资料介绍
中华人民共和国国家计量技术规范
JJF2301—2025
恒温扩增核酸分析仪校准规范
2025-09-08发布 2026-03-08实施
国家 市场 监督 管理 总局 发布
恒温扩增核酸分析仪
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校准规范
归口 单位 : 全国生物计量技术委员会
主要起草单位 : 上海市计量测试技术研究院有限公司中国计量科学研究院
参加起草单位 : 江苏省计量科学研究院 (江苏省能源计量数据中心)南京市计量监督检测院
上海速创诊断产品有限公司
本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释
本规范主要起草人 :
闻艳丽 (上海市计量测试技术研究院有限公司)
杨雪 (上海市计量测试技术研究院有限公司)
高运华 (中国计量科学研究院)
许丽 (上海市计量测试技术研究院有限公司)
参加起草人 :
崔宏恩 [江苏省计量科学研究院 (江苏省能源计量数据中心) ]陈鸿飞 (南京市计量监督检测院)
方雪恩 (上海速创诊断产品有限公司)
引言
JJF 1071《国家计 量校 准规 范编 写规 则》、JJF 1001《通用 计量 术语 及定 义》 和JJF 1059.1《测量不确定度评定与表 示》 共同 构成 支撑 本规 范制 定工 作的 基础 性系 列规范。
本规范的校准方法及计量特性等主要参考了 GB/T 41407《微流控芯片核酸恒温扩增仪技术要求》 和 JJF 1527《聚合酶链式反应分析仪校准规范》。
本规范为首次发布。
1 范围
本规范适用于恒温扩增核酸分析仪的校准。
2 引用文件
本规范引用了下列文件 :
JJF 1527 聚合酶链式反应分析仪校准规范
GB/T 41407 微流控芯片核酸恒温扩增仪技术要求
凡是注日期的引用文件 , 仅注日期的版本适用于本规范 ; 凡是不注日期的引用文件 , 其最新版本 (包括所有的修改单) 适用于本规范。
3 术语和定义
GB/T 41407界定的以及下列术语和定义适用于本规范。
3.1 核酸恒温扩增 nucleic acidisothermal amplification
由常温升温至特定温度后 , 在该温度下进行核酸体外扩增的过程。
3.2 指数级扩增拐点时间 time of exponentamplification crossing point
在实时监测核酸样本扩增过程中 , 扩增产物产生的荧光信号 (或浊度信号) 达到指数级扩增阈值经过的时间。
注 : 通常计算从核酸扩增恒温阶段的起始点到扩增曲线二 阶导数的极大值位置点 (指数级扩增拐点) 的时间。
[来源 : GB/T 41407—2022, 3.7]
4 概述
恒温扩增核酸分析仪 (以下简称分析仪) 是基于核酸恒温扩增原理 , 在模板 (待测样品)、聚合酶、引物等存在的条件下 , 在特定的扩增温度下 , 进行核酸序列的特异性扩增 , 通过光学系统采集核酸扩增产物产生的光信号 (荧光或浊度引起的光强变化) ,进一步通过光电转换生成数据文件 , 从而实现核酸样品分析。
分析仪主要由控制系统、 电源系统、温控系统和检测系统等组成。
5 计量特性
分析仪的计量特性指标见表 1。
表 1 分析仪计量特性指标
6 校准条件
6.1 环境条件
6.1.1 温度 : (15~ 30) ℃。
6.1.2 相对湿度 : ≤85%。
6.2 校准用标准物质及设备
6.2.1 温度校准装置 : 由若干个 (通常为 3个、5个、7个) 精密温度传感器 , 数据采集分析模块组成 , 测温范围为 (0~ 120) ℃ , 温度示值至少精确到小数点后 1 位 , 温度校准装置的扩展不确定度 ≤0.1 ℃ (k= 2)。
液(k:据)。分析仪的荧光通道类型 , 选择具有合适发射和激发波长的
荧光物质 , 配制合适浓度的荧光标准溶液。配制方法可参照附录 A。
6.2.5 电子天平 : 分度值 ≤0.01 mg, ①级。
6.2.6 秒表 : 最小分度值 ≤0.01 s, 最大允许误差为 ±0.5 s/d。
6.2.7 移液器 : 规格为 10μL、100μL、200μL、1000 μL。
