T/SSESB 13-2025 基于环境DNA技术的水生入侵物种RPA快速检测方法

以下是团体标准《T/SSESB 13-2025 基于环境DNA技术的水生入侵物种RPA快速检测方法》的详细内容总结：

​一、标准概况​

• ​标准编号​：T/SSESB 13-2025
• ​名称​：基于环境DNA技术的水生入侵物种RPA快速检测方法
• ​发布日期与实施日期​：2025年4月25日
• ​发布机构​：上海市环境科学学会
• ​适用范围​：
  适用于湖泊、水库、河流、河口、海洋、海洋牧场、养殖塘等水域中以下4种外来入侵水生生物的快速检测：
  • 红耳彩龟（Trachemys scripta elegans）
  • 食蚊鱼（Gambusia affinis）
  • 齐氏罗非鱼（Coptodon zillii）
  • 塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）

​二、核心技术原理​

1. ​环境DNA（eDNA）技术​：
   • 通过采集水体样本，捕获生物脱落的DNA片段（如细胞、分泌物等）。
2. ​重组酶聚合酶等温扩增（RPA）​​：
   • 恒温（38℃）下快速扩增目标DNA，无需传统PCR的热循环设备。
3. ​侧流层析试纸条（LFD）检测​：
   • 探针标记FAM荧光基团和生物素，扩增产物与胶体金标记抗体结合，通过试纸条T线（检测线）和C线（质控线）显色判定结果。

​三、关键检测流程​

​1. 水样采集与处理​

• ​采样要求​：
  • 依据《HJ1295》《HJ1296》《DB32/T 4539-2023》布设监测点位。
• ​过滤​：
  • 使用0.45μm混合纤维素酯膜真空抽滤≥500mL水样，同步设置阴性对照。

​2. DNA提取​

• ​试剂​：蛋白酶K + Chelex-100树脂悬浮液。
• ​步骤​：
  剪碎滤膜 → 加Chelex-100和蛋白酶K → 56℃孵育10分钟 → 99℃灭活10分钟 → 离心取上清。

​3. RPA扩增​

• ​反应体系（50μL）​​：

  组分	体积
  荧光基础缓冲液	29.4μL
  无菌无酶水	11.5μL
  上下游引物（10μM）	各2μL
  探针（10μM）	0.6μL
  氯化镁溶液（10μM）	2.5μL
  DNA模板	2μL

• ​反应条件​：
  38℃金属浴中孵育4分钟 → 涡旋离心 → 继续38℃孵育8分钟。

​4. LFD检测​

• 取10μL扩增产物稀释至200μL → 点样50μL于试纸条 → 5分钟内观察结果。

​四、结果判定标准​

• ​阳性​：T线（检测线）和C线（质控线）均显红色条带（3个重复中≥2个成立）。
• ​阴性​：仅C线显色。
• ​无效​：C线无条带（需重检）。

​五、质量控制要求​

1. ​对照设置​：
   • 阴性对照：无菌无酶水（≥3个）。
   • 阳性对照：已知目标物种DNA（≥1个）。
2. ​平行样品​：
   • 每个检测点设≥3个生物重复，RPA扩增≥3个技术重复。
3. ​防污染措施​：
   • 采样、运输、保存按《DB32/T4539-2023》执行，防止交叉污染。

​六、专利声明​

• ​涉及专利​：
  • 上海海洋大学（3项）：巴西龟、齐氏罗非鱼、食蚊鱼的RPA检测专利。
  • 中国水产科学研究院（1项）：塔玛亚历山大藻检测专利。
• ​专利许可​：专利权人承诺以合理条件授权使用。

​七、附录信息​

• ​附录A​：提供4种入侵物种的基因扩增靶标序列（来源GenBank）：
  • 红耳彩龟（线粒体ND5-ND6区）、食蚊鱼（线粒体COX2/tRNA区）、齐氏罗非鱼（线粒体CYTB区）、塔玛亚历山大藻（核糖体ITS区）。

​八、其他要求​

• ​废弃物处理​：
  • 按《GB 19489》《SN/T4835》进行高压灭菌或化学灭活。
• ​引用标准​：
  包括《GB/T 1.1-2020》《HJ 624-2011》《SF/Z JD0105008-2018》等16项规范性文件。

​总结​：该标准提供了一套完整的水生入侵物种eDNA-RPA-LFD现场快速检测方案，覆盖从采样到结果判定的全流程，强调质量控制与专利合规性，适用于各类水域的生态监测与入侵物种防控。