GB/T 21793-2025 化学品 体外哺乳动物细胞基因突变试验方法

　　ICS 13.300 CCS A 80

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21793—2025代替 GB/T21793—2008

　　化学品 体外哺乳动物细胞

　　基因突变试验方法

　　Chemicals—Testmethod ofin vitro mammalian cellgenemutation

　　2025-08-29发布 2025-12-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21793—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T21793—2008《化学品 体外哺乳动物细胞基因突变试验方法》,与 GB/T 21793— 2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 增加了术语和定义中的一部分内容(见 3. 1、3. 9、3. 10、3. 11、3. 12、3. 13、3. 14、3. 15、3. 16、3. 17、 3. 18、3. 19) ;

　　— 增加了缩略语(见第 4章) ;

　　— 删除了 TK 突 变 检 测 的 原 则(见 2008年 版 的 3. 1) 及 TK 突 变 检 测 的 步 骤(见 2008年 版 的4. 3. 2. 2、4. 3. 2. 3) ;

　　— 删除了 TK位点对应的可用作阳性对照的化学品(见 2008年版的 4. 2. 3. 2) ;

　　— 更改了 “溶剂/赋形剂 ”规定中的部分内容 ,对溶剂/赋形剂以及受试物浓度范围的确立进行了补充(见 5. 2. 1,2008年版的 4. 2. 1) ;

　　— 增加了受试物处理时自发突变频率的一般原则(见 5. 3. 1. 2) ;

　　— 增加了表型表达时间和突变频率检测(见 5. 3. 2) ;

　　— 增加了实验室的检测能力(见 5. 3. 3) ;

　　— 增加了历史对照数据(见 5. 3. 4) ;

　　— 增加了试验数据可接受标准(见 6. 2) ;

　　— 更改了结果评价和解释中试验结果阴性和阳性的判断标准(见 6. 3. 1、6. 3. 2、6. 3. 3、6. 3. 4、6. 3. 5, 2008年版的 5. 2) ;

　　— 增加了细胞毒性和细胞突变频率计算公式(见附录 A) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 、华北理工大学 、中检科健(天津)检验检测有限责任公司 。

　　本文件主要起草人 :王伟轩 、张艳淑 、郝瀚 、李斌 、张意 、陈宵 、肖经纬 、李逸飞 、马秀玲 。

　　本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　— 2008年首次发布为 GB/T 21793—2008;

　　— 本次为第一次修订 。

　　Ⅰ

　　GB/T 21793—2025

　　引 言

　　体外哺乳动物基因突变试验可用于检测化学品诱发的基因突变 。可选用的细胞株包括中国仓鼠细胞的 CHO、CHL和 V79株 ,小鼠淋巴瘤细胞 L5178Y 和人类淋巴母细胞 TK6, CHO 来源的 AS52细胞 。在这些细 胞 株 中 , 最 常 用 的 遗 传 学 突 变 检 测 指 标 是 检 测 次 黄 嘌 呤-鸟 嘌 呤 磷 酸 核 糖 基 转 移 酶(HPRT)突变和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XPRT) 的基因突变 。 HPRT 和 XPRT 突变试验检测不同的遗传突变 。XPRT位于常染色体 ,可检测 HPRT(位于 X染色体) 不能检测的遗传突变 ,如大片段缺失 。

　　在体外哺乳动物细胞基因突变试验中 ,可使用已建立的细胞系或细胞株培养物 。根据在培养基中的生长能力和自发突变率是否稳定来选择细胞 。体外试验通常都需用外源性代谢活化系统 。但外源性代谢活化系统不能完全模拟哺乳动物体内的代谢条件 , 因此采取措施避免出现无法反映体内基因突变的情况 。pH值和重量渗透压浓度的改变或受试物的细胞毒性较高等可导致假阳性结果 ,从而使试验结果无法反映体内基因突变的真实情况 。

　　本试验可用于哺乳动物致突变剂和致癌剂的筛查 。本试验中阳性结果通常见于致癌剂 ,但本试验结果与致癌性的相关性有限 ,取决于化学品机制 。相关性取决于化学品的种类 。大量证据表明 ,很多致癌物通过其非遗传毒性机制发挥作用或因其致癌机制在这些细胞中不容易被检测出而无法在本试验中获得阳性结果 。

