加蛋白酶 K 至 200 μg/mL,37 ℃温浴 1 h;

　　n) 重复步骤 k)和 l) ;

　　o) 加 2倍体积的无水乙醇 、1/2体积的 NaCl,混匀后在 -20℃放置 1h;

　　p) 重复步骤 g) ~i) ,加 100 μLTE缓冲液 ,室温下放置 1 h~ 2 h,直至完全溶解 ;

　　q) 所提 DNA浓度及纯度测定按 GB/T 34796的规定执行 ;

　　r) 将 DNA溶液用 TE缓冲液稀释至 100 ng/μL的浓度 ,置于 -20℃的冰箱中保存备用 。

　　7.5.2 16SrDNA鉴定

　　7.5.2. 1 聚合酶链式反应(PCR)扩增

　　以所提取的螺旋藻基因组 DNA为模板 ,使用符合附录 B要求的 16S rDNA 引物 , 以钝顶和极大螺旋藻标准株基因组 DNA 为阳性对照 , 以 TE缓冲液为阴性对照 ,进行 PCR 扩增 。PCR 扩增反应体系为 25μL,含 2. 5 μL10×PCR缓冲液 ,10 ng模板 DNA,2. 5 mmol/L Mg2+ ,1. 5 U Taq酶 ,200 nmol/L引物 ,200 μmol/L dNTP,最后添加去离子水至总体积为 25 μL。然后 94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性30 s, 60 ℃复性 30 s,72 ℃延伸 1 min,35个循环后 ,72 ℃延伸 10 min。

　　7.5.2.2 测序分析

　　使用 DNA 片段胶回收试剂盒回收并纯化目的片段 。将回收的 目 的片段同 T 载体进行连接 ,使 目的片 段 和 载 体 的 摩 尔 比 为 5 ∶ 1, 然 后 通 过 热 激 转 化 法 进 行 细 菌 转 化 。 挑 去 转 化 后 的 单 克 隆 进 行 培养 ,用质粒纯化试剂盒从细菌克隆中提取和纯化质粒 DNA。纯化后的质粒 DNA 在 DNA 测序仪上采用桑格(Sanger)双脱氧链终止法原理在进行测序分析 。

　　7.5.3 数目可变串联重复序列(VNTR)鉴定

　　7.5.3. 1 PCR扩增

　　以所提取的螺旋藻基因组 DNA 为模板 ,使用附录 B 中的 VNTR 引物 , 以钝顶和极大螺旋藻标准株基因 组 DNA 为 阳 性 对 照 , 以 TE 缓 冲 液 为 阴 性 对 照 , 进 行 PCR 扩 增 。 PCR 扩 增 反 应 体 系 为25μL, 含 2. 5 μL10×PCR缓冲液 ,10ng模板 DNA,2. 5 mmol/L Mg2+ ,1. 5 UTaq酶 ,200 nmol/L引物 ,200 μmol/L dNTP,最 后 添 加 去 离 子 水 至 总 体 积 为 25 μL。 然 后 94 ℃预 变 性 5 min, 94 ℃变 性30 s, 60 ℃复性 30 s,72 ℃延伸 1 min,35个循环后 ,72 ℃延伸 10 min。

　　7.5.3.2 测序分析

　　取 20 μLPCR扩增产物 ,加 5 μL溴酚蓝后在 1%琼脂糖凝胶中电泳 1 h。琼脂糖凝胶经 EB染色后 ,在紫外灯下观察结果 。使用 DNA 片段胶回收试剂盒回收并纯化 目 的片段 。将回收的 目 的片段同T载体进行连接 ,通过热激转化法进行细菌转化 。挑取转化后的单克隆进行培养 ,用质粒纯化试剂盒从细菌克隆中提取和纯化质粒 DNA。纯化后的质粒 DNA 在 DNA测序仪上采用 Sanger双脱氧链终止法在进行测序分析 。

　　8 结果鉴定

　　8. 1 螺旋藻属

　　应符合附录 C 中钝顶螺旋藻或极大螺旋藻的形态学特征 , 16S rDNA 序列相似度不应低于附录 D

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　　中的螺旋藻标准序列的 94. 5% ,且序列覆盖度达到 90%以上者 ,可判定为螺旋藻属 。

　　8.2 钝顶螺旋藻

　　符合附录 C 中钝顶螺旋藻的形态学特征 ,16S rDNA序列和 VNTR序列相似度均应达到附录 D 和附录 E 中钝顶螺旋藻标准序列的 97. 5%以上 ,且序列覆盖度达到 90%以上者 ,可鉴定为钝顶螺旋藻 。

