GB/T 21674-2025 猪圆环病毒病诊断技术

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 21674—2025

　　代替 GB/T21674—2008,GB/T34745—2017,GB/T35901—2018,GB/T35910—2018

　　猪圆环病毒病诊断技术

　　Diagnostictechniquesforporcinecircovirusdisease

　　2025-08-29发布 2026-03-01实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　

　　发

　　

　　布

　　GB/T 21674—2025

　　目 次

　　前言 Ⅲ

　　引言 Ⅳ

　　1 范围 1

　　2 规范性引用文件 1

　　3 术语和定义 1

　　4 缩略语 1

　　5 临床诊断 2

　　6 样品采集 、保存与运输 3

　　7 病毒分离与鉴定 3

　　8 聚合酶链式反应(PCR) 5

　　9 实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR) 7

　　10 间接酶联免疫吸附试验(间接 ELISA) 9

　　11 阻断酶联免疫吸附试验(阻断 ELISA) 10

　　12 免疫组织化学试验(IHC) 11

　　13 综合判定 12

　　附录 A (规范性) 样品保存 、病毒分离与鉴定相关溶液的配制 13

　　附录 B (规范性) PCR、Real-time PCR 相关溶液的配制 14

　　附录 C (资料性) PCR、Real-time PCR 引物探针信息 、扩增片段序列及检测结果参照图 15

　　附录 D (规范性) ELISA 相关试剂的制备 17

　　附录 E (资料性) ELISA 相关抗原与血清的制备 18

　　附录 F(规范性) IHC 相关溶液的配制 22

　　Ⅰ

　　GB/T 21674—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1. 1—2020《标准化工作导则 第 1部分 :标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件代替 GB/T 21674—2008《猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法》、GB/T 34745—2017《猪圆环病毒 2 型 病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量 PCR检测方法》、GB/T 35901—2018《猪圆环病毒 2 型荧光 PCR检测方法》和 GB/T 35910—2018《猪 圆 环 病 毒 2 型 阻 断 ELISA 抗 体 检 测 方 法》。 本 文 件 以GB/T 21674—2008为 主 , 整 合 了 GB/T 34745—2017、GB/T 35901—2018、GB/T 35910—2018 的 内容 ,与 GB/T 21674—2008相比 ,除结构调整和编辑性改动外 ,主要技术变化如下 :

　　— 更改了范围(见第 1 章 ,2008年版的第 1 章) ;

　　— 删除了实验室生物安全要求(见 2008年版的第 2 章) ;

　　— 增加了缩略语(见第 4章) ;

　　— 增加了临床诊断(见第 5 章) ;

　　— 更改了样品采集 、保存与运输(见第 6章 ,2008年版的 4. 1) ;

　　— 增加了病毒分离与鉴定(见第 7章) ;

　　— 更改了聚合酶链式反应(PCR)(见第 8章 ,2008年版的第 3 章 、第 4章 、第 5 章) ;

　　— 增加了实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)(见第 9章) ;

　　— 增加了间接酶联免疫吸附试验(间接 ELISA)(见第 10章) ;

　　— 增加了阻断酶联免疫吸附试验(阻断 ELISA)(见第 11章) ;

　　— 增加了免疫组织化学试验(IHC)(见第 12章) ;

　　— 增加了综合判定(见第 13章) ;

　　— 增加了样品保存 、病毒分离与鉴定相关溶液的配制(见附录 A) ;

　　— 更改了 PCR、Real-time PCR相关溶液的配制(见附录 B,2008年版的附录 A) ;

　　— 增加了 ELISA相关试剂的制备(见附录 D) ;

　　— 增加了 IHC相关溶液的配制(见附录 F) 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。

　　本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归 口 。

　　本文件起草单位 : 中国动物卫生与流行病学中心 、河南农业大学 、中华人民共和国上海海关 、南京农业大学 、湖南农业大学 、湖南冠牧生物科技有限公司 、娄底市动物疫病预防控制中心 、上海市动物疫病预防控制中心 、河北农业大学 、湖南派智生物科技有限公司 。

　　本文件主要起草人 :董雅琴 、魏战勇 、张强 、白娟 、崔进 、魏荣 、王乃东 、赵和平 、王先炜 、房琳琳 、杨毅 、马世杰 、李健 、姜平 、杨忠苹 、谭庆辉 、杨德全 、张颜 、郑兰兰 、袁万哲 、周文锋 、谢昊飞 。

　　本文件所代替文件的历次版本发布情况为 :

　　—GB/T 21674—2008,2008年首次发布 ;

　　—GB/T 34745—2017,2017年首次发布 ;

　　—GB/T 35901—2018,2018年首次发布 ;

　　—GB/T 35910—2018,2018年首次发布 。

　　Ⅲ

　　GB/T 21674—2025

　　引 言

　　猪 圆 环 病 毒 病 (Porcine circovirus disease, PCVD) , 又 称 为 猪 圆 环 病 毒 相 关 疾 病 ( Porcine circovirus-associated disease,PCVAD) ,是由猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type2,PCV2) 感染猪引起的一系列疾病的 总 称 。PCVD 有 不 同 的 临 床 表 现 , 包 括 猪 圆 环 病 毒 2 型 系 统 性 疾 病(PCV2 sys- temicdisease,PCV2-SD) 、猪圆环病毒 2 型繁殖性疾病(PCV2 reproductivedisease,PCV2-RD) 、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)及亚临床感染 。过去称为断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS) 的疾病以及 PCV2引起的呼吸道和肠道相关疾病已被证明是 PCV2-SD 的一部分 。PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae) 、圆环病毒属(Circovirous)单股环状 DNA 病 毒 , 感 染 猪 后 可 导 致 免 疫 抑 制 , 易 与 其 他 病 毒 或 细 菌 引 起 混 合 感染 ,造 成 猪 只 生 长 发 育 受 阻 , 免 疫 系 统 受 损 等 。 PCV2 与 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 ( Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) 、猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV) 、副猪格拉瑟菌 、猪肺炎支原体等病原的共感染往往会诱发或促进 PCVD 的发生 。PCVD在全球范围内广泛流行 ,各日龄和品种的猪均可发生 ,其中仔猪和母猪受到的危害相对较重 。该病因其发病率高 、流行较广 、易引起免疫抑制等特点,给养猪业造成了较重的经济损失 。在我国现行《一 、二 、三类动物疫病病种名录》中 ,该病为三类动物疫病 。

　　本文件诊断技术内 容 包 括 临 床 诊 断 、病 原 学 诊 断 和 血 清 学 诊 断 , 结 合 我 国 相 关 技 术 研 究 新 成 果修订 。

　　Ⅳ

　　GB/T 21674—2025

　　猪圆环病毒病诊断技术

　　1 范围

　　本文件描述了猪圆环病毒病(PCVD) 的临床诊断 、病毒分离与鉴定 、聚合酶链式反应(PCR) 、实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR) 、间接酶联免疫吸附试验(间接 ELISA) 、阻断酶联免疫吸附试验(阻断 ELISA) 、免疫组织化学试验(IHC)等方法 。

　　本文件适用于 PCVD 的诊断 、检疫 、检测 、监测和流行病学调查 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 , 注 日期的引用文件 ,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件 。

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集 、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件 。

　　AEC:3-氨基-9-乙基咔唑(3-Amino-9-Ethylcarbazole)

　　BSA:牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)

　　Ct:循环阈值(Cycle Threshold)

　　DAB:二氨基联苯胺(Diaminobenzidine)

　　DAPI:4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)

　　DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethy Pyrocarbonate)

　　DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(Ethylene DiamineTeraacetic Acid)

　　ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)

　　FITC:异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate)

　　HRP:辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase)

　　IFA: 间接免疫荧光试验(IndirectImmunofluorescence Assay)

　　IHC:免疫组织化学试验(ImmunohistochemicalAssay)

　　IPMA:免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase MonolayelAssay)

　　MEM :最低限度必需氨基酸营养液(Minimum EssentialMedium)

　　OD:光密度(OpticalDensity)

　　PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)

　　PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　1

　　GB/T 21674—2025

　　PCV2:猪圆环病毒 2 型(Porcine CircovirusType2)