　　Ⅱ

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　　化学品 体外哺乳动物细胞

　　基因突变试验方法

　　1 范围

　　本文件规定了化学品体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则 、试验方法 、试验数据和报告 。

　　本文件适用于检测化学品体外哺乳动物细胞基因突变 。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件 。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3. 1

　　突变 mutation

　　发生在基因 DNA碱基对序列或染色体结构上的可遗传性改变 。

　　3.2

　　碱基对置换突变剂 basepairsubstitution mutagens

　　能够引起 DNA 中一个或几个碱基对置换的物质 。

　　3.3

　　表型表达时间 phenotypicexpression time

　　受试物处理后 ,遗传改变在基因组中固定同时原有的基因产物(如酶或蛋白质)被充分消耗 ,直至表型特征能够被检测到所需的时间 。

　　3.4

　　突变频率 mutantfrequency

　　通过选择性培养基(如含 6-硫鸟嘌呤的培养基)检测到的突变体细胞的比例 。

　　3.5

　　克隆效率 cloning efficiency

　　能够增殖形成可计数克隆的细胞占总接种细胞数的百分比 。

　　注 : 细胞在低密度下接种 , 即细胞分散 、互不接触 。

　　3.6

　　遗传毒性 genotoxicity

　　DNA或染色体所有类型的损伤 ,包括 DNA损伤 、染色体损伤和基因突变等 。

　　注 : 并非所有类型的遗传毒性效应都会导致基因突变或稳定的染色体损伤 。

　　3.7

　　细胞毒性 cytotoxicity

　　处理组细胞的克隆效率与阴性对照组的比值降低 。

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　　3. 8

　　相对存活率 relativesurvival;RS

　　处理组细胞经数量调整后的克隆效率与溶剂对照组克隆效率的百分比 。

　　3.9

　　S9 肝组分 S9 liver fractions

　　用 9000g离心后的肝匀浆上清液 。

　　注 : 肝粗提物 。

　　3. 10

　　S9 混合物 S9 mix

　　肝脏 S9 组分和代谢酶活性所需辅助因子的混合物 。

　　3. 11

　　溶剂对照 solventcontrol

　　试验中使用与处理组相同体积和类型的溶剂 ,但仅含溶剂不含测试化学物质的对照组 。

　　注 : 用于排除溶剂对试验结果的潜在影响 。

　　3. 12

　　未处理对照 untreated control

　　不接受处理(即不含试验化学物和溶剂) 。

　　注 : 与接受试验化学物的处理培养物处理方式相同 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　HPRT:次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase)

　　XPRT:黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase)

　　5 试验基本原则

　　5. 1 在 HPRT 和 XPRT基因突变试验中 , 突变细胞因缺乏 Hprt(HPRT测试) 或鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)转基因(XPRT测试)的酶活性 , 能够抵抗嘌呤类似物 6-硫鸟嘌呤(TG) 的细胞毒性作用 ; 而正常细胞因保留上述酶活性 ,可代谢 TG 生成毒性核苷酸 ,抑制 DNA合成并阻断细胞分裂 ,从而在含TG 的选择性培养基中死亡 。突变细胞在 TG存在下持续增殖形成可见克隆 , 而正常细胞因代谢毒性产物的积累无法存活 。

　　5.2 在加入或不加入代谢活化系统的条件下 ,悬浮或单层培养的细胞暴露于受试物一定时间(3h~ 6 h) ,然后将细胞传代培养 ,测定细胞毒性 ,并在选择突变细胞前使其表型得到表达 。 细胞毒性可通过 RS表示 , 即在处理后立即测量的克隆效率 ,并与阴性对照相比 ,根据处理期间的任何细胞损失进行调整 。处理过的培养物在生长培养基中维持足够长的时间 ,这是每种细胞类型的特征 , 以确保遗传改变在基因组中充分固定 ,且原有基因产物耗尽至表型特征稳定(通常需至少 7 d~ 9 d) 。在表型表达之后 ,通过在含有选择剂的培养基中接种已知数量的细胞检测突变菌落 ,并在不含选择剂的培养基中接种以确定克隆效率(活力) ,从而确定突变频率 。经过适当的培养时间后 ,计数克隆数 。突变频率根据突变克隆数通过突变体选择时的克隆效率进行校正计算 。

