GB/T 38165-2019 人体外周血中循环游离DNA浓度检测 基于Alu序列实时荧光PCR法

　　ICS 07 . 080 A 40

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 38165—2019

　　人体外周血中循环游离 DNA浓度检测基于 Alu序列实时荧光 PCR法

　　Detectionofcirculatingcell-freeDNA concentrationinhumanperipheralblood—

　　Real-timePCR methodbasedonAlusequence

　　2019-10-18 发布 2019-10-18 实施

　　国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 38165—2019

　　前 言

　　本标准按照 GB/T 1 . 1—2009 给出的规则起草。

　　本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)提出并归口 。

　　本标准起草单位：成都中医药大学、四川省肿瘤医院、上海市计量测试技术研究院。

　　本标准主要起草人：何洋、肖洪涛、宋填、李燕、闻艳丽、冷平、刘刚、李东梅。

　　GB/T 38165—2019

　　人体外周血中循环游离 DNA浓度检测

　　基于 Alu序列实时荧光 PCR法

　　1 范围

　　本标准规定了人体外周血中循环游离脱氧核糖核酸(DNA) 基于 Alu 序列的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)定量检测方法。

　　本标准适用于循环游离 DNA样品中 Alu序列的定量检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注 日期的引用文件，仅注 日期的版本适用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　循环游离 DNA circulatingcell-freeDNA;cfDNA

　　血液中来源于细胞凋亡和坏死的细胞外游离状态的短片段 DNA。

　　3.2

　　实时荧光 PCR real-timePCR

　　在 PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。

　　3.3

　　Ct值 cyclethreshold

　　每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

　　3.4

　　Alu序列 Alusequence

　　散在分布于灵长类动物基因组中的中度重复序列。

　　注：Alu序列具有 70%~98%同源性，占人类基因组序列的 5%~10%,每个元件长度约为 300 bp。

　　4 原理

　　以提取的外周血循环游离 DNA作为检测 目标样品，以符合要求的人基因组 DNA定量标准物质为标准品，采用实时荧光 PCR技术，设计特异性引物分别扩增 Alu 序列中长度为 115 bp 和 219 bp 的片段，以标准品起始模板 DNA浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线。 根据标准曲线方程计算样品中的 Alu序列拷贝数，结果用 copies/μL表示。

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　　5 引物

　　扩增 Alu序列引物序列参见表 1 。

　　表 1 引物序列

　　6 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 试验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。

　　6 . 1 循环游离 DNA提取试剂盒

　　推荐使用基于磁珠法的循环游离 DNA提取试剂盒。

　　6 . 2 实时荧光 PCR反应混合液

　　20 μL反应体系含 1 U~2 U 的 Taq DNA 聚合酶、1 × PCR 缓冲液、2.0 mmol/L 的 Mg2+ 、0.2 U UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、0.2 mmol/L 的 d(A, C, G) TPs(dATP 为脱氧腺苷三磷酸，dCTP 为脱氧胞苷三磷酸，dGTP 为脱氧鸟苷三磷酸)、0.2 mmol/L dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、SYBR Green I 荧光染料。 或者仪器配套的等效 SYBR Green法的实时荧光 PCR反应混合液。

　　6 . 3 DNA标准物质

　　可定量 Alu序列拷贝数的 DNA标准物质，用于建立样品定量检测所需的标准曲线。

　　6 . 4 参比染料(ROX)

　　根据具体仪器需求决定使用与否。

　　7 仪器设备

　　7 . 1 实时荧光 PCR仪。

　　7 . 2 恒温金属浴。

　　7 . 3 高速离心机。

　　7.4 微量移液器：0.5 μL~10 μL、10 μL~100 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。

　　8 检验步骤

　　8 . 1 循环游离 DNA提取

　　循环游离 DNA按下列步骤提取：

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　　a) 2 mL人体外周血于 4 ℃以 1 600 × g 离心 10 min,离心后将上清转移到 1 . 5 mL 的离心管中，避免吸到中间层的白细胞;

　　b ) 再次以 4 ℃ 16 000 × g 离心 10 min 去除残余细胞，将上清转入新的离心管中，即得所需的血浆;

　　c) 按照每 500 μL 的血浆中加入 1 mL结合缓冲液(Binding buffer) 35 μL (20 μg/μL)蛋白酶 K

　　60 μL (1 μg/μL) carrier RNA 比例加入试剂，混匀后于室温放置 1 min~2 min;