6.2.8 配制校准用标准物质所需超纯水 : 电阻率不小于 18.2 MΩ · cm (25 ℃)。
7 校准项目和校准方法
分析仪开机后预热时间不少于 10 min。
7.1 温度示值误差
a) 温度传感器布置 , 将温度校准装置配套的温度传感器固定在分析仪的加热模块
上 , 保证温度传感器与加热模块贴合紧密 , 注意不同的分析仪的加热模块可能有差别 ,应根据实际情况选取温度传感器固定位置 , 尽量保证均匀分布。 测温点位个数要求如下 : 当分析仪总孔位数大于 48且小于或等于 96个 , 应选择 7个测温点 ; 当分析仪总孔位数大于 8个且小于或等于 48个 , 应选择 5 个测温点 ; 当分析仪总孔位数大于 2 个且小于或等于 8个 , 应选择 3个测温点 ; 当分析仪总孔位数小于或等于 2个 , 应选择 1个孔位 , 进行 3 次重复测量。温度传感器排布位置可参考图 1。
A— 微流控加热模块 ; B—8孔加热模块 ; C—16孔加热模块 ; D—32孔加热模块 ; E—48孔加热模块 ; F—96孔加热模块
图 1 温度传感器排布位置示意图
b) 设定分析仪的温度 (一般应与分析仪常用的恒温扩增温度一致) , 运行分析仪 ,待分析仪温度稳定后 , 读取温度传感器的温度测量值一次 , 按公式 (1) 和公式 (2) 计算温度示值误差 :
ΔTd=Ts-Tc (1)
式中 :
ΔTd — 温度示值误差 , ℃ ;
Ts — 分析仪温度设定值 , ℃ ;
Tc — 所有温度传感器的温度测量值的平均值 , ℃ ;
Ti — 第i个温度传感器的温度测量值 , ℃。
7.2 温度均匀度
按 7.1要求进行温度传感器布置和分析仪温度设置 , 待分析仪温度稳定后 , 取所有温度传感器的温度测量值中的最大值 Tmax , 以及所有温度传感器的温度测量值中的最小值 Tmin , 按公式 (3) 计算温度均匀度 :
ΔTu=Tmax-Tmin (3)
Tmin — 所有温度传感器的温度测量值中的最小值 , ℃。
7.3 温度波动度
按 7.1要求进行温度传感器布置和分析仪温度设置 , 待分析仪温度稳定后 , 连续测量 10 min, 每隔 1 min记录一次所有温度传感器的平均值 , 作为本次记录的温度测量值 , 共记录 10次 , 按公式 (4) 计算温度波动度 :
ΔTw — 温度波动度 , ℃ ;
Tmax — 10次温度测量值中的最大值 , ℃ ;
Tmin — 10次温度测量值中的最小值 , ℃。
7.4 样本重复性
将核酸标准物质稀释到 (100~ 1000) copy/μL, 作为待测样品进行恒温扩增检测 ,重复测量 6次 , 记录其指数级扩增拐点时间 , 按公式 (5) 计算其相对标准偏差作为样本重复性 :
RSDt — 指数级扩增拐点时间的相对标准偏差 ;
ti — 第 i次样本指数级扩增拐点时间的测定值 , min;
t — 6次样本指数级扩增拐点时间的平均值 , min。
7.5 荧光强度/浊度重复性
选择合适浓度的荧光标准溶液或合适浊度的浊度标准物质 , 使得分析仪测量值处于分析仪测量范围的中间值附近 , 重复测量 6 次 , 记录分析仪的测量值 , 按公式 (6) 计算分析仪测量值的相对标准偏差作为重复性 :
RSDI — 分析仪测量值的相对标准偏差 ;
Ii — 第 i次分析仪的测量值 , 单位采用分析仪自身物理量单位 ;
I — 6次分析仪测量值的平均值 , 单位采用分析仪自身物理量单位。
注 : 推荐荧光标准溶液浓度为 (10~ 100) ng/g, 浊度标准溶液为 1000NTU , 根据分析仪测定范围 , 可适当调整。
7.6 荧光强度/浊度线性
将系列稀释的荧光标准溶液或浊度标准物质 (至少 5个梯度使得测量值均匀覆盖分析仪测量范围) 进行测量 , 每个梯度重复测量 3 次 , 将标准溶液的标准值与分析仪的测
量值进行线性回归 , 按公式 (7) 计算其线性相关系数 r:
r — 线性相关系数 ;
Xi— 第 i个标准溶液的标准值 , ng/g或 NTU;
X — 标准值的平均值 , ng/g或 NTU;
Yi — 第i个标准溶液对应的分析仪测量值 , 单位采用分析仪自身物理量单位 ;
Y — 分析仪测量值的平均值 , 单位采用分析仪自身物理量单位。