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　　6 试验方法

　　6. 1 试验准备

　　6. 1. 1 细胞

　　6. 1. 1. 1 HPRT测试和 XPRT测试所用的细胞类型应具有对化学诱变剂的敏感性 、高克隆效率 、稳定的核型和稳定的自发 突 变 频 率 。 HPRT 测 试 最 常 用 的 细 胞 包 括 中 国 仓 鼠 细 胞 的 CHO、CHL 和 V79株 ,小鼠淋巴瘤细胞 L5178Y 和人类淋巴母细胞 TK6。Xprt位点突变分析可使用含有 gpt转基因且已删除 Hprt基因的 CHO衍生 AS52细胞 ; 由于 Hprt基因已被删除 , AS52细胞不适用于 HPRT 测试 。使用其他细胞系应经过论证和验证 。

　　6. 1. 1.2 细胞系应定期检查其模态染色体数的稳定性以及是否存在支原体污染 。如果细胞受到污染或模态染色体数发生变化 ,则不应使用 。实验室应测定所用细胞的正常细胞周期时间 ,并确保其与文献报道的细胞特性一致 。实验室还应检查主细胞库的自发突变频率 ,如果突变频率超出可接受范围 ,则不应使用该细胞库 。

　　6. 1. 1.3 在进行测试之前 ,需清除已有的突变细胞 ,例如在 HAT 培养基中培养进行 HPRT 测试 ,或在MPA培养基中培养进行 XPRT测试 。清除突变的细胞可通过冷冻保存形成储备 ,解冻后可作为工作细胞库使用 。新解冻的工作库在达到正常倍增时间后可以用于测试 。在进行 XPRT 测试时 ,AS52细胞的常规培养需确保维持 gpt转基因的稳定性 。

　　6. 1.2 培养基和培养条件

　　本试验宜选用适宜的培养基和培养条件(培养皿 、体积分数为 5%的 CO2 的湿润空气和 37 ℃的培养温度) 。应确保细胞处于对数期生长 。选择培养基及培养条件时 ,需特别关注其在表达期内对细胞生长的最佳环境 , 同时确保突变与非突变细胞的克隆效率均达到最优 。

　　6. 1.3 培养准备

　　细胞系需从储存的细胞库中扩增 ,接种于培养基中的密度应确保悬浮培养或单层贴壁细胞在处理期与表达期内始终保持指数生长(避免单层细胞过度汇合) 。

　　6. 1.4 代谢活化

　　细胞株应在有或无外源性哺乳动物代谢活化系统的条件下与受试物接触 。最常用的活化系统是经酶诱导剂(Aroclor1254或苯巴比妥和 β-萘黄酮) 处理 ,从啮齿类动物肝脏制备的加有辅助因子的后线粒体组分(S9 ) 。培养基中 S9 的终体积分数范围通常为 1% ~ 2% ,最高可达 10% 。应根据受试物的特点选择代谢活化系统及其应用条件 。针对特定受试物类别(如代谢酶底物特异性或反应动力学差异) ,可能需测试不同浓度的 S9 混合物(如 1%、5%及 10%体积分数) , 以优化代谢活化条件或验证遗传毒性效应的浓度依赖性 。 所 用 外 源 代 谢 活 化 系 统 或 代 谢 诱 导 剂 的 类 型 以 及 浓 度 的 选 择 与 受 试 物 的 类 别有关 。

　　6. 1.5 受试物制备

　　固体受试物应该溶解或混悬于合适的溶剂或赋形剂中 ,在处理细胞前进行适度稀释 。液体受试物可直接加入测定体系或在处理前适度稀释 。气体或者挥发性试验化学品应根据标准步骤进行密封培养容器处理 。 除非已有数据证明受试物可以稳定保存 ,否则受试物溶液即配即用 。