　　PCV2-RD:猪圆环病毒 2 型繁殖性疾病(PCV2Reproductive Disease)

　　PCV2-SD:猪圆环病毒 2 型系统性疾病(PCV2Systemic Disease)

　　PCVD:猪圆环病毒病(Porcine Circovirus Disease)

　　PDNS:猪皮炎与肾病综合征(Porcine Dermatitis Nephropathy Syndrome)

　　PK-15:猪肾细胞系(Pig Kidney-15CellLine)

　　TAE:三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-acetic Acid-EDTA Buffer)

　　TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)

　　Triton X-100: 曲拉通 X-100,聚乙二醇辛基苯基醚(2-(2-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)Phenoxy] Ethoxy)Ethanol)

　　5 临床诊断

　　5. 1 流行病学

　　5. 1. 1 猪是天然宿主 ,家猪 、野猪均是易感动物 ,各种年龄 、品种的猪均易感 。

　　5. 1.2 传染源主要为病猪 、临床健康带毒猪 。

　　5. 1.3 主要通过消化道 、呼吸道等途径传播 ,也可由发病或带毒妊娠母猪通过胎盘感染胎儿 。

　　5.2 临床症状

　　5.2. 1 猪圆环病毒 2 型系统性疾病(PCV2-SD)

　　病猪表现为生长迟缓 、消瘦 ,常伴有呼吸困难和腹股沟淋巴结肿大,偶发黄疸 。

　　5.2.2 猪圆环病毒 2 型繁殖性疾病(PCV2-RD)

　　妊娠母猪出现繁殖障碍 ,主要表现为妊娠早期频繁返情 ,妊娠晚期流产 、产死胎 。

　　5.2.3 猪皮炎与肾病综合征(PDNS)

　　病猪皮肤出现以红紫色斑疹和丘疹为特征的出血性和坏死性皮肤病变 ,主要出现在后肢和会阴部 。

　　5.3 病理变化

　　5.3. 1 PCV2-SD

　　病变主要见于淋巴组织 。剖检可见淋巴结肿大 ,胸腺皮质萎缩 。镜检可见淋巴组织出现中度到重度的组织病理变化 ,表现为淋巴结中淋巴细胞减少 、大量组织细胞和多核巨细胞浸润 ,胸腺中组织细胞或树突状细胞可见胞内病毒包涵体 。

　　5.3.2 PCV2-RD

　　死胎或不能存活的新生仔猪表现为肝充血和心肌肥大 ,心肌多灶性变色 ,有时可见胎儿心脏明显肥大 。镜检可见胎儿心肌损伤 ,表现为大面积纤维素性或坏死性心肌炎 。

　　5.3.3 PDNS

　　病变主要表现为全身性坏死性血管炎和坏死性纤维素性肾小球肾炎 , 肾脏肿胀 、苍白 ,皮质大面积淤血 。镜检可见有纤维蛋白和中性粒细胞填充并阻塞 Bowman’s间隙 ,伴有非化脓性间质性肾炎 。

　　2

　　GB/T 21674—2025

　　5.4 结果判定

　　5.4. 1 符合流行病学特征 , 出现 5. 2. 1 临床症状和 5. 3. 1 病理变化 ,可初步判定为疑似 PCV2-SD病例 。确诊应采集疑似发病猪的淋巴结 ,进行第 7章或第 12章的病原检测 。

　　5.4.2 符合流行病学特征 , 出现 5. 2. 2 临床症状和 5. 3. 2病理变化 ,可初步判定为疑似 PCV2-RD病例 。确诊应采集疑似发病猪流产死胎的心脏 、淋巴结等组织样品 ,进行第 7章或第 12章的病原检测 。

　　5.4.3 符合流行病学特征 , 出现 5. 2. 3 临床症状和 5. 3. 3病理变化 ,可判定为 PDNS病例 。

　　5.4.4 PCV2普遍存在 ,但大多数属于亚临床感染 。PCV2感染的确诊应采集疑似感染猪的血清 、淋巴结 、流产死胎心脏等样品 ,进行第 8章 ~第 11章的 PCV2核酸或抗体检测 。

　　6 样品采集、保存与运输

　　6. 1 仪器设备

　　6. 1. 1 台式高速冷冻离心机 。

　　6. 1.2 组织匀浆机或研磨器 。

　　6. 1.3 无菌手术刀 、剪刀 、镊子 。

　　6. 1.4 真空采血管(不含 EDTA抗凝剂) 、无菌注射器 。

　　6. 1.5 无菌离心管(2 mL、15 mL) 、样品保存管 。

　　6.2 试剂材料

　　6.2. 1 PBS,按照附录 A 中 A. 1 配制 。

　　6.2.2 4%多聚甲醛 ,按照 A. 2 配制 。

　　6.3 样品采集

　　6.3. 1 血液样品 : 用 真 空 采 血 管(不 含 EDTA 抗 凝 剂) 或 无 菌 注 射 器 采 集 受 检 猪 前 腔 静 脉 血 不 少 于5 mL,室温凝固后分离血清 。血清样品可用于病毒分离与鉴定 、核酸检测和抗体检测 。

　　6.3.2 组织样品 :无菌采集病死猪的淋巴结 、流产死胎心脏等组织样品 , 至少取 5 g 组织 ,装入 15 mL灭菌离心管中 ,编号备用 。组织样品可用于病毒分离与鉴定 、IHC 和核酸检测 。

　　6.4 样品保存与运输

　　6.4. 1 采 集 后 无 法 立 即 检 测 的 样 品 , 可 于 2 ℃ ~ 8 ℃暂 存 , 但 不 应 超 过 24 h, 也 可 冻 存 于 - 20 ℃冰箱 ,长期保存应置于 -70℃冰箱 。应尽快采用低温保存方式将样品送达检测实验室 ,按 NY/T 541 的规定执行 。

　　6.4.2 用于病毒分离的样品应于 48h 内送达检测实验室 。

　　6.4.3 用于 IHC 检测的组织样品应立即浸泡于 4%多聚甲醛中 ,并于 48h 内送达检测实验室 。

　　7 病毒分离与鉴定

　　7. 1 仪器设备

　　7. 1. 1 生物安全柜 。

　　7. 1.2 二氧化碳培养箱 。

　　7. 1.3 倒置荧光显微镜 。

　　7. 1.4 台式低速离心机 。

　　3

　　GB/T 21674—2025

　　7. 1.5 组织匀浆机或研磨器 。

　　7. 1.6 细胞培养瓶 。

　　7. 1.7 96孔细胞培养板 。

　　7. 1. 8 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10 μL、10 μL~ 100 μL、100 μL~ 1 000 μL等不同规格) ,并配备与移液器匹配的吸头 。

　　7.2 试剂材料

　　7.2. 1 MEM。

　　7.2.2 PBS,按照 A. 1 配制 。

　　7.2.3 4%多聚甲醛 ,按照 A. 2 配制 。

　　7.2.4 细胞生长液 ,按照 A. 3 配制 。

　　7.2.5 细胞维持液 ,按照 A. 4 配制 。

　　7.2.6 300 mmol/LD-氨基葡萄糖 ,按照 A. 5 配制 。

　　7.2.7 0. 1% Triton X-100,按照 A. 6 配制 。

　　7.2. 8 3% BSA,按照 A. 7 配制 。

　　7.2.9 3%H2 O2-甲醇溶液 ,按照 A. 8 配制 。

　　7.2. 10 小鼠抗 PCV2单克隆抗体 。

　　7.2. 11 FITC-山羊抗小鼠 IgG 抗体 。

　　7.2. 12 DAPI染色液 。

　　7.2. 13 HRP-山羊抗小鼠 IgG 抗体 。

　　7.2. 14 AEC 显色试剂盒 。

　　7.2. 15 PK-15细胞 。

　　7.3 病毒分离

　　7. 3. 1 样品制备 :组织样品经研磨后 ,按照 1 ∶ 9 的比例加入 MEM 培养基 ,制成 10%的组织悬液 ,反复冻融 3 次 ,经 12 000 r/min离心 15 min,取上清液 ,使用 0. 22 μm 滤膜过滤 , 收集滤出液备用 。血清样品直接使用 0. 22 μm 滤膜过滤 ,收集滤出液备用 。