　　8.3 极大螺旋藻

　　符合附录 C 中极大螺旋藻的形态学特征 ,16S rDNA序列和 VNTR序列相似度均应达到附录 D 和附录 E 中极大螺旋藻标准序列的 97. 5%以上 ,且序列覆盖度达到 90%以上者 ,可鉴定为极大螺旋藻 。

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　培养基配方

　　A. 1 Zarrouk氏营养液配方

　　使用改良的 Zarrouk 氏营养液 ,配方应符合表 A. 1 的要求 。

　　表 A. 1 改良的 Zarrouk氏营养液配方

　　成分

　　每升用量

　　成分

　　每升用量

　　NaHCO3

　　16. 80 g

　　K2 SO4

　　1. 00 g

　　K2 HPO4

　　0. 50 g

　　CaCl2 · 2H2 O

　　0. 04 g

　　NaCl

　　1. 00 g

　　EDTA

　　0. 08 g

　　NaNO3

　　2. 50 g

　　A5溶液

　　1 mL

　　MgSO4 · 7H2 O

　　0. 20 g

　　B6溶液

　　1 mL

　　FeSO4 · 7H2 O

　　0. 01 g

　　—

　　—

　　注 1: A5溶 液 : H3BO3 2. 86 g/L、MnCl2 · 4H2 O 1. 8 g/L、ZnSO4 · 7H2 O 0. 2 g/L、CuSO4 · 5H2 O 0. 08 g/L、 MoO3 0. 01 g/L。

　　注 2: B6 溶 液 : NH4VO3 22. 9 g/L、NiSO4 · 7H2 O 47. 8 g/L、Na2WO4 17. 9 g/L、Ti2 (SO4 ) 3 40. 0 g/L、 Co(NO3 ) 2 · 6H2 O 4. 4 g/L。

　　注 3: 配制完成后用 HCl或 NaOH 溶液调整 pH 为 8~ 10。

　　A.2 Zarrouk氏固体培养基

　　添加 1. 5%琼脂到改 良 的 Zarrouk 氏 液 体 培 养 基 中 , 121 ℃灭 菌 20 min。 待 冷 却 后 , 即 得 改 良 的Zarrouk 氏固体培养基 。

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　　附 录 B (规范性)引物序列

　　B. 1 16SrDNA 引物序列

　　16S-27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。

　　16S-1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

　　16S rDNA 引物扩增可得到约 1500 bp基因片段产物 。

　　B.2 VNTR 引物序列

　　VNTR-F:5'-GAACATTTACGGTTTTAC-3'。

　　VNTR-R:5'-CCTTACCAGTCCCACACC-3'。

　　钝顶螺旋藻 VNTR 引物扩增可得到约 1 000 bp基因片段产物 。

　　极大螺旋藻 VNTR 引物扩增可得到约 1 300 bp基因片段产物 。

　　7

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　　附 录 C

　　(规范性)

　　钝顶和极大螺旋藻主要形态学特征

　　典型钝顶螺旋藻和极大螺旋藻形态学特征应符合表 C. 1 的要求 。

　　表 C. 1 典型钝顶螺旋藻和极大螺旋藻形态学特征

　　项 目

　　钝顶螺旋藻

　　极大螺旋藻

　　藻丝直径/μm

　　4~ 7

　　8~ 12

　　螺旋距离/μm

　　22~ 40

　　34~ 51

　　螺旋幅度/μm

　　16~ 32

　　34~ 51

　　细胞横壁收缢情况

　　略收缢

　　无收缢或略收缢

　　末端细胞形状

　　末端细胞钝圆 ,无帽状结构

　　略窄 ,末端细胞外壁增厚成帽状结构

　　气囊

　　有

　　有

　　标准形态

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　　附 录 D

　　(规范性)

　　16SrDNA序列

　　D. 1 钝顶螺旋藻 16SrDNA标准序列

　　钝顶螺旋藻 YZ株 系 全 基 因 组(GenBank 登 录 号 CP013008. 1, 选 取 位 置 2462968-2464259) , 序 列如下 :

　　D.2 极大螺旋藻 16SrDNA标准序列

　　极大螺旋藻 FACHB438株系(GenBank登录号 :FJ826622. 1) ,序列如下 :

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　　附 录 E (规范性) VNTR序列

　　E. 1 钝顶螺旋藻 VNTR序列

　　E.2 极大螺旋藻 VNTR序列

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