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　　6.2 试验条件

　　6.2. 1 溶剂/赋形剂

　　溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应 ,且对细胞的存活和 S9 的活性无影响 。宜优先使用水性溶剂或培养基作溶剂 。例如常选择水或者二甲基亚砜作为溶剂 。一般有机溶剂不应超过 1%(体积分数) ,水溶剂(盐水或水)不应超过 10%(体积分数) 。若使用非常规溶剂(如乙醇或丙酮) ,需提供数据证明其与受试物及试验系统的相容性 ,且在使用浓度下无遗传毒性 。若无此类支持性数据 ,应设置未处理对照 , 以证明所选溶剂未诱发有害或致突变效应 。

　　6.2.2 染毒剂量

　　6.2.2. 1 在确定最高浓度时 ,应避免可能产生假阳性反应的浓度 ,例如产生过度细胞毒性 、导致培养基有沉淀、pH值或渗透压发生改变 。如果测试化学品在添加时导致培养基 pH 值发生显著变化 ,则应用缓冲液调整 pH值 , 以避免假阳性结果并保持适当的培养条件 。

　　6.2.2.2 浓度设置基于细胞毒性和其他考虑因素 。在预试验中评估细胞毒性可能有助于更好地确定正式试验中测试浓度 ,但预试验非必需 。 即使进行了初始细胞毒性评估 ,在正式试验中仍需测量每种培养物的细胞毒性 。应使用 RS评估细胞毒性 , 即处理后立即接种的细胞的克隆效率(CE) , 根据细胞计数调整受试物处理期间的任何细胞丢失 ,并与阴性对照中的调整克隆效率(指定存活率为 100%) 进行比较(按附录 A进行计算) 。

　　6.2.2.3 至少应设立 4个受试物浓度(不包括阳性组和对照组) 。宜使用重复培养 ,每个测试浓度下可以使用重复培养或单一处理培养 。对于给定浓度下的独立重复培养所得结果应分别报告 ,可以合并进行数据分析 。如有细胞毒性 ,在出现细胞毒性时 ,受试物浓度应涵盖从产生细胞毒性的浓度到具有中等或无细胞毒性的浓度范围 。 如果有数据表明受试物毒性低或者没有细胞毒性 , 浓度的梯度在 2 倍 ~ 3倍之间即可 。一些受试物的浓度反应曲线比较陡峭时 ,为了覆盖整个细胞毒性的浓度范围 ,可能需浓度梯度较大的 4个以上的浓度 ,尤其是需重复试验的情况下 。 当使用单一培养物时 ,宜使用超过 4个浓度以提高数据可靠性 。

　　6.2.2.4 如最高浓度可产生细胞毒性 ,那么细胞存活能力(相对克隆形成效率) 或相对总生长数应达到10% ~ 20%范围内(但不应低于 10%) 。

　　6.2.2.5 对于溶解性较差且在最低不溶性浓度的浓度下不具有细胞毒性的受试物 ,在用受试物处理结束时 ,所分析的最高浓度应产生肉眼可见或借助倒置显微镜可见的浑浊或沉淀 。 即使细胞毒性发生在不溶性浓度以上 ,也宜仅在低于产生浑浊或可见沉淀的以下的浓度进行测试 , 因为沉淀可能会产生人为影响 。在产生沉淀的浓度下 ,应注意确保沉淀不会干扰测试试验 。宜在试验前测定受试物在培养基中的溶解度 。

　　6.2.2.6 如果未观察 到 沉 淀 或 限 制 性 细 胞 毒 性 , 则 最 高 测 试 浓 度 应 对 应 于 10 mmol/L、2 mg/mL 或2 μL/mL, 以最低值为准 。 当受试物组成的成分不确定时 ,如未知或可变成分 、复杂反应产物或生物材料[即未知或可变组成的化学物质(UVCBs)] 、环境提取物等 ,在无足够细胞毒性的情况下 ,最高测试浓度可能更高(例如 5 mg/mL) , 以增加受试物中每个组分的浓度 。应注意 ,对于人用药物的要求可能有所不同 。