8 校准结果表达
校准记录应详尽地记载测量数据和计算结果 , 推荐的校准记录格式见附录 B。 经校准的分析仪应出具校准证书 , 校准证书应符合 JJF 1071—2010 中 5.12 的要求 , 校准证书内页格式见附录 C。示值误差的测量不确定度应按 JJF 1059.1 的要求评定 , 不确定度评定示例见附录 D。
9 复校时间间隔
建议复校时间间隔不超过 1 年。 由于复校时间间隔的长短是由分析仪的使用情况、使用者、分析仪本身质量等着多因素所决定的 , 因此送校单位可根据实际使用情况自主确定复校时间间隔。
附录 A
核酸标准物质、荧光溶液以及浊度标准物质配制
A.1 核酸标准物质的配制
液将释( m(s)-y,/l/。L EDTA, pH= 8.0) 作为稀释
A.2 荧光标准溶液的配制
称取 1.0 mg荧光物质 , 如 5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (5-FAM 琥珀酰亚胺酯) ,
溶于 1 gDMSO 中 , 充分混匀得到 1 mg/g的荧光标准溶液母液。然后将荧光标准溶液
母液梯度稀释至工作标准液浓度 : 首先称取 100 mg 1 mg/g荧光标准溶液母液加入到
900 mgDMSO 中 , 充分混匀 , 将溶液稀释至 0.1 mg/g; 然后称取 100mg0.1 mg/g的
荧光溶液加入到 900mgDMSO 中 , 充分混匀 , 将溶液稀释至 0.01mg/g作为工作标准
溶液待用。使用时取适量 0.01 mg/g的工作标准溶液用 Tris-HCl缓冲溶液 (10 mmol/L
Tris-HCl, pH=8.0) 作为稀释液 , 分别稀释至 100ng/g、80ng/g、60 ng/g、40ng/g和
围进行调整。
A.3 浊度标准物质的配制
首先 , 配制零浊度水 , 选用孔径不大于 0.2 μm 的微孔滤膜过滤蒸馏水 (或电渗析水、离子交换水) , 反复过滤 2次以上 , 所获得的滤液即为零浊度水。其次 , 用零浊度水将浊度标准 物质 ( 比如 GBW (E) 120113, 4 000 NTU) 稀释 至 2 000 NTU、 1000NTU、 500NTU、250NTU。最后以 4000NTU、2000NTU、1000NTU、500NTU、250NTU系列梯度的浊度溶液用于线性检测。
附录 B
恒温扩增核酸分析仪校准记录参考格式
1. 温度示值误差和温度均匀度
2. 温度波动度
3. 样本重复性
4. 荧光强度/浊度重复性
5. 荧光强度/浊度线性
附录 C
校准证书内页推荐格式
C.1 校准证书内页
C.2 校准证书校准结果页
证书编号 × × × × × ×— × × × ×
校准结果
第 ×页
附录 D
温度示值误差校准结果的不确定度评定示例
D.1 测量模型
ΔTd=Ts-Tc
D.2 不确定度来源
a) 温度传感器分辨力引入的不确定度 u1 (Ti) ;
b) 测量重复性引入的不确定度 u(Tc) ;
c) 温度传感器引入的不确定度 u2 (Ti)。
D.3 不确定度分量的计算
D.3.1 温度传感器分辨力引入的不确定度 u1 (Ti)
温度传感器的分辨力 δ 为 0.1 ℃ , 则由分辨力引入的标准不确定度为 :
D.3.2 重复性引入的不确定度 u
在各个温度测量时间段内 , 读取温度传感器的数据 , 见表 D.1, 计算其极差 s(T)。
表 D.1 重复性引入的不确定度数据
根据测 量结 果计 算 , s(T) = (Tmax -Tmin)/Cn = (42.2 ℃ - 42.1 ℃)/2.33≈
D.3.3 温度传感器引入的不确定度 u2 (Ti)
温度传感器校准不确定度由温度传感器校准证书得到 uc=0.1 ℃。
D.4 标准不确定度一览表
标准不确定度一览表见表 D.2。
表 D.2 标准不确定度一览表
D.5 合成标准不确定度
合成标准不确定度用公式 u计算得到 , 结果
度 u , 可以不考虑分辨力所引入的不确定度分量。
D.6 扩展不确定度
取 k= 2, 则分 析仪 示值 误差 的扩 展不 确定 度用 U = k · u(ΔTd) 计算 , 结果 见
表 D.3 合成和扩展不确定度结果
