GB/T 40138-2021 南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

　　ICS 65 . 020 . 0 1 CCS B 16

　　中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

　　GB/T 40138—2021

　　南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationofsouthernbeanmosaicvirus

　　2021-05-21 发布 2021-12-01 实施

　　国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会

　　发

　　布

　　GB/T 40138—202 1

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 . 1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)提出并归口 。

　　本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、广州海关技术中心、福建省农业科学院果树研究所。

　　本文件主要起草人：张永江、刘晗、冯黎霞、谢丽雪、向均。

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　　南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法

　　1 范围

　　本文件规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。

　　本文件适用于豆科植物植株及种子中南方菜豆花叶病毒的检疫鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 南方菜豆花叶病毒分类信息

　　中文名：南方菜豆花叶病毒

　　学名：southernbeanmosaic℃irus

　　异名：菜豆花叶病毒 4 号 Bean mosaic virus 4;南方菜豆花叶病毒 1 号 Southern bean mosaic virus 1 ;菜豆南方花叶病毒 Bean southern mosaic virus

　　分类地位：类南方菜豆花叶病毒 目 (Sobelivirales)南方菜豆一品红花叶病毒科(solemo℃iridae)南方菜豆花叶病毒属(sobemo℃irus)

　　南方菜豆花叶病毒的其他信息见附录 A。

　　5 方法原理

　　南方菜豆花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。 根据南方菜豆花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(Double Antibody Sandwich

　　Enzyme Linked Immunosorbent Assay, DAS-ELISA);依据南方菜豆花叶病毒的基因组特征建立反转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification, RT-RPA) 和

　　荧光 RT-PCR检测方法;通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有南方菜豆花叶病毒。

　　6 试剂、仪器设备及用具

　　6 . 1 试剂

　　除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。

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　　DAS-ELISA试剂应符合附录 B 中的 B. 1 ;

　　RT-RPA试剂应符合附录 C 中的 C. 1 ;

　　荧光 RT-PCR试剂应符合附录 D 中的 D. 1 。

　　6 . 2 仪器设备

　　电子天平：感量 0 . 001 g。

　　高速冷冻离心机：最大转速 15 000 r/ min。

　　微型瞬时离心机：最大转速 7 000 r/ min。

　　普通冰箱：4 ℃ 。

　　超低温冰箱：-80 ℃ 。

　　制冰机：每日制冰能力为 110 kg。

　　旋涡振荡器：最大转速为 2 800 r/ min。

　　磁力搅拌器：搅拌容量 50 mL~2 000 mL。

　　高压灭菌锅：最大压力为 0 . 235 MPa,可调控温度范围为 105 ℃ ~135 ℃ 。

　　pH 计：量程 pH 0.00~14.00, 精度 ±0.01 pH。

　　紫外可见分光光度计：波长范围为 220 nm~750 nm,波长精度为 1 nm,分辨率为 3 nm。

　　金属浴：温度范围 4 ℃ ~150 ℃ , 控温精度 ±0 . 3 ℃ 。

　　荧光 PCR仪：温度范围 4 ℃ ~100 ℃ , 温度均一性 ±0.4 ℃。

　　微波炉：烧烤型。

　　电泳仪：输出电压 5 V~600 V,输出电流 2 mA~200 mA。

　　凝胶成像分析仪：光强连续可调 302 nm 紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV 干涉滤光片、机载头像捕捉软件、图像分析软件。

　　洗板机：清洗容量 50 μL~2 000 μL。

　　酶标仪：光源波长：250 nm~750 nm,温度范围 4 ℃ ~99 ℃。

　　6 . 3 用具

　　酶联板。

　　PCR管。

　　可调移液器(2.5 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1 000 μL)。

　　可调移液器头。

　　1 . 5 mL离心管。

　　研钵、微型磨杵等。

　　7 样品制备

　　7 . 1 植株制样

　　待测样品为植株小苗时，挑选有疑似症状的部位取样，症状描述信息见附录 A;未表现症状的植株分组(10 株为 1 组)编号，将采集的每组样品分成 3 份，作为待检样品。

　　7 . 2 种子样品直接制样

　　待检测样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小或有黑斑的种子;未表现症状种子分组(10 粒为 1 组)编号，研磨成粉末，分成 3 份;在粉末中加入样品抽提缓冲液(B. 1 . 5),充分浸泡后离心取上清液作为待检样品。