　　7.3.2 细胞制备 :用胰酶消化处于对数生长期的 PK-15细胞单层 ,用细胞生长液将 PK-15细胞稀释为1×106 个/mL,备用 。

　　7.3.3 样品接种 :将处理过的样品上清液按照 1 ∶ 5 的比例接种到新消化的 PK-15细胞悬液中 , 置于37 ℃ 、5%(体积分数)二氧化碳培养箱静置培养 24h。 同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照 。

　　7.3.4 D-氨 基 葡 萄 糖 处 理 : 待 细 胞 长 至 单 层 时 , 弃 掉 旧 的 培 养 液 , 用 PBS 清 洗 2 次 , 弃 净 , 加 入 适 量300 mmol/LD-氨基葡萄糖(以能完全覆盖细胞单层为准) ,于 37 ℃ 、5%(体积分数)二氧化碳培养箱作用 30 min;用 PBS清洗 2 次 ,弃净 。

　　7.3.5 病毒培养 :加入细胞维持液 ,继续培养 48 h。 收集细胞与上清液 ,反复冻融 3 次 ,此为第一代病毒培养物 。

　　7.3.6 病毒盲传 : 由于 PCV2接种不出现细胞病变效应 ,应按 7. 3. 2~ 7. 3. 5方法盲传 5代 。 收获第 5代病毒的细胞培养物悬液 ,反复冻融 3 次 ,2 000 r/min离心 20 min, 吸取上清液 ,采用 7. 4. 1 或 7. 4. 2方法进行病毒鉴定 。

　　7.4 病毒鉴定

　　7.4. 1 间接免疫荧光试验(IFA)

　　7.4. 1. 1 消化对数生长期的 PK-15细胞 ,用细胞生长液稀释成 1× 105 个/mL, 100 μL/孔铺于 96孔细胞培养板 。

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　　GB/T 21674—2025

　　7.4. 1.2 将待检病毒液接种长至单层的 PK-15细胞 , 100 μL/孔 。 同时设置已知 PCV2病毒接种孔作为阳性对照 ,100 μL/孔 ;设置细胞维持液接种孔作为阴性对照 ,100 μL/孔 。

　　7.4. 1.3 将细胞培养板置于 37 ℃ 、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中孵育 1 h,弃去病毒液 ,用 PBS清洗 2 次 ,3 min/次 ,弃净 ,每孔加入细胞维持液 100 μL,继续培养 48h。

　　7.4. 1.4 弃 上 清 , 用 PBS 冲 洗 细 胞 3 次 , 每 孔 加 入 100 μL 4% 多 聚 甲 醛 , 室 温 固 定 20 min, 弃 液 , PBS 冲洗细胞 3 次 ,每次 3 min,轻轻拍干 。

　　7.4. 1. 5 每 孔 加 入 100 μL 0. 1% Triton X-100 室 温 透 膜 10 min, 弃 液 , 用 PBS 冲 洗 细 胞 3 次 , 3 min/次 ,轻轻拍干 。

　　7.4. 1.6 每孔加入 100 μL3% BSA,室温封闭 1 h,弃上清 。

　　7.4. 1.7 每孔加入 50 μL小鼠抗 PCV2单克隆抗体(稀释至工作浓度) ,37 ℃作用 1 h,弃液 ,用 PBS 冲洗细胞 3 次 ,3 min/次 ,轻轻拍干 。

　　7. 4. 1. 8 每孔加入 50 μL FITC-山羊抗小鼠 IgG(稀释至工作浓度) ,37 ℃避光反应 1 h,用 PBS冲洗细胞 3 次 ,3 min/次 ,轻轻拍干 。

　　7.4. 1.9 每孔加 入 50 μL DAPI染 色 液 , 室 温 避 光 反 应 5 min, 弃 液 , 用 PBS 冲 洗 细 胞 3 次 , 3 min/次 ,拍干 。将 96孔细胞培养板置于倒置荧光显微镜下观察 。

　　7.4. 1. 10 试验成立条件 : 阳性对照细胞出现亮绿色特异性荧光 ,且阴性对照细胞未出现亮绿色特异性荧光 。

　　7.4. 1. 11 结果判定 :被检病毒接种的细胞出现亮绿色特异性荧光 ,判定为 PCV2阳性 ;被检病毒接种的细胞未出现亮绿色特异性色荧光 ,判定为 PCV2阴性 。

　　7.4.2 过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)

　　7.4.2. 1 按 7. 4. 1. 1~ 7. 4. 1. 5操作 。

　　7.4.2. 2 每 孔 加 入 100 μL 3% H2 O2-甲 醇 溶 液 , 37 ℃处 理 10 min, 弃 液 , 用 PBS 冲 洗 细 胞 3 次 , 3 min/次 ,轻轻拍干 。

　　7.4.2.3 每孔加入 100 μL3% BSA溶液 ,37 ℃封闭 1 h,弃上清液 。

　　7.4.2.4 每孔加入 50 μL小鼠抗 PCV2单克隆抗体(稀释至工作浓度) ,37 ℃作用 1 h,弃液 ,用 PBS冲洗细胞 3 次 ,3 min/次 ,轻轻拍干 。

　　7.4.2.5 每孔加入 50 μLHRP-山羊抗小鼠 IgG(稀释至工作浓度) ,37 ℃孵育 30 min,用 PBS冲洗细胞3 次 ,每次 3 min,轻轻拍干 。

　　7.4.2.6 用 AEC 显色试剂盒显色 20 min,PBS冲洗细胞 3 次 ,3 min/次 ,轻轻拍干 。将 96孔细胞培养板置于倒置显微镜下观察 。

　　7.4.2.7 试验成立条件 : 阳性对照细胞呈现特异性红色染色 ,且阴性对照细胞无特异性红色染色 。

　　7.4.2. 8 结果判定 :被检病毒接种的细胞呈现特异性红色染色 ,判定为 PCV2 阳性 ;被检病毒接种的细胞无特异性红色染色 ,判定为 PCV2阴性 。

　　8 聚合酶链式反应(PCR)

　　8. 1 仪器设备

　　8. 1. 1 PCR仪 。

　　8. 1.2 台式高速冷冻离心机 。

　　8. 1.3 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽 。

　　8. 1.4 凝胶成像仪(或紫外透射仪) 。

　　8. 1.5 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10μL、10 μL~ 100μL、100 μL~ 1000μL等不同规格) ,并配备与移液器匹配的吸头 。

　　5

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　　8. 1.6 PCR管 。

　　8. 1.7 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱 。

　　8. 1. 8 -20 ℃冰柜 。

　　8. 1.9 微波炉 。

　　8.2 试剂材料

　　8.2. 1 PBS,按照 A. 1 配制 。

　　8.2.2 DNAzol:商品化 DNA提取试剂 ,于 2 ℃ ~ 8 ℃保存 。

　　8.2.3 无水乙醇 :分析纯 , -20 ℃预冷 。

　　8.2.4 75%乙醇 : -20 ℃预冷 ,按照附录 B 中 B. 1 配制 。

　　8.2.5 8 mmol/L NaOH ,按照 B. 2 配制 。

　　8.2.6 10×PCR buffer:含 Mg2+ 。

　　8.2.7 dNTPs:含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 2. 5 mmol/L。

　　8.2. 8 Taq 酶(5U/μL) 。

　　8.2.9 无核酸酶水 ,按照 B. 3 配制 。

　　8.2. 10 1×TAE缓冲液 ,按照 B. 4 配制 。

　　8.2. 11 1. 5% ~ 2%琼脂糖凝胶 ,按照 B. 5 制备 。

　　8.2. 12 6×上样缓冲液 。

　　8.2. 13 DNA分子质量标准 :DL 2000DNA Marker。

　　8.2. 14 阳性对照 : 已知并定量的 PCV2阳性猪组织 、血清样品或灭活 PCV2细胞培养物 。

　　8.2. 15 阴性对照 : 已知 PCV2阴性猪组织 、血清样品 ,健康 PK-15细胞或无核酸酶水 。

　　8.2. 16 引物 ,序列信息见附录 C 中 C. 1。

　　8.3 试验方法

　　8.3. 1 样品制备

　　取待检组 织 样 品 约 1 g ~ 3 g 置 于 组 织 匀 浆 机 中 充 分 研 磨 , 用 PBS 制 备 成 10%的 组 织 匀 浆 液 。 2 000 r/min离心 10 min,取上清液 ,待检 。血清样品可直接用于检测 。