　　6.2.3 对照

　　6.2.3. 1 每个试验条件应包括阴性对照 ,该对照仅包含处理培养基中的溶剂 ,其处理方法与处理组培养物完全一致 。

　　6.2.3.2 应设置同步阳性对照 , 以验证实验室在所用测试方案条件下识别诱变剂的能力 , 以及外源代谢

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　　活化系统(如适用时)的有效性 。表 1列举了阳性对照的示例 。若经合理说明 ,也可使用其他替代性阳性对照物质 。 由于体外哺乳动物细胞遗传毒性试验已实现充分标准化 ,在使用或不使用外源代谢活化系统的处理组中 ,仅需采用一个需经代谢活化的阳性对照即可 。此时 ,该单一阳性对照的响应结果既能证明代谢活化系统的活性 ,也能体现测试系统的敏感性 。每个阳性对照应使用一个或多个预期能产生可重复且显著高于背景值的浓度 , 以此验证测试系统的灵敏度 ; 同时 ,其响应结果不应因细胞毒性超过测试指南规定的限度而受到影响 。

　　表 1 可用作阳性对照的化学品

　　代谢活化条件

　　位点

　　化学品及 CAS编号

　　不需要外源活化系统

　　Hprt

　　甲基磺酸乙酯 Ethylmethanesulfonate[CAS NO. 62-50-0]

　　乙基亚硝基脲 Ethylnitrosourea[CAS NO. 759-73-9]

　　4 硝基喹啉 1 氧化物 4-Nitroquinoline1-oxide [CAS NO. 56-57-5]

　　Xprt

　　链霉黑素 Streptonigrin[CAS NO. 3930-19-6]

　　丝裂霉素 MitomycinC [CAS NO. 50-07-7]

　　需要外源活化系统

　　Hprt

　　3-甲基胆蒽 3-Methylcholanthrene [CAS NO. 56-49-5]

　　7,12-二甲苯并蒽 7,12-Dimethylbenzanthracene [CAS NO. 57-97-6]苯并(a)芘 Benzo(a)pyrene[CAS NO. 50-32-8]

　　Xprt

　　苯并(a)芘 Benzo(a)pyrene[CAS NO. 50-32-8]

　　6.3 试验步骤

　　6.3. 1 受试物处理

　　6.3. 1. 1 在有或 无 代 谢 活 化 系 统 存 在 的 情 况 下 , 将 处 于 增 殖 期 的 细 胞 与 受 试 物 接 触 适 当 时 间(通 常3 h~ 6 h) 。接触时间也可延长至一个或多个细胞周期 。

　　6.3. 1.2 在试验的每个阶段 ,用于每个试验(对照和处理) 培养的最小细胞数的确定应基于自发突变频率 。一般原则是 :在试验的所有阶段 ,处理和传代的细胞 ,在每个培养瓶自发突变体应有至少 10个 ,理想情况是 100个突变体形成 。 自发突变频率为 5× 10- 6 ~ 20× 10- 6 。如果自发突变频率为 5× 10- 6 ,且自发突变数在 10及以上时 ,可导致 90%的细胞毒性(10%RS) ,此时 , 细胞数至少 20× 106 。此外 ,在表达期内还应培养足够数量的细胞 ,细胞的数量不应低于 200万个 。

　　6.3.2 表型表达时间和突变频率检测

　　染毒结束后 ,细胞需培养一段时间使突变表型表达 。通常至少需 7 d~ 9 d 的培养时间 ,才能让新诱发的 Hprt和 Xprt突变体达到接近最佳水平的表型表达 。在此培养阶段 ,需定期对细胞进行传代培养 ,确保其处于指数生长期 。在表型表达期结束后 , 细胞会被重新接种到含有和不含选择性试剂(6-硫鸟嘌呤)的培养基中 ,分别用于测定突变体数量和筛选时的克隆效率 。对于单层培养的细胞 ,可以使用培养皿进行接种 ;对于悬浮培养的细胞 ,可以使用微孔板 。在突变筛选时 , 细胞的接种密度应确保最佳的突变体回收率 。培养板需在适宜的条件下孵育 7 d~ 12 d, 以允许克隆充分生长 ,然后进行克隆计数 。突变频率的计算基于突变克隆数 ,并根据筛选时的克隆效率进行校正(按附录 A进行计算) 。

　　6.3.3 实验室的检测能力

　　6.3.3. 1 在使用该试验进行常规检测前 , 实验室应通过使用不同作用机制的参考阳性物质(至少选择表 1 所列物质中一种需代谢活化及一种无需代谢活化的物质) 和多种阴性对照(使用不同溶剂/溶媒)