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　　7 . 3 种子样品种植制样

　　将种子播种于灭菌土中，待长出 3 片 ~4 片真叶后进行检测，取样制样同 7 . 1 。

　　8 检测鉴定

　　8 . 1 DAS-ELISA测定

　　把制备的样品上清液加入已包被南方菜豆花叶病毒抗体的酶联板中，进行 DAS-ELISA 检测。 每个样品平行加到两个孔中。 健康的植物组织作为阴性对照，感染南方菜豆花叶病毒的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。

　　具体操作按照附录 B规定的方法进行。

　　8 . 2 RT-RPA检测

　　RT-RPA检测阴性和阳性对照设置同 8 . 1,灭菌双蒸水(ddH 2 O)作为空白对照。 分别提取样品和对照的总 RNA后进行 RT-RPA检测，具体操作按照附录 C规定的方法进行。

　　8 . 3 荧光 RT-PCR检测

　　荧光 RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同 8 . 1,灭菌双蒸水(ddH 2 O)作为空白对照。 分别提取样品和对照的总 RNA后进行荧光 RT-PCR检测，具体操作按照附录 D规定的方法进行。

　　9 结果判定

　　DAS-ELISA、RT-RPA 和荧光 RT-PCR 中三种方法中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带南方菜豆花叶病毒。

　　10 结果记录与样品保存

　　10 . 1 结果记录

　　记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。 DAS-ELISA 检测应有酶联反应数值;RT-RPA检测应有电泳图片;荧光 RT-PCR检测应有扩增曲线图。

　　10 . 2 样品保存

　　阳性样品直接放于 -80 ℃冰箱或冷冻干燥后放于 -80 ℃冰箱，至少保存 1 年 。保存的样品要做好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。 保存期满后，应经灭活处理。

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　　附 录 A

　　(资料性)

　　南方菜豆花叶病毒其他信息

　　A.1 寄主范围

　　寄主范围窄。 除千 日 红(Gomphrena globosa)外，只有豆科植物是易感寄主。 能 自 然侵染菜豆(phaseolus℃ulgaris)、豇豆(vignaunguiculata)、黑吉豆(vignamungo)、绿豆(vignaradiata)、棉豆(phaseoluslunatus)和大豆(Glycinemax)等。

　　A.2 地理分布

　　中国、印度、伊朗、巴基斯坦、贝宁、科特迪瓦、加纳、摩洛哥、美国、尼 日利亚、塞内加尔、多哥、墨西哥、哥斯达黎加、尼加拉瓜、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉、法国、荷兰、西班牙等地。

　　A.3 症状

　　菜豆(phaseolus℃ulgaris)：B株系和 M 株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些不能系统侵染。 菜豆上的系统侵染根据寄主的不同变种，其症状有轻重。 轻者引起微弱花叶，重者造成严重花叶甚至新叶畸变。 G株系通常诱发无症状表现的系统侵染(见图 A. 1) 。

　　大豆(Glycinemax)：许多株系可引起较弱的系统斑驳。

　　棉豆(phaseoluslunatus)：B株系诱发产生小坏死斑。 其他株系不敏感。

　　绿豆(vignaradiata)：株系 G 引起局部小坏死斑，有些分离物引起系统花叶。

　　豇豆(vignaunguiculata)：株系 G在某些过敏品种引起局部枯斑。 系统症状表现为明脉、花叶和畸叶。

　　图 A.1 南方菜豆花叶病毒侵染菜豆(左)和大豆(右)引起的症状

　　A.4 传播途径

　　病毒可由叶甲传播;菜豆种传率为 1%~5%,豇豆种传率为 5%~40%;实验中易于机械接种传播。

　　A.5 粒体形态

　　病毒粒子为等轴对称的二十面体(T=3),无包膜，直径约为 30 nm,有 180 个蛋白亚基。

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　　A.6 抗原特性

　　南方菜豆花叶病毒抗原性强，容易制备高滴度的特异性抗体。

　　A.7 基因组

　　基因组为 ssRNA,全长约 4 136 nt,编码 4 个蛋白，分别编码 21 kDa蛋白、105 kDa蛋白(推测为聚合酶)、18 kDa蛋白和 30 kDa蛋白。病毒 RNA 的 3′端既无 Poly(A)也无类似 tRNA结构，其 5′端有一个 VPg,可能是侵染所必需的。