　　8.3.2 核酸提取

　　8.3.2. 1 取 n 个灭菌的 1. 5 mL离心管 ,其中 n 为待检样品数 +阳性对照数 +阴性对照数 ,对每个离心管进行编号 。

　　8.3.2.2 每管先加入 800 μL DNAzol,再分别加入被检样品 、阳性对照 、阴性对照各 200 μL,振荡混匀15 s,2 ℃ ~ 8 ℃或室温 10 000 r/min离心 10 min。

　　8.3.2.3 取 900μL上 清 液 , 置 于 新 的 1. 5 mL灭 菌 离 心 管 中 , 加 入 500 μL无 水 乙 醇 , 混 匀 , 室 温 放 置3 min;2 ℃ ~ 8 ℃或室温 10 000 r/min离心 5 min。

　　8.3.2.4 弃 上 清 液 , 沿 管 壁 缓 缓 加 入 0. 8 mL~ 1 mL 75%乙 醇 , 颠 倒 3 次 ~ 6 次 混 匀 , 2 ℃ ~ 8 ℃ 10 000 r/min离心 5 min。反复洗涤两次后 ,将离心管倒扣于吸水纸上 , 自然晾干或用移液器吸去残液 。

　　8.3.2.5 用 30 μL8 mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀 。DNA 在 2 ℃ ~ 8 ℃可保存两个月 , -20℃可稳定保存两年 。

　　注 : DNA抽提使用等效商品化试剂盒或核酸提取仪及配套试剂提取 ,方法按照相应操作说明书执行 。

　　8.3.3 反应体系配制

　　按照表 1 配制 25 μLPCR反应体系 。每次扩增应设置阳性对照和阴性对照 。

　　6

　　GB/T 21674—2025

　　表 1 PCR反应体系

　　试剂成分

　　体积 /μL

　　10×PCR buffer(Mg2+ plus)

　　2. 5

　　dNTPs(各 2. 5 mmol/L)

　　2

　　Taq 酶(5U/μL)

　　0. 25

　　上游引物(10 μmol/L)

　　1

　　下游引物(10 μmol/L)

　　1

　　无核酸酶水

　　15. 25

　　DNA 模板

　　3

　　8.3.4 反应程序设置

　　将 8. 3. 3 中试剂充分混匀 , 盖紧 PCR 管盖 , 瞬时离心后 , 置于 PCR 仪中进行扩增 。 扩 增 程 序 为 : 95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 30 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,35个循环;72 ℃终延伸 10 min。

　　8.3.5 扩增产物电泳

　　将 5 μL6×上样缓冲液加入至上述 PCR产物中 ,混匀 。 取 8 μL加入 1. 5% ~ 2%琼脂糖凝胶泳道孔内 , 同时加入 DNA分子 质 量 标 准 作 为 对 照 , 100 V~ 120 V 稳 压 电 泳 30 min~ 40 min。 电 泳 结 束后 ,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果 。

　　8.4 结果判定

　　8.4. 1 试验成立条件 : 阳性对照应有大小约为 269bp的特异性扩增条带 ,且阴性对照无任何扩增条带 。

　　8.4.2 被检测样品出现大小约为 269bp的特异性扩增条带(见 C. 3) ,且与阳性对照条带分子量大小相符 ,则判定为 PCV2核酸阳性 ;被检样品无特异性扩增条带 ,则判定为 PCV2核酸阴性 。

　　8.4.3 必要时 ,可取扩增产物用特异性引物(见 C. 1) 进行序列测定 ,并与 PCV2特异性扩增片段序列(见 C. 2)进行核苷酸同源性比对分析 , 以确证检测结果 。

　　9 实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)

　　9. 1 仪器设备

　　9. 1. 1 荧光 PCR仪 。

　　9. 1.2 台式高速冷冻离心机 。

　　9. 1.3 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10 μL、10 μL~ 100 μL、100 μL~ 1 000 μL等不同规格) ,并配备与移液器匹配的吸头 。

　　9. 1.4 荧光 PCR管 。

　　9.2 试剂材料

　　9.2. 1 PBS,按照 A. 1 配制 。

　　9.2.2 DNAzol:商品化 DNA提取试剂 ,于 2 ℃ ~ 8 ℃保存 。

　　9.2.3 无水乙醇 :分析纯 , -20 ℃预冷 。

　　7

　　GB/T 21674—2025

　　9.2.4 75%乙醇 ,按照 B. 1 配制 。

　　9.2.5 8 mmol/L NaOH ,按照 B. 2 配制 。

　　9.2.6 10×PCR buffer:含 Mg2+ 。

　　9.2.7 dNTPs:含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP各 2. 5 mmol/L。

　　9.2. 8 Taq 酶(5U/μL) 。

　　9.2.9 无核酸酶水 ,按照 B. 3 配制 。

　　9.2. 10 阳性对照 : 已知并定量的 PCV2阳性猪组织 、血清样品或灭活 PCV2细胞培养物 。

　　9.2. 11 阴性对照 : 已知 PCV2阴性猪组织 、血清样品 ,健康 PK-15细胞或无核酸酶水 。

　　9.2. 12 引物和探针 ,序列信息见 C. 4。

　　9.3 试验方法

　　9.3. 1 样品制备 方法同 8. 3. 1。

　　9.3.2 核酸提取 方法同 8. 3. 2。

　　9.3.3 反应体系配制

　　按照表 2 配制 25μL Real-time PCR反应体系 。每次扩增应设置阳性对照和阴性对照 。

　　表 2 Real-timePCR反应体系

　　试剂成分

　　体积 /μL

　　10×PCR buffer(Mg2+ plus)

　　2. 5

　　dNTPs(各 2. 5 mmol/L)

　　2

　　Taq 酶(5U/μL)

　　0. 25

　　上游引物(10 μmol/L)

　　1

　　下游引物(10 μmol/L)

　　1

　　荧光探针(10μmol/L)

　　0. 5

　　无核酸酶水

　　12. 75

　　DNA 模板

　　5

　　9.3.4 反应程序设置

　　将 9. 3. 3 中试剂充分混匀 ,盖紧荧光 PCR管盖 ,瞬时离心后 ,置于荧光 PCR 仪中进行扩增 。扩增程序为 :95℃预变性 2 min;95℃变性 15 s,60℃退火延伸 30 s,40个循环 。在扩增阶段每次循环的60 ℃退火延伸时收集荧光信号 。

　　9.4 结果判定

　　9.4. 1 试验成立条件 : 阳性对照 25≤Ct值 ≤28且出现特异性扩增曲线 , 阴性对照无 Ct值或 Ct值 ≥40且无特异性扩增曲线 ,则试验结果有效 ;否则应重新进行试验 。

　　9. 4.2 被检样品的 Ct值 ≤36且出现特异性扩增曲线 ,判定为 PCV2核酸阳性 ,检测结果见 C. 5;被检样

　　8

　　GB/T 21674—2025

　　品无 Ct值或 Ct值 ≥40且无特异性扩增曲线 ,判定为 PCV2核酸阴性 ; 当被检样品 36

　　10 间接酶联免疫吸附试验(间接 ELISA)

　　10. 1 仪器设备

　　10. 1. 1 酶标仪 。

　　10. 1.2 恒温培养箱 。

　　10. 1.3 洗板机 。

　　10. 1.4 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10μL、10μL~ 100μL、100μL~ 1000μL等不同规格) ,并配备与移液器匹配的吸头 。