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　　进行一系列试验 , 以验证实验室对诱变剂的检测能力及试验条件的可靠性 。这些阳性和阴性对照的反应结果应与文献报道一致 。

　　注 : 对于已具备历史数据库的实验室 ,此要求不适用 。

　　6.3.3.2 应选择多种阳性对照物质(表 1) ,分别在无代谢活化系统及有代谢活化系统的条件下进行测试 , 以证明实验室具备检测致突变物质的能力 、验证代谢活化系统的有效性 ,并确认处理阶段 、表型表达期 、突变选择期的细胞生长条件及计数程序的适用性 。所选物质的浓度范围应能产生可重复且与浓度相关的背景值以上增长 ,从而验证检测系统的灵敏度及动态范围 。

　　6.3.4 历史对照数据

　　6.3.4. 1 实验室应建立 :

　　— 历史阳性对照数据范围和分布情况 ;

　　— 历史阴性(未处理 、溶剂)对照数据范围和分布情况 。

　　6.3.4.2 在首次建立历史阴性对照数据分布时 , 同期阴性对照的检测结果应与已发表的对照数据保持一致 。 随着更多试验数据被纳入该对照分布 , 同期阴性对照的结果在理想情况下应处于该分布的 95%控制限范围内 。

　　6.3.4.3 实验室应至少完成 10次试验 ,但宜在同等试验条件下至少进行 20次试验 。 实验室应采用质量控制方法[如控制图 ,包括 C-图 或 X-bar 图(参 考 文 献[1])] , 以 分 析 阳 性 与 阴 性 对 照 数 据 的 变 异 程度 ,并证明其方法在实验室内处于可控状态(参考文献[3]) 。关于历史数据的构建与使用(如数据纳入/排除标准 、单次试验可接受判定准则) ,更多详细建议可参考相关文献(参考文献[2]) 。

　　6.3.4.4 阴性对照数据应由单次(最好为重复)培养的突变频率组成 。在理想情况下 , 同期阴性对照数据应处于实验室历史阴性对照数据库分布范围的 95%控制限内 。 当同期阴性对照数据超出 95%控制限时 ,若这些数据并非极端离群值 ,且有证据表明检测系统处于 “受控状态 ”,且无技术或人为失误的证明时 ,仍可将其纳入历史对照分布范围 。

　　6.3.4.5 任何对试验方案的修改 ,均应考虑其与实验室现有历史对照数据库的协调性 。若存在重大不一致情况 ,应建立新的历史对照数据库 。

　　7 试验数据和报告

　　7. 1 结果呈现

　　7. 1. 1 试验结果报告中应包含计算细胞毒性(以 RS表示) 所需的全部数据 。对于处理组和对照组细胞 ,数据应包括处理结束时的细胞数量 、处理后立即接种的细胞数量以及克隆数(或微孔法中无克隆的孔数) 。

　　7. 1.2 试验结果报告中还应包含计算突变频率所需的全部数据 。对于处理组和对照组细胞 ,数据应包括以下内容 :

　　a) 接种时添加选择剂与未添加选择剂的细胞数量(即进行突变选择时接种的细胞量) ;

　　b) 添加选择剂与未添加选择剂的培养皿中克隆数(或微孔法中无克隆的孔数) 。

　　7. 1.3 应提供各培养物的单独数据 。此外 ,所有数据均应以表格形式汇总 。

　　7.2 可接受标准

　　试验结果的接受性应基于以下标准 :

　　— 同期阴性对照可被接受并纳入实验室历史阴性对照数据 ;

　　— 同期阳性对照的诱导反应应与实验室历史阳性对照数据库中的结果一致 ,且与同期阴性对照相比具有统计学显著增加 ;

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　　— 除非其中一种条件已显示阳性结果 ,否则应同时测试两种试验条件(即含代谢活化系统与不含代谢活化系统) ;