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　　附 录 B

　　(规范性)

　　双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)

　　B.1 试剂

　　B.1 . 1 包被抗体

　　特异性的南方菜豆花叶病毒抗体;宜使用商品化试剂盒抗体;4 ℃保存不超过 1 年;抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释。

　　B.1 . 2 酶标抗体

　　碱性磷酸酯酶标记的南方菜豆花叶病毒抗体。

　　B.1 . 3 底物

　　对硝基苯磷酸二钠(pNPP) 。

　　B.1 .4 1 ×PBST缓冲液(PH 7.4)

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 .5 样品抽提缓冲液(PH 7.4)

　　亚硫酸钠(Na2 SO3) 1.3 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP, MW24 000-40 000) 20.0 g

　　溶于 900 mL 的 1×PBST缓冲液中，并定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 .6 包被缓冲液(PH 9.6)

　　溶于 900 mL灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.1 . 7 酶标抗体稀释缓冲液(PH 7.4)

　　牛血清白蛋白(BSA) 2 . 0 g

　　聚乙烯基吡咯烷酮(PVP, MW24 000-40 000) 20.0 g

　　溶于 1 000 mL 1×PBST缓冲液中，4 ℃储存。

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　　B.1 .8 底物缓冲液(PH 9.8)

　　溶于 800 mL灭菌双蒸水，用浓盐酸(HCl)调 pH 至 9.8,定容至 1 000 mL, 4 ℃储存。

　　B.2 试验步骤

　　B.2 . 1 包被抗体

　　按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加 100 μL。 酶联板加盖或用保鲜膜包好，37 ℃孵育 2 h。 清空孔中溶液，用 1×PBST缓冲液加满各孔，3 min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。 再重复 2 次上述洗板过程。

　　B.2 . 2 样品制备与加样

　　按照 1 g待测样品，5 mL~10 mL抽提缓冲液的比例，将待测样品与抽提缓冲液混合，在研钵中研磨;3 000 r/min离心 5 min,上清液即为制备好的检测样品。 阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。 按 100 μL/孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好，4 ℃孵育过夜。 酶联板用水彻底冲洗，再用 1×PBST缓冲液洗涤 3 次，每次 3 min。

　　B.2 . 3 加酶标抗体

　　按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入酶联板中，100 μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好， 37 ℃孵育 4 h。 酶联板用水彻底冲洗，再用 1×PBST缓冲液洗涤 3 次，每次 3 min。

　　B.2 . 4 加底物

　　将底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)加入底物缓冲液中，使终浓度为 1 mg/mL(现配现用)，100 μL/孔加入酶联板中，室温避光孵育。

　　B.2 . 5 读数

　　在不同的时间内如 30 min、60 min、90 min、120 min或更长时间，用酶联仪在 405 nm处读 OD值。

　　B.3 结果判定

　　B.3 . 1 质量控制要求

　　对照孔的 OD405 值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405 值<0 . 15, 当阴性对照孔的 OD405 值 <0 . 05 时，按 0 . 05 计算;阳性对照 OD405 值/阴性对照 OD405 值 >5;同一样品的重复性基本一致。

　　B.3 . 2 结果判定

　　在满足 B. 3 . 1 的质量控制要求后，结果原则上可判断如下：样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值 >2,判为阳性;样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值为 2 时，判为可疑样品，需重做一次或用 RT-RPA 或荧光RT-PCR 验证;样品 OD405 值/阴性对照 OD405 值<2,判为阴性。

　　若不满足 B. 3 . 1 的质量控制要求，则不能进行结果判断。

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　　附 录 C (规范性)

　　RT-RPA检测

　　C.1 试剂

　　C.1 . 1 核酸提取及扩增试剂

　　核酸提取试剂为 Trizol或合格的 RNA提取试剂盒。

　　RT-RPA扩增试剂盒为 TwistAmp Basic RT Kits。

　　C.1 . 2 电泳缓冲液 TAE(50 × )