　　10. 1.5 96孔酶标板 。

　　10.2 试剂材料

　　10.2. 1 包被液 ,按照附录 D 中 D. 1 配制 。

　　10.2.2 洗涤液 ,按照 D. 2 配制 。

　　10.2.3 封闭液及抗体稀释液 ,按照 D. 3 配制 。

　　10.2.4 酶标二抗 : HRP-山羊抗猪 IgG抗体 。

　　10.2.5 TMB底物液 ,按照 D. 4 配制 。

　　10.2.6 终止液 ,按照 D. 5 配制 。

　　10.2.7 包被抗原 :重组 PCV2Cap 蛋白 ,参考附录 E 中 E. 1制备 。

　　10.2. 8 PCV2阳性对照血清 ,PCV2阳性血清国家参考品(间接 ELISA效价为 1 ∶ 4 096) 。

　　10.2.9 PCV2阴性对照血清 ,参考 E. 2制备 。

　　10.3 试验方法

　　10.3. 1 抗原包被 :用包被液将重组 PCV2Cap 蛋白稀释至终浓度 1 μg/mL,100 μL/孔包被 96孔酶标板 ,2 ℃ ~ 8 ℃孵育 16h。

　　10.3.2 洗板 :弃去板中液体 ,用洗涤液洗涤酶标板 ,每孔 300 μL,洗涤 3 次 ,每次 3 min,最后一次洗完后 ,将酶标板在吸水材料上拍干 。

　　10.3.3 封闭 :每孔加入 200μL封闭液 ,于 37 ℃封闭 3 h。弃去板中液体 ,将酶标板在吸水材料上拍干 。

　　10.3.4 加 样 : 用 抗 体 稀 释 液 将 阳 性 对 照 血 清 、阴 性 对 照 血 清 和 待 检 血 清 分 别 做 1 ∶ 150 稀 释 , 100 μL/孔加入酶标板中 ,37 ℃孵育 30 min。按照 10. 3. 2洗涤酶标板 。

　　10.3.5 加酶标二抗 :用抗体稀释液将 HPR-山羊抗猪 IgG抗体稀释至工作浓度 ,100μL/孔加入酶标板中 ,37 ℃孵育 15 min。按照 10. 3. 2洗涤酶标板 。

　　10.3.6 加底物液 :每孔加入 100 μLTMB 底物液 ,室温避光孵育 5 min。

　　10.3.7 加终止液 :每孔加入 50 μL终止液 ,终止显色反应 。

　　10.3. 8 读值 :在酶标仪 450 nm 波长处读取各孔 OD值 ,15 min内完成 。

　　10.4 结果判定

　　10.4. 1 结果计算 :计算阳性对照平均 OD 值 、阴性对照平均 OD 值 , 以及被检血清样品的 S/P 值 。

　　被检血清样品的 S/P 值按照公式(1)计算 :

　　S/P= (OD450-S - OD450-NC)/(OD450-PC - OD450-NC) ……………………( 1 )

　　式中 :

　　9

　　GB/T 21674—2025

　　S/P — 样品数值 ;

　　OD450-S — 待检血清样品在 450 nm 波长处的 OD 值 ;

　　OD450-NC — 阴性对照血清在 450 nm 波长处的平均 OD 值 ;

　　OD450-PC — 阳性对照血清在 450 nm 波长处的平均 OD 值 。

　　10.4.2 试验成立条件 :PC>1. 0,且 NC<0. 2。

　　10.4.3 被 检 血 清 样 品 S/P ≥0. 57, 判 定 为 PCV2抗 体 阳 性;S/P≤0. 44, 判 定 为 PCV2抗 体 阴 性 ; 0. 44

　　11 阻断酶联免疫吸附试验(阻断 ELISA)

　　11. 1 仪器设备

　　11. 1. 1 酶标仪 。

　　11. 1.2 恒温培养箱 。

　　11. 1.3 洗板机 。

　　11. 1.4 微量可调移液器(0. 5 μL~ 10μL、10μL~ 100μL、100μL~ 1000μL等不同规格) ,并配备与移液器匹配的吸头 。

　　11. 1.5 96孔酶标板 。

　　11.2 试剂材料

　　11.2. 1 试剂同 10. 2. 1~ 10. 2. 6。

　　11.2.2 保护剂 ,按照附录 D 中 D. 6制备 。

　　11.2.3 包被抗原 :重组 PCV2Cap 蛋白 ,参考 E. 3制备 。

　　11.2.4 PCV2阳性对照血清 ,参考 E. 4制备 。

　　11.2.5 PCV2阴性对照血清 ,参考 E. 5 制备 。

　　11.3 试验方法

　　11. 3. 1 抗原包被 :用包被液将重组 PCV2Cap蛋白稀释至终浓度 2 μg/mL,每孔 100μL包被 96孔酶标板 ,37 ℃孵育 2 h。

　　11.3.2 洗板 :弃去板中液体 ,用洗涤液洗涤酶标板 ,每孔 300 μL,洗涤 3 次 ,每次 3 min,最后一次洗完后 ,将酶标板在吸水材料上拍干 。

　　11.3.3 封 闭 : 每 孔 加 入 200 μL封 闭 液 , 于 37 ℃封 闭 3 h。 弃 去 板 中 液 体 , 将 酶 标 板 在 吸 水 材 料 上拍干 。

　　11.3.4 加保护剂 :弃去板中液体 ,按 11. 3. 2 洗涤酶标板 ,加入抗原保护剂 , 每孔 100 μL,置 37 ℃作用1 h。

　　11.3.5 密封 :酶标板置 37 ℃晾干 ,用锡箔纸真空包装 ,密封 。

　　11.3.6 加样 :用抗体稀 释 液 将 PCV2 阳 性 对 照 血 清 、PCV2 阴 性 对 照 血 清 和 待 检 血 清 分 别 做 2 倍 稀释 ,100 μL/孔加入酶标板中 ,37 ℃孵育 30 min。按照 11. 3. 2洗涤酶标板 。

　　11.3.7 加酶标抗体 :用抗体稀释液将 HPR-PCV2单克隆抗体稀释至工作浓度 , 100 μL/孔加入酶标板中 ,37 ℃孵育 30 min。按照 11. 3. 2洗涤酶标板 。

　　11.3. 8 加底物液 :每孔加入 100 μLTMB 底物液 ,37 ℃避光孵育 15 min。

　　11.3.9 加终止液 :每孔加入 50 μL终止液 ,终止显色反应 。

　　11.3. 10 读值 :在酶标仪 450 nm 波长处读取各孔 OD值 ,15 min 内完成 。

　　10

　　GB/T 21674—2025

　　11.4 结果判定

　　11.4. 1 结果计算 :计算阳性对照平均 OD 值 、阴性对照平均 OD 值 , 以及被检血清样品的阻断率(PI) 。被检血清样品 PI值按照公式(2)计算 :

　　PI ……………………( 2 )

　　式中 :

　　PI — 样品抑制率 ;

　　OD450-S — 待检血清样品在 450 nm 波长处的 OD 值 ;

　　OD450-NC — 阴性对照血清在 450 nm 波长处的平均 OD 值 。

　　11.4.2 试验成立条件 :PC<0. 4,且 NC>0. 7。

　　11.4.3 被检血清样品 PI≥38% ,判定为 PCV2抗体阳性;PI≤30% ,判定为 PCV2抗体阴性;30%< PI<38% ,判定为可疑 。可疑样品应重新检测 ,重新检测结果 PI<38% ,判定为 PCV2抗体阴性 。

　　12 免疫组织化学试验(IHC)

　　12. 1 仪器设备

　　12. 1. 1 生物安全柜 。

　　12. 1.2 恒温箱 。

　　12. 1.3 生物显微镜 。

　　12. 1.4 多聚赖氨酸载玻片 。

　　12.2 试剂材料

　　12.2. 1 PBS,按照 A. 1制备 。

　　12.2.2 4%多聚甲醛 ,按照 A. 2制备 。

　　12.2.3 3%BSA,按照 A. 7制备 。

　　12.2.4 3%H2 O2-甲醇溶液 ,按照 A. 8制备 。

　　12.2.5 75%乙醇 ,按照 B. 1制备 。

　　12.2.6 PCV2抗体阳性血清 ,参考 E. 4制备 。

　　12.2.7 85%乙醇 ,按照附录 F 中 F. 1 配制 。

　　12.2. 8 95%乙醇 ,按照 F. 2 配制 。

　　12.2.9 无水乙醇 。

　　12.2. 10 二甲苯-乙醇溶液 ,按照 F. 3 配制 。

　　12.2. 11 二甲苯 。

　　12.2. 12 石蜡 。

　　12.2. 13 柠檬酸钠缓冲液 ,按照 F. 4 配制 。

　　12.2. 14 HRP-SPA。

　　12.2. 15 DAB显色试剂盒 。

　　12.2. 16 苏木精 。

　　12.3 试验方法

　　12.3. 1 制作石蜡切片

　　12. 3. 1. 1 固定 :取疑似病死猪的淋巴结 、死亡胎儿的心脏等新鲜组织 ,将其纵切成小块(大小约 2 cm × 2 cm×2 cm) ,立即浸泡于 4%多聚甲醛中 。 固定 24h后 ,用 PBS洗涤 2 次 ,30 min/次 。