　　— 可分析的细胞数量及浓度符合要求 。

　　7.3 结果评价和解释

　　7.3. 1 假设满足所有可接受标准 ,应在所检查的任何试验条件下 ,受试物均被视为明显阳性 :

　　a) 至少一种测试浓度与对应的阴性对照相比有统计学上显著的增加 ;

　　b) 当使用趋势检验进行评估时 ,这种增加与浓度有关 ;

　　c) 任何结果都超出了历史阴性对照数据的分布(例如基于泊松的 95%可信限度) 。

　　当满足所有这些标准时 ,测试化学品被认为能够在此测试系统中诱导培养的哺乳动物细胞的基因突变 。

　　7.3.2 假设所有可接受标准都得到满足 ,如果在所有测试的试验条件下 ,测试化学品被认定为阴性 :

　　a) 与同时存在的阴性对照相比 ,所有测试浓度均未表现出统计学上显著的增加 ;

　　b) 使用趋势检验进行评估时 ,没有发现与浓度相关的增加 ;

　　c) 所有结果都在历史阴性对照数据的分布范围内(例如基于泊松的 95%控制限) 。

　　当满足所有这些标准时 ,测试化学品被认为无法在该测试系统中诱导培养的哺乳动物细胞的基因突变 。

　　7.3.3 对于明确的阳性反应或阴性反应 ,不应进行验证 。

　　7.3.4 如果既不是如上所述的明显阴性也 不 是 明 显 阳 性 结 果 , 或 者 为 了 帮 助 确 定 结 果 的 生 物 学 相 关性 ,应通过专家判断和/或进一步调查来评估数据 。可通过调整试验参数[如浓度梯度间距 、代谢活化条件(即 S9 浓度或 S9 来 源)] 进 行 重 复 试 验 , 以 验 证 结 果 的 剂 量-反 应 关 系 及 代 谢 活 化 系 统 的 生 物 学 相关性 。

　　7.3.5 在极少数情况下 , 即使经过进一步调查 ,数据集仍无法得出阳性或阴性结果的结论 。测试化学反应应被认定为不确定(解释为阳性或阴性的可能性相同) 。

　　7.4 试验报告

　　7.4. 1 样品

　　样品应包含下列信息 :

　　a) 名称 、来源 、识别码 ,如 CAS编号(如已知) ;

　　b) 物理性质和纯度 ;

　　c) 与试验实施相关的物理化学特性 ;

　　d) 受试物溶解度和稳定性 ;

　　e) pH值 、渗透压和沉淀物(如适用) ;

　　f) 对于单一组分化学物质 : 外观 、水溶性和其他相关的物理化学特性 ; 化学鉴定 , 如 IUPAC或CAS名称 、CAS编号 、SMILES或 InChI代码 、结构式 、纯度 、杂质的化学特性(如适用且切实可行)等 ;

　　g) 对于多成分物质 、UVBC和混合物 :尽可能通过化学特性 、定量存在和成分的相关物理化学性质表征 。

　　7.4.2 赋形剂

　　赋形剂应包括以下信息 :

　　a) 选择溶剂/赋形剂的理由 ;

　　b) 最终培养基中溶剂/赋形剂的百分比 。

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　　7.4.3 细胞

　　细胞应包括以下信息 :

　　a) 细胞类型和来源 ;

　　b) 细胞培养皿/瓶数量 ;

　　c) 细胞传代的次数(如适用) ;

　　d) 细胞培养的维护方法(如适用) ;

　　e) 没有支原体的证据 ;

　　f) 核型特征/或染色体模式数 ;

　　g) 细胞倍增时间 。

　　7.4.4 试验条件

　　试验条件应包括以下信息 :

　　a) 细胞浓度和细胞培养数量选择的理由 ,包括细胞毒性数据和溶解度限值等 ;

　　b) 培养基成分 、CO2 浓度 、体积分数 ;

　　c) 受试物在培养基中的最终浓度(例如,μg或 mg/mL或 mmol/L) ;

　　d) 在培养基中加入的溶剂和测试化学品的浓度(和/或体积) ;

　　e) 孵育温度 ;

　　f) 孵育时间 ;

　　g) 处理持续的时间 ;

　　h) 细胞处理时的密度 ;

　　i) 代谢活化系统的类型和成分 ,包括可接受标准(S9 来源 、S9 混合物的制备方法 、S9 混合物和 S9在最终培养基中的浓度 、S9 的质量控制) ;