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

　　冰乙酸(C2 H4 O2) 57.1 mL

　　乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA ·2H2 O) 37.2 g

　　灭菌双蒸水定容至 1 000 mL,用时稀释至 1 × TAE。

　　C.2 检测步骤

　　C.2 . 1 核酸提取

　　称取 0 . 1 g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 1 . 5 mL离心管中，或将 7 . 2 制备的上清液 100 μL移入 1.5 mL离心管中;加入 1 mL 的 Trizol 试剂，剧烈震荡 3 min; 4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min;将上清液移入一新离心管中，加入 0.5 mL氯仿，猛烈震荡 15 s; 4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加入等体积异丙醇，混匀;室温静置 10 min; 4 ℃ 12 000 r/ min离心 10 min,弃上清;加入 1 mL 75%的冷乙醇洗涤沉淀;4 ℃ 10 000 r/min离心 10 min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于 30 μL 双蒸水中;使用分光光度计检测 RNA纯度，OD260/OD280 应在 1 . 8~2 . 1之间，-20 ℃保存备用。

　　注：此处以 0 . 1 g样品为例进行核酸提取，实际检测时如样品量有变化，加入的试剂可按比例调整;或者按照商品化RNA提取试剂盒进行操作。

　　C.2 . 2 引物序列

　　正向引物 F: 5′-TGGAAGCCCCGGCCACTCAATCGAGGAGGCCC-3′;

　　反向引物 R: 5′-ACTGTCACACCTCCAGCCGTTCTAAGCGATGGT-3′。

　　扩增片段长度约 169 bp。

　　C.2 . 3 RT-RPA扩增

　　向含有酶的反应管中分别加入2×反应缓冲液 29 . 5 μL,正向引物 F及反向引物 R(均为 10 μmol/L)各2 μL,醋酸镁(280 mmol/L) 2.5 μL,双蒸水 12 μL, RNA模板 2 μL;轻轻吸打混匀，放置于 40 ℃金属浴中反应 40 min。

　　注：本反应体系是针对 RT-RPA扩增试剂盒 TwistAmp Basic RT Kits(TABASRT01 Kit)给出的，给出这一商品化

　　试剂盒信息是为了方便本文件使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同效果，则可使用等效产品。

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　　C.2 . 4 产物检测

　　反应结束后向上述 RT-RPA扩增产物中加入 50 μL苯酚/氯仿(1 ∶ 1)溶液，充分混匀后 12 000 r/ min离心 2 min,取 5 μL上清液按比例与电泳上样缓冲液混匀，用 DNA Marker 作为分子量标记，在 1 . 5%的琼脂糖凝胶中进行电泳。 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 片段，并拍摄记录。

　　C.3 结果判定

　　如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期 169 bp 的片段，样品未出现预期大小的片段，判定样品为阴性。

　　如果阴性对照和空白对照未出现片段，阳性对照出现预期 169 bp 的片段，样品出现预期大小的片段，判定样品为南方菜豆花叶病毒。 可通过序列测定和 BLAST 分析对 PCR 产物进一步确认，确认为南方菜豆花叶病毒的序列相似性为 ≥95%。

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　　附 录 D (规范性)

　　荧光 RT-PCR

　　D.1 试剂

　　核酸提取试剂同 C. 1 . 1 。

　　D.2 引物探针

　　荧光 RT-PCR所用引物探针如表 D. 1 。

　　表 D.1 引物探针序列

　　D.3 核酸提取

　　方法同 C. 2 . 1 。

　　D.4 荧光 RT-PCR反应

　　荧光 RT-PCR反应体系及反应程序详见表 D. 2 。

　　表 D.2 荧光 RT-PCR反应体系及程序

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　　表 D.2 荧光 RT-PCR反应体系及程序(续)

　　D.5 结果判定

　　疑似分离物，阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性。

　　样品检测，阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，且 CT值≤35,判定为阳性;35

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　　参 考 文 献

　　[1] 魏霜，袁俊杰，李桂芬，等.南方菜豆花叶病毒 RT-RPA 检测方法的建立[J] . 植物检疫，2018 , 32(1) : 50-53 .

　　[2] 郭立新，段维军，徐亚飞，等.逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒[J] . 植物病理学报，2014,44(4) : 349-356 .