　　11

　　GB/T 21674—2025

　　12.3. 1.2 脱水 :用梯度浓度的乙醇进行脱水处理 , 即将组织块依次浸入 75%乙醇 1 h、85%乙醇 1 h、 95%乙醇 Ⅰ 1 h、95%乙醇 Ⅱ 1 h、无水乙醇 Ⅰ 1 h、无水乙醇 Ⅱ 1 h。

　　12.3. 1.3 透明 : 将脱水完全的组织依次浸泡于二甲苯 乙 醇 溶 液 30 min、二 甲 苯 Ⅰ 10 min、二 甲 苯 Ⅱ 5 min~ 10 min,至组织透明 。

　　12.3. 1.4 浸蜡 :将组织块依次浸入石蜡 Ⅰ1 h、石蜡 Ⅱ 1 h、石蜡 Ⅲ1 h。

　　12.3. 1.5 包埋 :将组织块转入包埋石蜡中包埋 。待石蜡凝固后 ,取组织蜡块修整切成厚度为 4 μm 的组织切片 。将切片展开在多聚赖氨酸载玻片上 ,于 37 ℃温箱中烘干 ,进行免疫组化染色 。

　　12.3.2 免疫组化染色

　　12.3.2. 1 脱蜡 :将石蜡切片依次浸入二甲苯 Ⅰ 10 min、二甲苯 Ⅱ 10 min、二 甲 苯-乙 醇 溶 液 3 min~ 5 min,用 PBS清洗 3 次 ,3 min/次 。

　　12.3.2.2 复水 :用梯度浓度的乙醇进行复水处理 , 即将 切 片 依 次 浸 入 无 水 乙 醇 Ⅰ 5 min、无 水 乙 醇 Ⅱ 5 min、95%乙醇 Ⅰ 3 min、95%乙醇 Ⅱ3 min、85%乙醇 3 min、75%乙醇 3 min。

　　12.3.2. 3 抗 原 修 复 : 将 切 片 放 入 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 中 , 微 波 炉 中 火 加 热 约 15 min, 沸 腾 后 调 低 火 加 热10 min。取出后自然冷却至室温 。用 PBS清洗 3 次 ,3 min/次 。

　　12.3.2.4 封闭 :加 3%H2 O2-甲醇溶液室温处理 30 min,用 PBS洗涤 3 次 ,3 min/次 ;加 3%BSA室温封闭 30 min。

　　12.3.2.5 一抗孵育 :倾去封闭液 ,滴加 1 ∶ 20倍稀释的 PCV2抗体阳性血清 , 于 37 ℃孵育 1 h, 同时设立阴性血清对照 。用 PBS洗涤 3 次 ,3 min/次 。

　　12.3.2.6 酶标抗体孵育 :滴加工作浓度的 HRP-SPA,37 ℃孵育 30 min;PBS洗涤 3 次 ,3 min/次 。

　　12.3.2.7 加底物 :用 DAB 显 色 试 剂 盒 室 温 显 色 1 min~ 10 min, 待 出 现 明 显 棕 色 后 , 自 来 水 中 过 一下 ,终止显色 。

　　12.3.2. 8 苏木精复染 :将显色后的组织用苏木精复染 30 s,然后用自来水充分清洗 。

　　12.3.2.9 脱水与透明 :将组织依次浸入 95%乙醇 3 min、二甲苯-乙醇溶液 3 min、无水乙醇 Ⅰ3 min、无水乙醇 Ⅱ3 min、二甲苯 Ⅰ3 min、二甲苯 Ⅱ1 min。

　　12.3.2. 10 封片与镜检 :用中性树胶封片 ,用生物显微镜观察并判定结果 。

　　12.4 结果判定

　　12.4. 1 被检组织中有棕黄色着染细胞 ,判定为 PCV2阳性 。

　　12.4.2 被检组织中无棕黄色着染细胞 ,判定为 PCV2阴性 。

　　13 综合判定

　　13. 1 PCVD 的临床表现包括 PCV2-SD、PCV2-RD、PDNS和亚临床感染 。PCV2-SD、PCV2-RD 的确诊应同时具备临床症状 、病 理 变 化 和 病 原 检 出 三 个 条 件 ; PDNS是 一 种 免 疫 介 导 性 疾 病 , 影 响 因 素 较多 ,实践中待观察到临床症状和病理变化后往往检测不到 PCV2病原 , 因此 ,PDNS 的确诊须同时具备临床症状和病理变化两个条件 。PCVD 是多因素疾病 ,确诊为 PCV2-SD、PCV2-RD、PDNS的病例 ,不排除其他疾病的存在 。

　　13.2 经 5. 4. 1判定为疑似 PCV2-SD病例 ,且第 7章 、第 12章中任一项为阳性 ,可诊断为 PCV2-SD病例 。经 5. 4. 2判定为疑似 PCV2-RD病例 ,且第 7 章 、第 12章中任一项为阳性 , 可诊断为 PCV2-RD病例 。符合 5. 4. 3,可诊断为 PDNS病例 。

　　13.3 对于接种过 PCV2疫苗的猪 ,按第 8章 、第 9章中任一项为阳性 ,可诊断为 PCV2感染 。对于未接种过 PCV2疫苗的猪 ,按第 8章 ~第 11章中任一项为阳性 ,可诊断为 PCV2感染 。

　　12

　　GB/T 21674—2025

　　附 录 A

　　(规范性)

　　样品保存、病毒分离与鉴定相关溶液的配制

　　A. 1 PBS(0. 01mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7. 4)

　　称取 8. 00 g氯化钠(NaCl) 、0. 20 g氯化钾(KCl) 、1. 44 g磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 、0. 24 g 磷酸二氢钾(KH2PO4 ) ,加入去离子水至 1 000 mL,用盐酸(HCl)调 pH 至 7. 4,高压灭菌 ,2 ℃ ~8 ℃保存备用 。

　　A.2 4%多聚甲醛

　　称取 4 g 多聚甲醛 ,加入 PBS溶解至 100 mL,2 ℃ ~ 8 ℃避光保存备用 。

　　A.3 细胞生长液(pH 7. 2)

　　取 900 mL MEM 基 础 营 养 液 , 加 入 100 mL 灭 活 胎 牛 血 清 (FBS) , 加 入 青 霉 素 至 终 浓 度100IU/mL,加入链霉素至终浓度 100 μg/mL,2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　A.4 细胞维持液(pH 7. 2)

　　取 980mL MEM 基础营养液 ,加入 20mLFBS,加入青霉素至终浓度 100IU/mL,加入链霉素至终浓度 100 μg/mL,2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　A.5 300mmol/LD-氨基葡萄糖

　　称取 5. 375 gD-氨基葡萄糖 ,加入去离子水溶解至 100 mL, 以 0. 22 μm 滤膜过滤后 ,2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　A.6 0. 1% Triton X-100

　　取 1 mL Triton X-100,加入 PBS至 1 000 mL,2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　A.7 3% BSA

　　称取 3 g 牛血清白蛋白(BSA) ,加入 PBS溶解至 100 mL,2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　A. 8 3%H2O2-甲醇溶液

　　取 3 mL H2 O2 ,加入无水甲醇至 100 mL,混匀 ,室温避光保存备用 。

　　13

　　GB/T 21674—2025

　　附 录 B

　　(规范性)