　　d) 将上述混合样品于 10 000 × g，4 ℃离心 5 min,吸取上清到另一个新 1 . 5 mL离心管中，然后加入 10 μL微型磁珠，室温，混匀 15 min~20 min;

　　e) 将上一步产物分装到 1 . 5 mL 离心管中，放于磁力架上，静置 1 min~2 min, 吸去废液;

　　f) 加入洗涤缓冲液 500 μL,混匀后放于磁力架上，静置 1 min~2 min, 吸去废液;

　　g) 加入 70%乙醇 500 μL,混匀后放于磁力架上，静置 1 min~2 min, 吸去废液;

　　h) 加入 40 μL TE缓冲液，55 ℃金属浴 10 min(每 30 s 混匀一次);

　　i ) 放于磁力架上，静置 1 min~2 min,收集溶液至新的离心管中，即得到循环游离 DNA;

　　j) 提取后的循环游离 DNA样品应立即开展后续的实时荧光 PCR扩增试验。

　　注：可使用磁珠法或其他等效方法提取循环游离 DNA。

　　8 . 2 DNA标准品工作液的配制

　　取 DNA标准物质制备标准品工作液。 用非接触式超声波破碎仪将 DNA 标准物质按超声功率280 W、超声时间 5 s、间隙时间 5 s、总工作时间 20 min 的程序片段化为 300 bp~500 bp 片段，用一级水按照表 2 方法进行梯度稀释。

　　注 1 : DNA标准物质片段化程序可根据实际使用的仪器进行调整。

　　注 2：超声片段化后，可经过 1 . 5%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 片段化范围在 300 bp~500 bp。

　　表 2 DNA标准品工作液配制方法

　　8 . 3 实时荧光 PCR扩增

　　8 . 3 . 1 实时荧光 PCR反应体系

　　本方法采用 SYBR Green法，按表 3 配制反应体系，各样品配制 3 个复孔，加样过程先将除 DNA模板以外的各组分预混合，分装到荧光定量 PCR反应孔中 19 μL/孔，最后加入标准品或待测样品 1 μL/孔，加好后盖紧盖子，短暂离心，立刻进行 PCR扩增。

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　　表 3 实时荧光 PCR扩增体系(总体积 20 μL)

　　8 . 3 . 2 实时荧光 PCR反应程序

　　将配制好的 PCR反应体系放入实时荧光 PCR仪，按表 4 的反应程序扩增。

　　表 4 实时荧光 PCR扩增反应程序

　　9 质量控制

　　所有样品设 3 个重复，根据检测数值的取舍标准[如下 a)、b)]选择有效孔：

　　a) 标准曲线上各数据点复孔，可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去，可舍去明显影响标准曲线相关性(使 犚2 ≥0 . 99) 的复孔数据。 整条曲线上舍去的复孔数不得超过 3 个 。

　　b ) 当待测样品各复孔间检测 Ct值的标准差大于 0 . 5 时，该数据应重新检测。扩增效率应在 70%~110%之间;

　　标准曲线的相关系数 犚2 ≥0 . 99 ;

　　空白对照：Ct值 ≥30 . 0,若空白对照 Ct值小于 30 . 0 可采用脱氧核糖核酸酶 Ⅰ ( DNase Ⅰ ) 处理实时荧光 PCR反应混合液和试验用水，灭活 DNase Ⅰ 后重新检测。

　　10 结果计算

　　采用标准曲线法，对结果进行定量分析，直接测得各稀释梯度标准物质的 Ct值，以 Ct值为纵坐标、各稀释梯度标准物质浓度的对数(lg犡0)为横坐标作图，得到标准曲线和线性回归方程，最后将待测样品的 Ct值带入式(1) 。计算出待测样品的 Alu序列 115 bp 片段和 Alu序列 219 bp 片段的拷贝数。

　　犡0 = 犕 × (1 + 犈)-Ct …………………………( 1 )

　　式中：

　　犡0 —样品初始浓度，单位为拷贝数每微升(copies/μL) ;

　　犕 —荧光阈值，基线内 3 个 ~15 个循环荧光信号标准差的 10 倍 ;

　　GB/T 38165—2019

　　E —扩增效率，计算方法为 E=10( -1/slope) -1, slope为标准曲线斜率。

　　1 1 检测过程中生物安全措施

　　按照 GB/T 19489 的规定执行。