　　j) 阳性和阴性对照 ;

　　k) 表达期长短(包括细胞接种数 、传代和接种程序及所加培养液 ,如适用) ;

　　l) 选择剂及其浓度特征 ;

　　m) 测试可接受的标准 ;

　　n) 计数存活细胞和突变细胞的方法 ;

　　o) 克隆大小和类型认定的定义(包括所谓小克隆和大克隆的标准 ,如适用) ;

　　p) 考虑研究为阳性 、阴性或者不确定的标准 ;

　　q) 测定 pH值 、渗透压和沉淀的方法 。

　　7.4.5 结果

　　结果应包括以下信息 :

　　a) 各培养物中处理的细胞初始数量及传代培养后的细胞数量 ;

　　b) 细胞毒性测量和其他观察结果(如果有) ;

　　c) 沉淀现象和测定时间 ;

　　d) 在选择性和非选择性培养基中培养的细胞数量 ;

　　e) 非选择性培养基中的克隆数和选择性培养基中的抗性克隆数 , 以及相关的突变频率 ;

　　f) 浓度-反应关系(如果可能) ;

　　g) 同时存在的阴性(溶剂)和阳性对照数据(浓度和溶剂) ;

　　h) 历史性的阴性(溶 剂/赋 形 剂) 和 阳 性 对 照 数 据 , 包 括 范 围 、平 均 值 、标 准 差 和 置 信 区 间(例 如95%)以及数据数量 ;

　　i) 统计分析(针对单个培养物和合并重复 ,如果适用) , 以及 p 值(如果有) 。

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　　GB/T 21793—2025

　　附 录 A

　　(规范性)

　　细胞毒性和细胞突变频率计算

　　A. 1 细胞毒性是通过 RS评价的 , 即处理组调整细胞损失后的 CE 与阴性对照组调整后的 CE 的百分

　　比 ,见公式(A. 1)和公式(A. 2) 。

　　按照公式(A. 1)计算调整后的克隆效率 ,处理开始时的细胞数用于调整细胞在处理期间的损失 :

　　调整 CE= CE× 处理开始时细胞数(处理结束时细胞数) …………………………( A. 1 )

　　按照公式(A. 2)计算经试验化学品处理的培养物的 RS:

　　RS= 对照组的调整后 CE(处理组的调整后 CE) × 100% …………………………( A. 2 )

　　A.2 突变频率是指在选择性培养基中突变克隆的克隆效率除以同一培养物在筛选时测得的非选择性培养基中的克隆效率 。按照公式(A. 3)计算突变频率 :

　　突变频率 = 选 非选择培养基中的克隆效率(择培养基中突变菌落的克隆效)率 …………………( A. 3 )

　　A.3 当使用培养板测定克隆效率时 ,按照公式(A. 4)计算克隆效率 :

　　CE= 接 种细胞(克隆数)数 …………………………( A. 4 )

　　A.4 当使用微孔板测定克隆效率时 :

　　微孔板上每孔的克隆数量服从泊松分布 。按照公式(A. 5)计算克隆效率 :

　　CE …………………………( A. 5 )

　　式中 :

　　-LnP(0) — 培养板中空孔数与接种细胞的总孔数的比 。

　　LnP(0)公式(A. 6)如下 :

　　LnP = - Ln …………………………( A. 6 )

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　　GB/T 21793—2025

　　参 考 文 献

　　[1] AnalysisofDatafrom In Vitro CytogeneticAssays.In:StatisticalEvaluation ofMutagenicityTest Data.Kirkland,D.J. , (Ed) CambridgeUniversityPress,Cambridge,pp.141-154,1989.

　　[2] Compilation and use of genetic toxicity historical control data. Hayashi M , Dearfield K , KasperP,LovellD,Martus HJ,Thybaud V. MutatRes. 2011,723(2) :87-90.

　　[3] Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environ- mental, Health and Safety,Series on testing and assessment(No. 199. ) ,OECD,2014.

　　[4] Guidance for The Testing of Chemicals No. 476 In Vitro Mammalian CellGene Mutation Tests using the Hprt and xprt genes,OECD,2016.

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