　　PCR、Real-timePCR相关溶液的配制

　　B. 1 75%乙醇

　　取 75 mL无水乙醇 ,加入去离子水至 100 mL,室温保存备用 。

　　B.2 8 mmol/L NaOH

　　称取 0. 32 g 氢氧化钠(NaOH) ,加入去离子水溶解至 1 000 mL,分装后室温保存备用 。

　　B.3 无核酸酶水

　　取 1 mL焦炭酸二乙酯(DEPC) ,加入去离子水至 1 000 mL,充分混匀 ,将瓶盖拧松后于 37 ℃放置过夜 ,高压灭菌 ,分装后室温或 2 ℃ ~ 8 ℃保存备用 。

　　B.4 1× TAE缓冲液

　　取 242 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、37. 2 g Na2EDTA · 2H2 O、57. 1 mL冰乙酸 ,加入 800mL 去离子水充分溶解后 ,用去离子水定容至 1 000 mL,配制成 50×TAE贮存液 ,室温保存 。

　　取 20 mL 50× TAE 贮 存 液 , 加 入 去 离 子 水 至 1 000 mL, 充 分 混 匀 后 为 1× TAE 缓 冲 液 , 现 配现用 。

　　B.5 1. 5% ~2%琼脂糖凝胶

　　称取 0. 75 g~ 1 g琼 脂 糖 , 加 入 50 mL 1× TAE 缓 冲 液 , 加 热 融 化 , 待 温 度 降 至 60 ℃左 右 , 加 入2. 5 μL核酸染料 GoldView(10mg/mL) ,混匀后倒入胶槽内 自然凝固 。

　　14

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　　附 录 C

　　(资料性)

　　PCR、Real-timePCR 引物探针信息、扩增片段序列及检测结果参照图

　　C. 1 PCR 引物信息

　　PCR 引物信息见表 C. 1。

　　表 C. 1 PCR 引物信息表

　　引物名称

　　引物序列(5'-3')

　　产物大小

　　靶基因

　　PCV2-F

　　CACATACTGGAAACCACCTAGAA

　　269bp

　　ORF1

　　PCV2-R

　　CCAAGGAAGTAATCCTCCGATAAA

　　C.2 PCR 扩增片段序列(269bp)

　　CACATACTGGAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGGTGAAGAAG TGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGCTGCCCTGGGATGATCTACTGAGACTGTGT GATCGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAG TATTCTGATTACCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGC TGTAGAAGCTCTTTATCGGAGGATTACTTCCTTGG

　　C.3 PCR 检测结果参照图

　　PCR检测结果见图 C. 1。

　　标引序号说明 :

　　M —DNA分子质量标准(DL 2000DNA Marker) ;

　　1 — 阴性对照 ;

　　2 — 阳性对照 。

　　图 C. 1 PCV2PCR检测结果参照图

　　C.4 Real-timePCR 引物和探针信息

　　Real-time PCR 引物和探针信息见表 C. 2。

　　15

　　GB/T 21674—2025

　　表 C.2 Real-timePCR 引物和探针信息表

　　名称

　　引物序列(5'-3')

　　靶基因

　　PCV2-qF

　　GTTGGAGAGCGGGAGTCTGG

　　ORF1

　　PCV2-qR

　　GCCCGCGGAAATTTCTGAC

　　PCV2-Probe

　　FAM-ACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAA-BHQ1

　　C.5 Real-timePCR检测结果参照图

　　Real-time PCR检测结果见图 C. 2。

　　标引序号说明 :

　　1 — 阳性对照 ;

　　2 — 阴性对照 ;

　　3 — 阈值线 。

　　图 C.2 PCV2 Real-timePCR检测结果参照图

　　16

　　GB/T 21674—2025

　　附 录 D

　　(规范性)

　　ELISA 相关试剂的制备

　　D. 1 包被液(0. 05mol/L碳酸盐缓冲液,pH 9. 6)

　　称取 0. 318g碳酸钠(Na2CO3 ) 、0. 588 g 碳 酸 氢 钠(NaHCO3 ) , 加 入 去 离 子 水 至 200 mL, 充 分 混匀 ,用 0. 22 μm 滤膜过滤除菌 ,室温保存备用 。

　　D.2 洗涤液(含 0. 05%吐温-20的 PBS)

　　取 0. 5 mL吐温-20,加入 PBS至 1 000 mL,充分混匀 ,现配现用 。

　　D.3 封闭液及抗体稀释液(含 5%脱脂牛奶的 PBS)

　　称取 5 g脱脂奶粉 ,加入 PBS至 1 00 mL,充分混匀 ,现配现用 。

　　D.4 TMB 底物液

　　取 200 mg3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 、100 mL 无水乙醇 ,加入去离子水至 1000 mL,配成底物液 A。取 71. 7 g磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ) 、9. 33g柠檬酸 、6. 4 mL 的 0. 75%过氧化氢尿素 ,加入去离子水至 1 000mL,调 pH 至 5. 0~ 5. 4,配成底物液 B。将底物液 A 和底物液 B按 1 ∶ 1混合 , 即为 TMB底物液 ,分装于棕色瓶内 ,20 mL/瓶 ,2 ℃ ~ 8 ℃避光保存 ,现配现用 。

　　D.5 终止液(2mol/L硫酸)

　　取 10. 9 mL浓硫酸缓慢逐滴加入 89. 1 mL去离子水中 ,室温保存备用 。

　　D.6 保护剂

　　称取 BSA 0. 5 g、蔗糖 2 g,加入去离子水溶解并定容至 100 mL,0. 22 μm 滤膜过滤 ,分装后 2 ℃ ~ 8 ℃备用 。

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　　GB/T 21674—2025

　　附 录 E

　　(资料性)

　　ELISA 相关抗原与血清的制备

　　E. 1 重组 PCV2Cap蛋白E. 1. 1 菌种

　　表达包被抗原蛋白的菌种为 BL21-Cap,由 PCV2Cap基因(GenBank: KF700357. 1)原核表达质粒pET-Cap 转化大肠杆菌 BL21(DE3)获得 。

　　E. 1.2 菌液培养

　　取 BL21-Cap种子液按培 养 基 体 积 的 1%接 种 于 含 100 μg/mL 氨 苄 青 霉 素 的 LB 液 体 培 养 基中 ,在 37 ℃恒温摇床中 , 以 225 r/min 振 荡 培 养 至 菌 液 OD600nm 值(在 600 nm 波 长 处 的 OD 值) 到 达1. 0,加入 IPTG 至终浓度 1. 0 mmol/L,37 ℃振荡培养 6 h。5000 r/min离心 3 min收集菌体 , -20 ℃保存 。

　　E. 1.3 重组蛋白的纯化

　　将 E. 1. 2 收集的细菌样品用 PBS重悬 。将混合液在功率 200W 条件下超声裂解(冰上操作) ,然后4 ℃ ,12 000 r/min离心 20 min,将上清液转移到新的离心管中 。将空的纯化柱垂直固定在支架上 , 吸取 4 mL Ni-NIA His-Band 树脂 ,排干 20%乙醇 。使用 20mL过滤的纯水清洗 Ni-NIA His-Band 树脂中残留的乙醇 ,再用 10 mL 裂解液平衡镍亲和层析树脂 ,将获得的上清液与树脂混合 ,放置在摇床上缓慢摇动 1 h,促进目标蛋白和树脂的结合 。将上述混合液重新加入空的纯化柱中 ,待混合液流尽 ,再重复过柱一次 。用洗涤液进行洗涤 , 以洗去与镍亲和层析树脂非特异性结合的杂蛋白 。将 10 mL 洗脱液缓慢加入纯化柱中 ,并收集洗脱液洗脱的蛋白样品 。

　　E. 1.4 重组蛋白质量检验E. 1.4. 1 蛋白纯度鉴定

　　取 20μLE. 1. 3 收集的样品 ,加入 5 μL5×蛋白样品上样缓冲液 ,充分混匀后 100℃煮沸 5 min,瞬时离心 , 吸取上清液 ,用 10%的丙烯酰胺进行 SDS-PAGE 分析 ,在 32 kDa处应出现一条清晰条带 ,抗原纯度不低于 90% 。

　　E. 1.4.2 蛋白抗原性鉴定

　　取 20μLE. 1. 3 收集的样品 ,按 E. 1. 4. 1方法进行 SDS-PAGE 电泳 ,然后 100 mA 转印 90min。使目的条带转印至 PVDF 膜上 ,用 3% BSA室温封闭 3 h 后 ,用 PBS洗涤 。加入适量稀释的 PCV2 Cap蛋白单克隆抗体 ,室温孵育 1 h,PBS洗涤 5 次 。 然后用工作浓度的 HRP-山羊抗小鼠 IgG二抗 , 室温孵育 1 h,洗涤 5 次后加入 HRP 显色液进行显色 ,应在 32kDa处出现单一清晰条带 ,且无其他杂带 。

　　E. 1.4.3 蛋白浓度测定

　　用紫外分光光度计分别测定包被抗原在 280 nm 和 260 nm 波长时的 OD值 ,280 nm 波长时的 OD值乘以 1. 45 的 值 减 去 260 nm 波 长 时 的 OD 值 乘 以 0. 74 的 值 , 计 算 抗 原 浓 度 , 质 量 浓 度 不 低 于0. 5 mg/mL。

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　　GB/T 21674—2025

　　E. 1.4.4 蛋白免疫学活性鉴定

　　采用间接 ELISA 方法对抗原的免疫学活性进行鉴定 。用抗原包被液将纯化的蛋白从 1 μg/mL稀释至 0. 2 μg/mL,包被酶标板 ,进行间接 ELISA 检测 。选择阳性血清 S/P 值高于阳性判定标准的抗原最高稀释倍数作为抗原包被浓度 。抗原质量浓度应不低于 0. 20 μg/mL。

　　E. 1.4.5 分装及保存

　　将检测合格的蛋白分装到 1. 5 mL 离心管中 ,1 mL/管 ,置 - 70 ℃保存 ,有效期为 12个月 ,避免反复冻融和污染 。

　　E.2 PCV2阴性对照血清E.2. 1 血清来源动物

　　4周龄 ~ 6周龄健康仔猪 , 间接 ELISA 检测血清 PCV2抗体阴性 ,PCR 检测 PCV2阴性 , 隔离观察7 天 。

　　E.2.2 血清制备

　　无菌采集颈动脉血液 ,分离血清 ,用 0. 45 μm 滤膜过滤除菌 。用 IFA 检测 PCV2抗体 ,应为阴性 。间接 ELISA方法检测 OD450nm 值(在 450 nm 波长处的 OD值)均应小于 0. 2。

　　E.2.3 血清保存

　　置 -70℃保存 ,避免反复冻融和污染 ,有效期 24个月 。

　　E.3 重组 PCV2Cap蛋白

　　E.3. 1 包涵体洗液 Ⅰ (pH 8. 0)

　　取 Tris · HCl6 g、NaCl5. 8 g、EDTA 2. 92 g、Triton X-100 10 mL,用去离子水加至 1 L。 E.3.2 包涵体洗液 Ⅱ (pH 8. 0)

　　取 Tris · HCl6 g、NaCl5. 8 g、EDTA 2. 92 g、Triton X-100 5 mL,用去离子水加至 1 L。 E.3.3 菌种

　　表达包被抗原蛋白的菌种为 BL21-CapC, 由含 PCV2Cap基因第 5 aa~ 234aa原核表达质粒 pET- CapC转化大肠杆菌 BL21(DE3)获得 。

　　E.3.4 菌液培养

　　取 BL21-CapC种子液按培养基体积 1%接种于含 100 μg/mL 卡那霉 素 的 LB 液 体 培 养 基 中 , 在37 ℃恒温摇床中 , 以 200 r/min振荡培养 1. 5 h~ 2 h,至菌液 OD600nm 值达到 0. 6~ 0. 8,加入 IPTG 至终浓度 1. 0 mmol/L,37 ℃振荡培养 6 h。

　　E.3.5 菌体裂解与包涵体蛋白提取

　　将 E. 3. 4 收集的细菌样品 4 ℃ 8 000 r/min离心 5 min,用 PBS重悬 ,如此洗涤 2 次 ;弃上清液 ,用适量 PBS重悬细菌沉淀 ,并反复冻融 3 次 ;在功率 200W 条件下超声波裂解细菌(冰上操作) ,超声裂解5 s,停顿 5 s,直至菌液变得清澈 ;将上述裂解物 4 ℃ 8000 r/min离心 10 min,沉淀用与上清液等体积的 PBS重 悬 。 8 000 r/min 离 心 15 min, 用 包 涵 体 洗 液 Ⅰ 重 悬 沉 淀 , 4 ℃ 静 置 2 h, 重 复 1 次 ;

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　　GB/T 21674—2025

　　8000 r/min离心 15 min, 用 包 涵 体 洗 液 Ⅱ 重 悬 沉 淀 , 4 ℃静 置 2 h, 重 复 1 次 ; 8 000 r/min 离 心15 min,用 8 mol/L 尿 素 重 悬 沉 淀 , 4 ℃静 置 12 h~ 24 h; 8 000 r/min 离 心 15 min, 吸 取 上 清 液 至1. 5 mL离心管 。

　　E.3.6 重组抗原质量检验E.3.6. 1 抗原纯度鉴定

　　同 E. 1. 4. 1,经 SDS-PAGE分析 ,在 41 kDa处出现一条清晰条带 ,抗原纯度达 90%以上 。 E.3.6.2 蛋白抗原性鉴定

　　同 E. 1. 4. 2,经 western-blot分析 ,应在 41 kDa处应出现单一条清晰条带 ,且无其他杂带 。

　　E.3.6.3 抗原浓度的测定

　　同 E. 1. 4. 3。

　　E.3.6.4 抗原免疫学活性鉴定同 E. 1. 4. 4。

　　E.3.6.5 分装及保存

　　同 E. 1. 4. 5。

　　E.4 PCV2阳性对照血清E.4. 1 血清来源动物

　　4周龄 ~ 6周龄健康仔猪 ,经间接 ELISA检测血清 PCV2抗体阴性 ,PCR检测 PCV2阴性 , 隔离观察 7 d。

　　E.4.2 免疫接种

　　用 PCV2SH 株病毒液(TCID50≥106. 0/mL)颈部肌肉注射 2 mL/头 。 间隔 28d用同剂量 PCV2病毒液再次肌肉注射接种 ,第二次接种后 20 d~40d采血分离血清 ,用 IFA 检测 PCV2抗体 ,抗体效价大于 1 ∶ 64时 , 即可采血并分离血清 。

　　E.4.3 血清制备

　　无菌采集颈动脉血 ,离心 分 离 血 清 , 用 0. 45 μm 滤 膜 过 滤 除 菌 。 用 IFA 检 测 PCV2抗 体 , 应 为 阳性 。用阻断 ELISA方法检测 PCV2ELISA抗体 ,PI均应大于 60% ,OD450nm 值均应小于 0. 4。

　　E.4.4 血清保存

　　置 -70℃以下保存 ,避免反复冻融和污染 ,有效期 24个月 。

　　E.5 阴性对照血清

　　E.5. 1 血清来源动物

　　同 E. 4. 1。

　　E.5.2 血清制备

　　无菌采集颈动脉血 ,分离血清 ,用 0. 45 μm 滤膜过滤除菌 。用 PCV2 IFA 检测 PCV2抗体 ,应为阴

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　　性 。 阻断 ELISA方法检测 PI均小于 30% ,OD450nm 值均应大于 0. 7。

　　E.5.3 血清保存同 E. 4. 4。

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　　GB/T 21674—2025

　　附 录 F

　　(规范性)

　　IHC 相关溶液的配制

　　F. 1 85%乙醇

　　量取 85 mL 无水乙醇 ,加入去离子水至 100 mL,室温保存备用 。

　　F.2 95%乙醇

　　量取 95 mL 无水乙醇 ,加入去离子水至 100 mL,室温保存备用 。

　　F.3 二 甲苯-乙醇溶液

　　量取 50 mL 二甲苯 ,加入 50 mL无水乙醇 ,混匀 ,室温保存备用 。

　　F.4 柠檬酸钠缓冲液(0. 01mol/L,pH 6. 0)

　　称取柠檬酸三钠 0. 3 g、柠檬酸 0. 04 g,加入去离子水溶解至 100 mL,室温保存备用 。

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